前言1.1前言多西環(huán)素(Doxycycline)作為一種四環(huán)素類抗生素，分子式為C22H24N2O8，是由CharlieStephens等通過對(duì)土霉素的C6位進(jìn)行鹵代和脫水以及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾合成的，于1967年被FDA批準(zhǔn)使用ADDINNE.Ref.{04A8232B-8DA3-4E09-AA66-D87A7B29398C}（夏夢(mèng)偉等，2023）。多西環(huán)素抗菌譜與土霉素相似，為廣譜抗生素，體內(nèi)、外抗菌活性較土霉素、四環(huán)素強(qiáng)，為四環(huán)素的2~4倍，較其他四環(huán)素類藥物，脂溶性高，組織滲透性好，生物利用度高，對(duì)多種細(xì)菌有較好的抑菌效果ADDINNE.Ref.{9027CA7A-0FBC-43F6-B9FF-E5DB41B88F93}（翟克影，2007）。多西環(huán)素具有氫化駢四苯的基本母核，能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。通過可逆性地與核糖體30S亞基相結(jié)合，干擾tRNA與mRNA-核糖體的結(jié)合，導(dǎo)致肽鏈的延長(zhǎng)受到了抑制，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成ADDINNE.Ref.{7E368ED4-4865-47B8-B6ED-815699F755BB}（張青，2022）。不僅對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和支原體有活性，甚至對(duì)立克次體和衣原體之類的微生物也有活性，具有抗菌譜廣和抗菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在集約化養(yǎng)殖過程中，鹽酸多西環(huán)素的主要給藥途徑為混飲給藥，將可溶性粉直接溶于水飲用或配成高濃度原液進(jìn)行稀釋使用。目前，多西環(huán)素臨床上多有應(yīng)用，應(yīng)用于人醫(yī)不僅可治療細(xì)菌性感染，還可治療惡性腫瘤、心腦血管疾病、消化系統(tǒng)疾病等，如前列腺癌、玫瑰痤瘡、肺炎支原體肺炎ADDINNE.Ref.{875D3E4E-69F9-4B47-9A56-B936968CE4FC}（張黃成昊等，2023）；應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物可治療細(xì)菌性敗血癥ADDINNE.Ref.{0ECC1A30-491E-4DDF-B30F-ED1EC1174A92}（王西耀等，2018）；應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)行業(yè)則可治療于豬、禽、羊、犬等多種動(dòng)物疾病的治療，尤其應(yīng)用于禽的疾病，可防治畜禽的支原體病、大腸桿菌病、沙門氏菌病、巴氏桿菌病、布氏桿菌病、鸚鵡熱以及急性呼吸道感染，能有效治療禽霍亂和雞白痢ADDINNE.Ref.{BFA50923-0F67-4E4D-8730-0F0C4E6E789D}（袁延文等，2006）。1.2國內(nèi)外研究進(jìn)展多西環(huán)素的藥動(dòng)學(xué)在國內(nèi)外均有一定研究。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，多西環(huán)素經(jīng)口給藥后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)存在一定的物種差異。魏麗娟等ADDINNE.Ref.{F7B68699-68A6-4F53-AFA6-2EF3660DA34F}（2017）研究豬口服10mg/kg劑量多西環(huán)素后消除半衰期t1/2為11.65±4.80h，達(dá)峰時(shí)間tmax為4.13±1.89h，峰濃度Cmax為0.87±0.48μg/mL，藥時(shí)曲線下面積AUClast為11.07±4.19μg·h·mL，生物利用度F為33.20%。符華林等ADDINNE.Ref.{F6579B97-AEC3-420F-94DB-3955DF924625}（2011）研究家兔口服20mg/kg劑量多西環(huán)素后t1/2為2.19±0.38h，tmax為3.00±0.00h，Cmax分別為1.74±0.00mg/L，AUC0-t為11.71±0.17mg.L-1.h。張雪等ADDINNE.Ref.{984DF9A2-66B1-484B-9523-418BEC9F57B1}（2020）研究大鼠口服25mg/kg多西環(huán)素后t1/2為7.80±0.70h，tmax為0.08±0.00h，Cmax為1.75±328.00ng·mL-1，AUCINF為9.60±1047.20h·ng/L。除此之外，在同一種動(dòng)物體內(nèi)，不同給藥途徑藥動(dòng)學(xué)參數(shù)也不同。趙振升等ADDINNE.Ref.{66C7CD0E-8DA2-44B0-89ED-E2B5EE6ADEE9}（2015）研究麻鴨單次灌胃和肌肉注射20mg/kg多西環(huán)素后，Cmax分別為11.32±3.46mg/L和19.70±2.79mg/L，tmax分別為2.51±0.23h和1.56±0.09h，F(xiàn)分別為39.44%和77.67%。王金花ADDINNE.Ref.{F40A8402-A0FB-443F-BCCC-1DA37ADF33B0}（2007）研究以2.5mg/kg劑量肌肉注射多西環(huán)素藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為t1／2為9.53±0.95h，AUC為44.41±4.12μg·h／mL，Cmax為2.81±0.13μg／mL，tmax為1.91±0.21h，與魏麗娟ADDINNE.Ref.{24853A16-20AD-42AD-9CC6-BD9A5C0C5CAA}（2017）研究的口服給藥有較大差異。1.3研究目的及意義鹽酸多西環(huán)素溶液具有給藥方便、穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽的養(yǎng)殖過程治療各種疾病，在臨床上能夠有效治療針對(duì)多殺性巴氏桿菌引起的禽呼吸道疾病。將鹽酸多西環(huán)素溶液應(yīng)用于治療感染多殺性巴氏桿菌的肉雞可顯著降低死亡率，減緩臨床癥狀A(yù)DDINNE.Ref.{EC0B44F6-446A-4310-9B1A-A73273FF0152}（單奇和楊帆，2009）。研究鹽酸多西環(huán)素溶液的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)能夠探究該制劑在雞體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程，為治療禽多殺性巴氏桿菌病提供科學(xué)參考，為臨床給藥提供必要指導(dǎo)。本研究通過進(jìn)行單次灌服鹽酸多西環(huán)素溶液在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，研究了鹽酸多西環(huán)素溶液在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征；同時(shí)為獲取該制劑的口服生物利用度，進(jìn)行了靜脈注射鹽酸多西環(huán)素的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。本試驗(yàn)通過研究鹽酸多西環(huán)素溶液在雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度，客觀、科學(xué)地了解該鹽酸多西環(huán)素溶液在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，為該鹽酸多西環(huán)素溶液在臨床上的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。2材料與方法2.1材料2.1.1試劑與藥品2.1.1.1試驗(yàn)用藥名稱：鹽酸多西環(huán)素溶液規(guī)格：100mL/瓶含量：300mg/mL（以多西環(huán)素計(jì)）批號(hào)：202206001生產(chǎn)日期：2022年6月13日有效期：暫定24個(gè)月給藥方式：混飲，雞10~20mg/kg.b.w./d（以多西環(huán)素計(jì)）。儲(chǔ)存條件：陰涼、遮光、密封保存2.1.1.2對(duì)照品1中文名稱：鹽酸多西環(huán)素縮寫：DOX含量：83.6%性狀：黃色粉末批號(hào)：130485-202104保存條件：避光，2-8℃保存開封后保存條件：密封、低溫、避光保存有效期至：國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不設(shè)具體有效期，按照規(guī)定條件保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在中國食品藥品檢定院發(fā)布停用通知前有效。生產(chǎn)單位：中國食品藥品檢定研究院2.1.1.3對(duì)照品2中文名稱：美他環(huán)素縮寫：Met含量：88.5%性狀：黃色粉末批號(hào)：130499-200802保存條件：5℃以下避光保存開封后保存條件：置密封、低溫、避光處保存有效期：國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不設(shè)具體有效期，按照規(guī)定條件保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在中國食品藥品檢定院發(fā)布停用通知前有效。生產(chǎn)單位：中國食品藥品檢定研究院2.1.1.2其他試劑乙腈：縮寫：ACN含量：99.95%性狀：無色透明液體，有刺激性氣味批號(hào)：F24O1H202保存條件：常溫、避光保存開封后保存條件：置密封、常溫、避光、通風(fēng)處保存生產(chǎn)單位：Fisherchemical鹽酸：（1）縮寫：HCL（2）含量：36%-38%（3）性狀：無色透明，有刺激性氣味（4）批號(hào)：UNNO.1789CNNO.2501（5）保存條件：常溫、干燥、通風(fēng)處保存（6）開封保存條件：置密封、常溫、干燥、通風(fēng)處保存。2.1.2儀器與設(shè)備高效液相色譜儀：型號(hào)SHIMADZULC-20AT，日本島津公司；臺(tái)式高速離心機(jī)：型號(hào)MultifugeX1R，德國Thermo公司；電子分析天平：型號(hào)AT-261，瑞士Mettler公司；超純水機(jī)：型號(hào)KNSY1154，成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備；Research型可調(diào)微量移液器：1～10μL、10～200μL、100～1000μL，德國eppendorf公司；全自動(dòng)氮?dú)鉂饪s儀：型號(hào):MPEvaDM36，睿萊博儀器(廣州)有限公司。2.1.3溶液配制2.1.3.1流動(dòng)相配制A相（醋酸鹽緩沖液）：稱取19.27g醋酸銨溶解于1000mL超純水中，即得0.25mol/L醋酸銨溶液，待用。另稱取3.72g醋酸銨溶解于1000mL超純水中，即得0.1mol/L乙二胺四乙醋酸二鈉溶液，待用。將上述0.25mol/L醋酸銨溶液、0.1mol/L乙二胺四乙醋酸二鈉溶液和三乙胺按100:10:1混勻，用乙酸或氨水調(diào)節(jié)pH約為8.8，過濾后，超聲脫氣至少15分鐘待用。B相（乙腈）：取1000mL乙腈，超聲脫氣至少15分鐘待用。強(qiáng)洗針液（乙腈-甲醇-異丙醇-水（25：25：25：25，v/v/v/v））：取250mL乙腈、250mL甲醇、250mL異丙醇、250mL超純水，混勻后超聲脫氣至少15分鐘待用。0.01mol/L鹽酸：精密量取0.848mL濃鹽酸于適量超純水中，定容至1000mL即得。2.1.3.2儲(chǔ)備液及工作液配制多西環(huán)素對(duì)照品儲(chǔ)備液A（StockA）：精密稱取對(duì)照品約20.00mg（±10%），轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，以甲醇溶解后定容至刻度，配制成多西環(huán)素濃度約為2.0mg/mL（濃度=質(zhì)量×含量/體積）的對(duì)照品儲(chǔ)備液A（StockA），用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備。多西環(huán)素對(duì)照品儲(chǔ)備液B（StockB）：與StockA同法配制，用于質(zhì)控樣品的制備。美他環(huán)素對(duì)照品儲(chǔ)備液C（StockC）：精密稱取對(duì)照品約20.00mg（±10%），轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，以甲醇溶解后定容至刻度，配制成美他環(huán)素濃度約為2.0mg/mL（濃度=質(zhì)量×含量/體積）的對(duì)照品儲(chǔ)備液C（StockC），用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備。美他環(huán)素對(duì)照品儲(chǔ)備液D（StockD）：與StockC同法配制，用于質(zhì)控樣品的制備。多西環(huán)素對(duì)照品工作液A（WS-A）：精密吸取儲(chǔ)備液適量于離心管中，用乙腈稀釋成500.0μg/mL，再將500.0μg/mL工作液依次稀釋成濃度為10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、300.0、400.0μg/mL的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。多西環(huán)素對(duì)照品工作液B（WS-B）：精密吸取儲(chǔ)備液適量于離心管中，用乙腈稀釋成500.0μg/mL，將500.0μg/mL工作液依次稀釋成濃度為4.0、10.0、30.0、160.0、320.0μg/mL的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。美他環(huán)素對(duì)照品工作液C（WS-C）：精密吸取儲(chǔ)備液適量于離心管中，用乙腈稀釋成500.0μg/mL，再將500.0μg/mL工作液稀釋成濃度為5.0和100μg/mL的美他環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。美他環(huán)素對(duì)照品工作液D（WS-D）：精密吸取儲(chǔ)備液適量于離心管中，用乙腈稀釋成500.0μg/mL，再將500.0μg/mL工作液稀釋成濃度為5.0和100μg/mL的美他環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.2方法本課題按照系列步驟開展研究。藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用平行、隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，動(dòng)物飼養(yǎng)管理、動(dòng)物生理狀態(tài)、動(dòng)物數(shù)量、采血點(diǎn)設(shè)計(jì)、樣品檢測(cè)及復(fù)測(cè)、數(shù)據(jù)處理等均滿足《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》要求。給藥及采血：在既定試驗(yàn)試驗(yàn)方案的指導(dǎo)下，口服組經(jīng)一次性無菌注射器注入雞嗉囊中，靜注組經(jīng)一次性無菌注射器注入頸靜脈，按照試驗(yàn)計(jì)劃于雞翅下靜脈采集全血。血漿樣品前處理：提取、高速離心、提取上清、氮吹、復(fù)溶、過濾等系列步驟進(jìn)行前處理。血漿樣品測(cè)定：SHIMADZULC-20AT（日本島津公司）進(jìn)行檢測(cè)。血漿樣品復(fù)測(cè)：血漿樣品測(cè)定后，在一定的原則下進(jìn)行復(fù)測(cè)。數(shù)據(jù)分析及處理：通過擬合藥動(dòng)學(xué)模型，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，研究鹽酸多西環(huán)素經(jīng)口給藥藥動(dòng)學(xué)特征及生物利用度。2.2.1動(dòng)物及分組2.2.1.1試驗(yàn)動(dòng)物（1）種類：麻黃肉雞（2）級(jí)別、數(shù)量：普通級(jí)，≥24只（3）性別、日齡：雌性；60日齡（4）體重：體重相近，2.100±0.200kg。2.2.1.2試驗(yàn)動(dòng)物分組本試驗(yàn)按《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》標(biāo)準(zhǔn)開展，隨機(jī)將24只肉雞隨機(jī)均分為2組，分別為口服組與靜注組，腳標(biāo)和雞籠使用相同編號(hào)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行辨別，且每只動(dòng)物編號(hào)具有唯一性。

表1動(dòng)物分組及編號(hào)組別/體重雞編號(hào)口服組123456789101112體重/kg2.2372.0542.2892.2922.1002.0302.2302.0622.0302.3082.2302.150靜注組123456789101112體重/kg2.2502.2632.3602.1102.3482.1852.0802.2632.1252.3902.2542.1102.2.1.3受試動(dòng)物飼養(yǎng)管理按照試驗(yàn)動(dòng)物中心的管理規(guī)范飼養(yǎng)，溫度、濕度及光照可滿足肉雞的正常生長(zhǎng)要求，試驗(yàn)雞只日齡與體重相符且生長(zhǎng)狀況良好。在試驗(yàn)期間所有入選的受試動(dòng)物將依據(jù)現(xiàn)有條件和飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)人員對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行日常的健康狀況檢查。試驗(yàn)全程飼喂不含任何抗生素的全價(jià)飼料，剔除非健康及死亡的雞只，飼養(yǎng)按照試驗(yàn)動(dòng)物中心的管理規(guī)范進(jìn)行。2.2.2給藥及試驗(yàn)計(jì)劃（1）給藥前禁食分組結(jié)束后，在給藥前12h實(shí)行禁食，在給藥后4h實(shí)行禁食，僅自由飲水，以試驗(yàn)藥物的推薦劑量進(jìn)行單次經(jīng)口灌服。（2）給藥劑量及方式給藥量的計(jì)算如下：每只雞鹽酸多西環(huán)素溶液給藥量（g）=注：所選批次鹽酸多西環(huán)素溶液密度ρ為1.123g/cm3表2試驗(yàn)組別與給藥處理組別動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量（以多西環(huán)素計(jì)）給藥方式口服組1220mg/kg.b.w頸靜脈注射給藥灌胃組1220mg/kg.b.w經(jīng)口灌胃給藥表3給藥劑量組別/劑量雞編號(hào)口服組123456789101112給藥劑量/g0.1680.1540.1710.1720.1570.1520.1670.1540.1520.1730.1670.161靜注組123456789101112給藥劑量/g0.4500.4530.4720.4220.4700.4370.4060.4530.4250.4780.4510.422（3）動(dòng)物試驗(yàn)開展計(jì)劃每天均開展相同試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量的口服組試驗(yàn)和靜注組試驗(yàn)，直至試驗(yàn)動(dòng)物都已經(jīng)過試驗(yàn)。在開展試驗(yàn)前，進(jìn)行6天檢疫隔離，觀察該批試驗(yàn)雞是否出現(xiàn)異常，排除其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。在試驗(yàn)開展過程，按照每天3只動(dòng)物為一批，每天給藥一批，每批采血時(shí)間2天的計(jì)劃開展，預(yù)計(jì)8天完成給藥，9天完成全部雞的采血。表4動(dòng)物試驗(yàn)開展計(jì)劃?rùn)z疫隔離期給藥時(shí)間每天動(dòng)物數(shù)（只）組別動(dòng)物編號(hào)采樣時(shí)間D-6~D0D13口服組01-03D1~D2D2304-06D2~D3D3307-09D3~D4D4310-12D4~D5D53靜注組01-03D5~D6D6304-06D6~D7D7307-09D7~D8D8310-12D8~D92.2.3血樣采集采血部位：雞的翅下靜脈。采血方式：?jiǎn)未尾裳?，在設(shè)定的采血時(shí)間用一次性靜脈采血針進(jìn)行采血，采血結(jié)束記錄具體采血時(shí)間。每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的采血量：1.5~2.0mL。給藥前采集空白血樣，口服組給藥后分別于30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、16h、24h、30h采集全血樣品，靜注組給藥后于5min、10min、15min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、16h、24h、30h采集全血樣品，全血樣品存于肝素鈉抗凝管中置于冰盒內(nèi)避光保存，并在2h內(nèi)在4000r/min，4℃條件下離心10min，取上層血漿一分為二，一份作為留樣，另一份作為檢樣，置于-20℃冰箱保存，待測(cè)。本試驗(yàn)采樣點(diǎn)按照《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》的標(biāo)準(zhǔn)，采樣時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)滿足“吸收相不少于3個(gè)點(diǎn)，血藥峰濃度（Cmax）附近至少要3個(gè)點(diǎn)，消除相4~6個(gè)點(diǎn)；采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3~5個(gè)半衰期（t1/2）或Cmax的1/20~1/10，以滿足AUC0-t/AUC0-∞”的血樣采集要求。2.2.4樣品檢測(cè)分析2.2.4.1色譜條件（1）色譜條件高效液相色譜系統(tǒng)：SHIMADZULC-20AT（日本島津公司）。色譜柱：WatersXBrigeC18，5μm，4.6×250mm（WatersCorporation）。流動(dòng)相：A相：醋酸鹽緩沖液；B相：乙腈（83.5:16.5）。強(qiáng)洗針液：乙腈-甲醇-異丙醇-水（25：25：25：25，v/v/v/v）。柱溫：35℃。流速：1mL/min。進(jìn)樣量：20μL。運(yùn)行時(shí)間：18.0min。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：25℃。（2）定量處理方法工作站：Labsolution定量方法：內(nèi)標(biāo)法定量指標(biāo)：目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比2.2.4.2雞血漿樣品前處理所有樣品需要完全解凍（如為凍存樣品）并混勻后才進(jìn)行取樣，血漿樣品經(jīng)下述方法進(jìn)行前處理后，按“2.2.4.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。（1）準(zhǔn)確吸取400μL待測(cè)樣品至2mL離心管內(nèi)。。（2）準(zhǔn)確吸取10μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液至待測(cè)樣品中。（3）輕微渦旋混合均勻后，加入790μL乙腈，渦旋1min，4℃條件下12000rpm離心10min。（4）吸取上清液，于40℃水浴氮?dú)猸h(huán)境中吹干。（5）準(zhǔn)確吸取200μL的0.01mol/L鹽酸復(fù)溶，渦旋3min，4℃條件下12000rpm離心10min。（6）取離心后上清液，過0.22μmPTFE濾膜，待高效液相色譜進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積為20μL。按雞只編號(hào)由小到大，按采血點(diǎn)00-15依次測(cè)定試驗(yàn)雞只的血藥濃度。2.2.5血藥濃度測(cè)定質(zhì)量控制按照表5方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液與質(zhì)控樣品進(jìn)行配制。本試驗(yàn)每個(gè)分析批均使用7個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)在分析批中均勻分散地插入多西環(huán)素添加濃度0.75μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，內(nèi)標(biāo)美他環(huán)素添加濃度均為2.5μg/mL，每個(gè)濃度兩個(gè)平行的質(zhì)控樣品。本試驗(yàn)中每個(gè)分析批共檢測(cè)6只試驗(yàn)雞共96個(gè)正式樣品。

表5標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液與質(zhì)控樣品配制樣品名稱空白樣品體積uL多西環(huán)素濃度ug/mL添加多西環(huán)素體積uL多西環(huán)素添加濃度ug/mL美他環(huán)素濃度ug/mL添加美他環(huán)素體積uL美他環(huán)素添加濃度ug/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制1380.0010.0010.000.25100.0010.002.502380.0020.0010.000.50100.0010.002.503380.0040.0010.001.00100.0010.002.504380.00100.0010.002.50100.0010.002.505380.00200.0010.005.00100.0010.002.506380.00300.0010.007.50100.0010.002.507380.00400.0010.0010.00100.0010.002.50質(zhì)控樣品配制低濃度380.0030.0010.000.75100.0010.002.50中濃度380.00160.0010.004.00100.0010.002.50高濃度380.00320.0010.008.00100.0010.002.50標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：取380uL空白血漿加入由一定梯度濃度多西環(huán)素及相同濃度內(nèi)標(biāo)美他環(huán)素工作液各10uL。質(zhì)控樣品：取380uL空白血漿加入低、中、高濃度多西環(huán)素溶液及相同濃度內(nèi)標(biāo)美他環(huán)素工作液各10uL?？瞻讟悠罚喝?80uL空白血漿加入20uL提取液，待用。取樣后輕微渦旋混合均勻后，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品及空白樣品加入800μL乙腈，后按“2.2.4.2”條件進(jìn)行前處理；待測(cè)樣品按“2.2.4.2”條件進(jìn)行前處理，待高效液相色譜進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積為20μL。2.2.6血樣復(fù)測(cè)在全部樣品測(cè)定結(jié)束后，按照以下原則使用留樣進(jìn)行復(fù)測(cè)：①若某分析批出現(xiàn)校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品不達(dá)標(biāo)，或在該分析批空白樣品中檢測(cè)出多西環(huán)素色譜峰，且信噪比大于3的現(xiàn)象，則重新測(cè)定該分析批所有樣品；②若出現(xiàn)某一個(gè)正式樣品內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值與該分析批內(nèi)校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值存在顯著差異，則重新處理該正式樣品所屬試驗(yàn)雞只的所有樣品；③若某分析批中，某試驗(yàn)雞只30%以上正式樣品的實(shí)測(cè)值高于定量上限，則增加稀釋倍數(shù)對(duì)高于定量上限的樣品進(jìn)行稀釋，且該試驗(yàn)雞只全部樣品按順序全部重新檢測(cè)，并需對(duì)所增加的稀釋倍數(shù)進(jìn)行方法學(xué)稀釋效應(yīng)部分驗(yàn)證；④若連續(xù)兩個(gè)分析批中半數(shù)以上試驗(yàn)雞只樣品出現(xiàn)③所述情況，若大部分超出標(biāo)曲上限的正式樣品實(shí)測(cè)值小于定量限2個(gè)數(shù)量級(jí)，則通過延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，增加適當(dāng)濃度的高濃度校正標(biāo)樣，用新范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)后續(xù)其余分析批進(jìn)行定量，并對(duì)此前存在超出原標(biāo)曲范圍的試驗(yàn)雞只全部樣品重新檢測(cè)。且需對(duì)增加的濃度點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線及儀器殘留部分方法學(xué)驗(yàn)證；⑤若④中所述大部分超出原標(biāo)曲上限的正式樣品實(shí)測(cè)值大于定量限2個(gè)數(shù)量級(jí)，則按③所述方法進(jìn)行稀釋，并按實(shí)際情況結(jié)合③與④的方法進(jìn)行復(fù)測(cè)。⑥若正式樣品檢測(cè)過程中儀器出現(xiàn)維修或異常情況，導(dǎo)致色譜峰峰形異常或響應(yīng)值異常，則需重新進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并重新測(cè)定所有樣品。2.2.7數(shù)據(jù)分析將所得血藥濃度與相應(yīng)采血時(shí)間的有效數(shù)據(jù)，使用藥動(dòng)學(xué)軟件PhoenixWinNonlin8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過非房室模型進(jìn)行藥-時(shí)曲線擬合，計(jì)算所需藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、tmax、AUC0-t、AUC0-∞；計(jì)算口服組與靜注組的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，即Cmax、AUC0－t、AUC0-∞，同時(shí)根據(jù)公式計(jì)算得到該鹽酸多西環(huán)素溶液經(jīng)口服給藥的生物利用度F。3結(jié)果將24只雞按“2.2.2”開展試驗(yàn)，采集血樣并于凍存的血漿樣品解凍后，進(jìn)行血漿樣品前處理與血藥濃度檢測(cè)，通過PhoenixWinNonlin8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，非房室模型進(jìn)行藥-時(shí)曲線擬合，計(jì)算所需藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見下表。表6口服組多西環(huán)素的濃度(ug/mL)采樣時(shí)間雞編號(hào)12345678910111230min1.2323.1541.6575.3411.3562.8583.5351.8142.3020.7281.7751.2621h2.0544.1442.3467.6781.9034.8764.7693.3734.4001.4582.6511.5821.5h2.5404.2502.4288.1673.1574.3704.8273.3826.7541.9943.2272.1342h3.0084.5992.6237.2543.3335.0534.9763.0498.8042.6723.9362.7043h3.5973.8172.8058.5523.6044.9463.5382.9979.6813.4853.5143.0954h2.6913.4192.2838.3222.6644.4793.2513.7416.9133.0043.3893.6975h3.2593.3522.0417.1882.5114.3372.8083.0055.6272.7462.5023.2596h2.7122.8971.6645.6622.3834.1002.0382.1324.5112.6721.8482.8048h1.6791.77000.973.8261.4142.8621.0591.3863.5421.5752.0401.97410h1.1641.2880.8832.8571.1351.8930.7120.7562.8840.9680.9521.32312h0.7070.6200.3902.0450.8631.0480.4500.4231.6590.5030.5240.74516h0.5310.3520.2831.2330.5260.740BLOQ0.2520.8370.2650.2580.28924hBLOQBLOQND0.421ND0.279NDBLOQ0.360BLOQBLOQBLOQ30hNDNDND0.263NDBLOQNDND0.282NDNDND采樣時(shí)間雞編號(hào)1234567891011125min59.36747.58548.07742.36947.28856.21652.58363.53453.70164.20962.14751.70110min35.03634.86440.71338.82831.63741.30836.93845.85439.20645.21643.31740.35515min24.48136.80029.31835.58730.92733.35030.90434.10836.83329.52130.81835.43130min18.78027.05821.62125.87820.75826.31226.35126.72228.64625.73420.12829.7341h11.68416.95515.42216.63112.04816.95417.74118.51722.40318.59117.97020.0281.5h10.3958.47514.46010.38210.8139.86710.27013.09615.88812.63210.87916.5912h9.9486.3617.7976.5025.8005.4367.38210.59212.44611.3228.53711.8413h6.3675.5676.8094.1534.4664.1295.4537.0388.1369.4676.9228.8654h6.4973.6384.5083.2014.6265.2344.0733.5434.6727.5654.6355.5325h4.6883.9743.7423.6593.4002.9113.2952.6713.3765.9193.6064.7886h3.7502.2302.9931.7722.6481.8532.7192.6042.5773.5513.5053.4058h3.5511.7142.5341.4492.2881.5361.7162.1051.9872.9722.5772.78710h2.9741.5671.2271.0581.3121.1791.1821.5901.6501.9001.7611.55312h1.9140.8890.9520.7890.5570.9690.8241.2341.0941.5520.8731.09216h1.5290.5510.6860.3760.2610.5040.5010.6520.5820.9420.5720.60324h0.6230.2880.316BLOQND0.378BLOQ0.341BLOQ0.4620.2680.25830h0.254NDNDNDNDNDNDNDNDBLOQNDND表7靜注組多西環(huán)素的濃度(ug/mL)注：BLOQ表示數(shù)據(jù)小于定量限，ND表示未檢測(cè)到藥物表8口服組與靜注組多西環(huán)素濃度平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差給藥時(shí)間濃度（ug/mL）X±S.D（n=12）口服組靜注組5min-55.057±7.92310min-39.939±4.41515min-32.859±3.20230min27.014±1.28924.824±3.0181h41.234±1.82616.851±2.8031.5h47.230±1.89711.968±2.5562h52.011±1.9648.697±2.4853h53.631±2.2486.707±1.7834h47.853±1.8165.067±1.1505h42.635±1.4874.179±0.8736h35.423±1.2053.413±0.8338h24.097±0.9272.818±0.53910h16.815±0.7542.321±0.27012h9.977±0.5211.964±0.25416h5.566±0.3162.321±0.27024h1.060±0.0711.964±0.25430h0.545±0.0131.865±0.168圖1口服組多西環(huán)素給藥后在雞血漿中的藥-時(shí)曲線圖2靜注組多西環(huán)素給藥后在雞血漿中的藥-時(shí)曲線表9口服組多西環(huán)素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)參數(shù)單位雞只編號(hào)123456789101112Kel1/h0.1740.2140.1860.1420.1250.1120.2140.2320.1300.2280.2080.244t1/2h3.993.243.734.885.566.193.242.995.353.043.342.84tmaxh3.002.003.003.003.002.002.004.003.003.002.004.00Cmaxug/mL3.5974.5992.8058.5523.6045.0534.9763.7419.6813.4853.9363.697AUC0－th·ug/mL27.6532.8420.2570.5626.8047.9626.9425.5768.5424.4627.0328.18AUC0－∞h·ug/mL30.7134.4821.7779.2431.0250.4629.0526.6670.7125.6228.2729.37VmL375227094939177751683541321832392185342434062793ClmL/h651.2580.0918.6252.4644.8396.4688.5750.3282.8780.5707.5681.1MRTINFh7.465.876.387.578.348.064.895.638.056.305.946.48AUCall/AUC0-∞%90.0495.2393.0189.0486.4195.0692.7695.9296.9295.4695.6195.96表10靜注組多西環(huán)素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)參數(shù)單位雞只編號(hào)123456789101112Kel1/h0.1150.0920.0930.1690.2410.0930.1790.1180.1710.1010.0980.118t1/2h6.017.537.484.112.887.453.875.884.046.847.085.86tmaxh0.080.080.080.080.080.080.080.080.080.080.080.08Cmaxug/mL59.36747.58548.07742.36947.28856.21652.58363.53453.70164.20962.14751.701AUC0－th·ug/mL97.9273.5478.8764.5264.0872.1571.3285.7787.93101.7882.2495.58AUC0－∞h·ug/mL100.1276.6782.2866.7565.1676.2274.1188.6691.32106.3384.9797.76VmL173128332624177712742821150619151278185524041731CLmL/h199.8260.9243.1299.6306.9262.4269.9225.6219.0188.1235.4204.6MRTlasth6.083.734.012.753.013.652.883.732.914.323.813.65MRTINF_obsh6.805.005.283.393.295.313.584.673.615.584.794.30表11口服組和靜注組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差參數(shù)(單位)口服組X±S.D（n=12）靜注組Kel(1/h)0.18±0.05X±S.D（n=13）t1/2(h)4.03±1.160.13±0.05tmax(h)2.83±0.725.91±1.67Cmax(ug/mL)4.81±2.130.08±0.00AUC0－t(h·ug/mL)35.56±17.2555.05±7.70AUC0－∞(h·ug/mL)38.11±18.6781.15±12.23V(mL)3346.00±983.0084.04±12.57Cl(mL/h)611.20±202.002037.00±574.00MRTINF(h)6.75±1.11-AUCall/AUC0-∞(%)93.45±0.03-MRTlast(h)-3.69±0.86MRTINF_obs(h)-4.63±1.01按照《獸用化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》的要求對(duì)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算與分析，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有Ka，tmax，Cmax，AUC，V，Kel，t1/2，MRT和Cl。根據(jù)圖1口服組及圖2靜注組多西環(huán)素在雞血漿中的藥時(shí)曲線可見，多西環(huán)素半對(duì)數(shù)藥時(shí)曲線房室特征不明確，利用Winnonlin8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過非房室模型進(jìn)行藥-時(shí)曲線擬合，計(jì)算所需藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可得表9和表10。麻黃肉雞靜脈注射鹽酸多西環(huán)素溶液后，kel為0.13±0.05、t1/2為5.91±1.67h，Cl為242.96±36.52mL/h，Cmax為55.05±7.70ug/mL，tmax為0.08±0.00h，AUC為84.04±12.57h·ug/mL，MRT為3.69±0.86h，V為2037.00±574.00mL。麻黃肉雞經(jīng)口灌胃鹽酸多西環(huán)素溶液后，Kel為0.18±0.05，t1/2為4.03±1.16h，Cl為611.20±202.00mL/h，Cmax為4.81±2.13ug/mL，tmax為2.83±0.72h，AUC為38.11±18.67h·ug/mL，MRT為6.75±1.11h，V為3346.00±983.00mL，AUCall/AUC0-∞為93.45±0.03%。4討論4.1.試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)多西環(huán)素用于治療由多殺性巴氏桿菌引起的感染性疾病，鹽酸多西環(huán)素溶液能夠有效治療針對(duì)多殺性巴氏桿菌引起的禽呼吸道疾病。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，巴氏桿菌感染雞日齡較大（60-90日齡），而普通肉雞出欄日齡較?。?0-60日齡），其生長(zhǎng)狀態(tài)較快，生理狀態(tài)不穩(wěn)定，結(jié)合本試驗(yàn)以往研究數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)資料匯總，本研究選用出欄日齡較大的麻黃雞（60日齡）為本研究的試驗(yàn)動(dòng)物。4.2樣品前處理在樣品前處理過程中，發(fā)現(xiàn)血漿自然解凍狀態(tài)下形成膠凍樣固體，導(dǎo)致樣品無法完全分散，進(jìn)而提取不完全，降低檢測(cè)準(zhǔn)確度。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)血漿中存在冷球蛋白在4℃環(huán)境下快速沉淀，逐漸凝固成膠凍狀結(jié)構(gòu)ADDINNE.Ref.{3E196B0B-495C-4CC2-8E60-1253EFDCDC99}（尹春瓊等，2019）。因此，本研究通過在樣品解凍過程中持續(xù)渦旋代替自然室溫放置解凍措施解決此問題。4.3樣品復(fù)測(cè)樣品檢測(cè)分析過程中，出現(xiàn)多西環(huán)素濃度反跳現(xiàn)象，如口服組1號(hào)雞5h采血點(diǎn)、4號(hào)雞2h采血點(diǎn)與靜注組4號(hào)雞4h采血點(diǎn)、6號(hào)雞4h采血點(diǎn)等，經(jīng)樣品復(fù)測(cè)結(jié)果與第一次檢測(cè)結(jié)果一致，排除試驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果造成影響，可能與試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異、生理狀態(tài)差異或采血操作等人為因素有關(guān)。4.4多西環(huán)素在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究國內(nèi)外對(duì)多西環(huán)素在雞體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)有一定研究。程倍倍等ADDINNE.Ref.{A8105FF8-EA0B-4D53-9DC4-8315A9966876}（程倍倍，2017）研究發(fā)現(xiàn)麻雞口服20mg/kg多西環(huán)素后，多西環(huán)素在血漿中Cmax為2.88ug/mL，tmax為0.78h，藥時(shí)曲線下面積AUC0→∞為19.27ug·h/mL，t1/2β為6.36h；YangF等ADDINNE.Ref.{2E70914F-CE5A-4DA5-86F2-16B9556A5F88}（Yangetal.,2016）研究發(fā)現(xiàn)肉雞口服20mg/kg多西環(huán)素后，多西環(huán)素在血漿中的Cmax為5.65ug/mL，tmax為3.5h，AUC0→∞為94.19ug·h/mL，t1/2β為7.78h；YangF等ADDINNE.Ref.{29E8485A-2B58-4EA9-902E-BED72536518F}（Yangetal.,2016）人研究發(fā)現(xiàn)蛋雞靜注20mg/kg多西環(huán)素后，多西環(huán)素在血漿中的t1/2β為8.94h，AUC0→∞為197.17ug·h/mL；YangF等ADDINNE.Ref.{047D0FA5-8661-409F-B5DC-FAEF18EF3BF2}（Yangetal.,2016）研究發(fā)現(xiàn)蛋雞口服20mg/kg多西環(huán)素后，血漿中Cmax為5.88ug/mL，AUC0→∞為103.18ug·h/mL，tmax為1.73h。麻黃雞口服20mg/kg多西環(huán)素后，tmax為2.83h，Cmax為4.811ug/mL，說明多西環(huán)素能在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到相對(duì)較高的濃度?？诜M與靜注組t1/2分別為4.03h和5.91h，Cl分別為611.2mL/h和242.956mL，V分別為3346mL和2037mL，說明多西環(huán)素在雞體內(nèi)具有半衰期長(zhǎng)，分布廣，代謝快的特點(diǎn)，靜注與口服相比消除半衰期略長(zhǎng)，代謝更慢。麻黃雞靜注多西環(huán)素溶液后，t1/2為5.91h，該數(shù)據(jù)與豬的5.68hADDINNE.Ref.{4CC52D6B-C1E5-4814-B332-5841B6D980B9}（魏麗娟等，2017）接近，但稍高于山羊的4.39hADDINNE.Ref.{77FC001F-BEF7-4ED0-A52C-A5F7B1D0C94F}（Turketal.,2020），麻黃雞AUC為84.04ug·h/mL，略小于山羊的93.15ug·h/mLADDINNE.Ref.{FD1A67C3-2576-4A13-AFE2-884833C5F758}（Turketal.,2020），但遠(yuǎn)超豬的33.34ug·h/mLADDINNE.Ref.{65ACA5D1-5273-434A-A7A5-6A26EBFE6500}（魏麗娟等，2017），這一區(qū)別反映了多西環(huán)素在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征存在種屬差異。根據(jù)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，按照F=AUC血管外給藥/AUC靜脈給藥×100%可得，該鹽酸多西環(huán)素的經(jīng)口服灌胃給藥F為46.97%。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，多西環(huán)素口服給藥生物利用度不高，本研究獲得的生物利用度為46.97%，與蛋雞的52.33%ADDINNE.Ref.{C44E687D-CA7F-429C-8B74-A544E3ECE211}（Yangetal.,2016）和雛雞的41%ADDINNE.Ref.{05B35456-CC2C-40D4-A4A9-CDF305CAD757}（廖治鋒和段新華，2015）接近，略大于麻鴨的39.44%ADDINNE.Ref.{DE608FFA-8CEE-4C3E-818E-5069D3AA9B56}（趙振升等，2015），這可能與兩者的飲水量差別有關(guān)，雞的飲水量小，食物在消化道停留的時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)藥物的吸收程度略高ADDINNE.Ref.{C890E83E-C84B-4B23-A700-AEA4F5952B00}（趙振升等，2015）。除此之外，本研究獲得的多西環(huán)素Cm