2025年高二（上）生物發(fā)酵工程實(shí)踐題一、傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用實(shí)踐（一）果酒與果醋的連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾骄拷湍妇c醋酸菌的協(xié)同作用及環(huán)境因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響材料與試劑：新鮮葡萄（或蘋果）、干酵母、醋酸菌制劑、蔗糖、無菌水、pH試紙、酒精計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、發(fā)酵瓶（帶單向排氣閥）、移液槍等。實(shí)驗(yàn)步驟：前期準(zhǔn)備：葡萄洗凈晾干后去除果梗，用榨汁機(jī)榨取果汁，測(cè)量初始糖度并調(diào)整至20%（添加蔗糖）。發(fā)酵瓶用70%酒精消毒，裝入果汁至2/3體積，按0.1%比例接種干酵母，28℃恒溫靜置發(fā)酵。果酒發(fā)酵階段：每天記錄發(fā)酵液溫度、pH值及產(chǎn)氣情況，第3天取樣測(cè)定酒精濃度。當(dāng)酒精濃度穩(wěn)定在10%-12%且不再產(chǎn)生氣泡時(shí)，過濾去除果渣，得到果酒。果醋發(fā)酵階段：取500mL果酒，接種10%醋酸菌液，30℃條件下通入無菌空氣（通氣量0.5L/min），攪拌速率150r/min。每24小時(shí)取樣測(cè)定醋酸含量，當(dāng)pH降至2.8-3.5時(shí)停止發(fā)酵。結(jié)果分析：繪制“發(fā)酵時(shí)間-酒精濃度-醋酸濃度”曲線，解釋果酒發(fā)酵后期pH下降的原因（提示：CO?溶解及有機(jī)酸積累）。對(duì)比敞口發(fā)酵與密閉發(fā)酵的醋酸產(chǎn)量差異，說明醋酸菌的代謝類型。（二）泡菜中亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸可抑制亞硝酸鹽還原菌活性，通過光電比色法測(cè)定亞硝酸鹽含量變化。操作要點(diǎn)：配制5%、10%、15%三個(gè)食鹽濃度梯度的泡菜鹽水，每組加入等量白菜、蘿卜及香辛料。發(fā)酵第1、3、5、7、10天取樣，用對(duì)氨基苯磺酸和N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽顯色后，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。結(jié)果要求：繪制不同鹽濃度下亞硝酸鹽含量的變化曲線，分析“亞硝酸鹽峰值”出現(xiàn)的時(shí)間差異及安全食用窗口（提示：一般在發(fā)酵第10天后亞硝酸鹽含量低于4mg/kg）。二、微生物培養(yǎng)技術(shù)實(shí)踐（一）土壤中纖維素分解菌的分離與篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇培養(yǎng)基制備：以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為唯一碳源，添加KH?PO?、MgSO?及瓊脂，pH調(diào)至7.0。梯度稀釋涂布：取菜園土樣10g，用無菌水梯度稀釋至10??，取0.1mL涂布于選擇培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)48h。鑒別與純化：采用剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的單菌落，通過平板劃線法純化3次，鏡檢觀察菌體形態(tài)。數(shù)據(jù)記錄：|稀釋倍數(shù)|菌落數(shù)（個(gè)）|透明圈直徑/菌落直徑（D/d）|疑似目標(biāo)菌株編號(hào)||----------|--------------|-----------------------------|------------------||10??|280±15|1.2|C-1||10??|32±4|2.5|C-5|（二）高產(chǎn)蛋白酶菌株的誘變育種實(shí)驗(yàn)流程：出發(fā)菌株：從腐乳發(fā)酵物中分離的米曲霉（初始酶活120U/mL）。誘變處理：采用紫外線（20W，照射距離30cm）分別處理孢子懸液30s、60s、90s，稀釋后涂布于酪蛋白培養(yǎng)基。篩選指標(biāo)：測(cè)量菌落周圍水解圈直徑，計(jì)算酶活（U/mL）=（水解圈面積×菌落直徑）/培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)果討論：若60s照射組獲得一株酶活為380U/mL的突變株，計(jì)算其誘變效率及酶活提升倍數(shù)。推測(cè)連續(xù)誘變可能導(dǎo)致的遺傳效應(yīng)（提示：高產(chǎn)性狀不穩(wěn)定或出現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷型）。三、發(fā)酵工程綜合應(yīng)用（一）工業(yè)級(jí)谷氨酸發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)化案例分析：某工廠使用谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)谷氨酸，出現(xiàn)產(chǎn)量波動(dòng)問題，根據(jù)以下數(shù)據(jù)回答問題：發(fā)酵階段溫度（℃）pH值溶氧量（DO%）谷氨酸產(chǎn)量（g/L）對(duì)數(shù)期327.060-7015±2穩(wěn)定期347.5-8.030-4058±5衰亡期306.55042±3問題診斷：穩(wěn)定期溶氧量突然降至20%時(shí)，谷氨酸產(chǎn)量會(huì)______（填“上升”“下降”或“不變”），原因是______（提示：需氧呼吸受阻導(dǎo)致三羧酸循環(huán)中斷）。若發(fā)酵液pH持續(xù)低于7.0，可能積累的副產(chǎn)物是______（谷氨酰胺/N-乙酰谷氨酰胺）。工藝改進(jìn)：提出一種通過基因工程提高谷氨酸產(chǎn)量的方案（例如：敲除分解代謝阻遏相關(guān)基因）。說明計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)在發(fā)酵罐中的作用（如：DO/pH在線監(jiān)測(cè)與反饋調(diào)節(jié)）。（二）固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)酒精的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)：用海藻酸鈉包埋活化酵母，制備直徑3-5mm的凝膠珠，通過破碎法測(cè)定包埋率（公式：包埋率=（投入細(xì)胞數(shù)-游離細(xì)胞數(shù)）/投入細(xì)胞數(shù)×100%）。對(duì)比游離酵母與固定化酵母在5%葡萄糖溶液中的發(fā)酵速率，分析固定化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)（重復(fù)使用性、產(chǎn)物分離效率等）。四、實(shí)驗(yàn)拓展與安全規(guī)范無菌操作考核：演示高壓蒸汽滅菌（121℃，30min）的正確流程，說明滅菌后培養(yǎng)基需冷卻至50℃左右再倒平板的原因。解釋“灼燒接種環(huán)后需冷卻再劃線”的操作目的（防止?fàn)C死目標(biāo)菌）。倫理與安全：討論工業(yè)發(fā)酵中使用基因工程菌株的潛在風(fēng)險(xiǎn)，舉例說明生物安全防護(hù)措施（如：封閉式發(fā)酵系統(tǒng)、廢棄物滅活處理）。注意事項(xiàng)：傳統(tǒng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格控制雜菌污染，若泡菜出現(xiàn)霉斑或異味應(yīng)立即丟棄。微生物培養(yǎng)后需經(jīng)1