2025屆高三生物單克隆抗體制備流程圖題一、單克隆抗體制備的核心原理單克隆抗體制備基于三大技術(shù)原理的融合：免疫原理：B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下可特異性識(shí)別抗原表位并分泌抗體，但體外培養(yǎng)時(shí)存活周期短（僅1-2周），無(wú)法持續(xù)增殖。細(xì)胞融合原理：利用物理（電融合）、化學(xué)（聚乙二醇，PEG）或生物（滅活仙臺(tái)病毒）方法，使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成兼具兩者特性的雜交瘤細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：通過(guò)體外培養(yǎng)或體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。雜交瘤細(xì)胞的核心優(yōu)勢(shì)在于雙重特性：既能像骨髓瘤細(xì)胞一樣無(wú)限增殖，又能像B淋巴細(xì)胞一樣合成并分泌單一特異性抗體。這一技術(shù)由Kohler和Milstein于1975年發(fā)明，因此獲得1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。二、完整制備流程及關(guān)鍵步驟解析（一）動(dòng)物免疫：獲取致敏B淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：通常選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠（遺傳背景均一，免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟），體重18-22g。免疫方案設(shè)計(jì)：基礎(chǔ)免疫：第1天腹腔注射抗原-弗氏完全佐劑乳化液（如每只小鼠注射10-50μg重組蛋白），佐劑可增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞的吞噬作用，延長(zhǎng)抗原作用時(shí)間。加強(qiáng)免疫：第14天、28天分別注射抗原-弗氏不完全佐劑乳化液，第42天直接腹腔注射抗原（無(wú)佐劑）進(jìn)行沖擊免疫，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞大量增殖并分化為漿細(xì)胞。效價(jià)檢測(cè)：免疫后第21天、35天尾靜脈采血，通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1:10000以上時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞融合。（二）細(xì)胞融合：構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞材料準(zhǔn)備：脾細(xì)胞懸液制備：頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取脾臟，研磨后過(guò)200目篩網(wǎng)，獲得含B淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液（每只小鼠可獲1×10?-2×10?個(gè)脾細(xì)胞）。骨髓瘤細(xì)胞：選用HGPRT?（次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型）骨髓瘤細(xì)胞株（如SP2/0），確保其在選擇培養(yǎng)基中無(wú)法存活。融合操作：按脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=5:1比例混合，1500rpm離心5分鐘，棄上清后輕彈管底使細(xì)胞沉淀松散。37℃水浴條件下，緩慢滴加50%PEG（分子量1000-4000）1mL，靜置1分鐘后，立即加入10mL無(wú)血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)，全程控制在2分鐘內(nèi)完成。關(guān)鍵注意事項(xiàng)：PEG濃度過(guò)高（>60%）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，過(guò)低（<30%）則融合效率下降；融合后需緩慢加入培養(yǎng)基，避免滲透壓驟變損傷細(xì)胞。（三）選擇性培養(yǎng)：HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)基成分：含次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）及胎牛血清。篩選原理：未融合骨髓瘤細(xì)胞：因缺乏HGPRT，無(wú)法利用補(bǔ)救途徑合成DNA，且氨基蝶呤阻斷從頭合成途徑，最終死亡。未融合B淋巴細(xì)胞：雖有HGPRT，但體外培養(yǎng)無(wú)法無(wú)限增殖，1-2周后自然凋亡。雜交瘤細(xì)胞：從B淋巴細(xì)胞獲得HGPRT基因，可通過(guò)補(bǔ)救途徑（H→IMP→AMP/GMP）合成DNA，同時(shí)保留骨髓瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力，因此在HAT培養(yǎng)基中存活并形成克隆。培養(yǎng)條件：置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱，每3-4天半量更換HAT培養(yǎng)基，持續(xù)2周后改用HT培養(yǎng)基（去除氨基蝶呤），避免氨基蝶呤對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期毒性。（四）兩次篩選：獲得特異性雜交瘤細(xì)胞第一次篩選（選擇性培養(yǎng)）：通過(guò)HAT培養(yǎng)基淘汰未融合細(xì)胞及自身融合細(xì)胞，獲得雜交瘤細(xì)胞混合群體（約第10-14天可見(jiàn)細(xì)胞克隆形成，每個(gè)克隆由單個(gè)雜交瘤細(xì)胞增殖而來(lái)）。第二次篩選（抗體檢測(cè)）：方法：采用有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞接種至96孔板（每孔0.5-1個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)7-10天后，取上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)。檢測(cè)技術(shù)：ELISA法：包被抗原后，與上清液孵育，通過(guò)酶標(biāo)二抗顯色判斷是否存在特異性抗體。Westernblot：驗(yàn)證抗體能否識(shí)別天然抗原的分子量大小，排除交叉反應(yīng)。目標(biāo)：篩選出能穩(wěn)定分泌目標(biāo)抗體的單克隆細(xì)胞株，確?？贵w與抗原結(jié)合的特異性（如僅識(shí)別新冠病毒S蛋白R(shí)BD區(qū)域）。（五）克隆化培養(yǎng)：確保抗體單一性通過(guò)有限稀釋法或軟瓊脂克隆法進(jìn)行2-3次亞克隆，直至所有子代細(xì)胞均能分泌相同抗體。具體操作：將陽(yáng)性孔細(xì)胞稀釋至每毫升含10個(gè)細(xì)胞，接種至96孔板，顯微鏡下標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，培養(yǎng)后再次檢測(cè)抗體陽(yáng)性率，確保克隆純度達(dá)100%。（六）抗體生產(chǎn)：體外培養(yǎng)與體內(nèi)誘生體外培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞接種至細(xì)胞工廠或懸浮培養(yǎng)瓶，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?條件下攪拌培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速50-80rpm）。培養(yǎng)體系需滿足：pH7.2-7.4（通過(guò)NaHCO?緩沖系統(tǒng)維持）、滲透壓280-320mOsm/kg，定期檢測(cè)葡萄糖濃度（需維持>2g/L），避免代謝產(chǎn)物（如乳酸）積累抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。收獲：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)1×10?-2×10?個(gè)/mL時(shí)，離心收集上清液，抗體濃度可達(dá)50-200μg/mL。體內(nèi)誘生法：預(yù)先給BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL降植烷（或液體石蠟），1周后接種1×10?-2×10?個(gè)雜交瘤細(xì)胞。10-14天后小鼠腹部膨大，抽取腹水（每只可獲5-10mL），抗體濃度高達(dá)5-20mg/mL，是體外培養(yǎng)的100倍以上，但需注意小鼠福利倫理規(guī)范。（七）抗體純化與鑒定純化方法：采用ProteinA/G親和層析柱，利用抗體Fc段與ProteinA/G的特異性結(jié)合，通過(guò)pH梯度洗脫（如0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7）獲得純度>95%的抗體。鑒定指標(biāo)：免疫學(xué)特性：抗體亞型（IgG1、IgG2a等）、效價(jià)（ELISA檢測(cè)）、親和力（通過(guò)SPR技術(shù)測(cè)定KD值，理想范圍10??-10?11M）。理化性質(zhì)：分子量（SDS還原/非還原電泳）、穩(wěn)定性（4℃、-20℃保存6個(gè)月活性變化）。三、流程圖題常見(jiàn)考點(diǎn)與失分點(diǎn)（一）兩次篩選的對(duì)比分析篩選階段篩選方法目的淘汰對(duì)象第一次篩選HAT培養(yǎng)基獲得雜交瘤細(xì)胞未融合細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞自身融合體第二次篩選ELISA/Westernblot獲得分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分泌非目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞易錯(cuò)點(diǎn)：混淆兩次篩選的原理，需注意第一次篩選依賴細(xì)胞代謝途徑差異，第二次篩選依賴抗原-抗體特異性結(jié)合。（二）關(guān)鍵試劑的作用PEG：誘導(dǎo)細(xì)胞膜融合，常用分子量4000，濃度50%（w/v），作用時(shí)間不超過(guò)2分鐘。氨基蝶呤：葉酸類(lèi)似物，不可逆抑制二氫葉酸還原酶，阻斷DNA從頭合成途徑。HT補(bǔ)充液：次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合物，供雜交瘤細(xì)胞通過(guò)補(bǔ)救途徑合成DNA。（三）實(shí)驗(yàn)異常分析融合率低：可能原因包括PEG濃度過(guò)高（細(xì)胞死亡）、骨髓瘤細(xì)胞活性不足（臺(tái)盼藍(lán)染色存活率<90%）、脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞比例不當(dāng)（建議5:1至10:1）。無(wú)陽(yáng)性克?。好庖叻桨冈O(shè)計(jì)缺陷（抗原免疫原性弱，需與載體蛋白偶聯(lián)）、抗體檢測(cè)方法靈敏度不足（如ELISA包被抗原濃度過(guò)低）。四、單克隆抗體的應(yīng)用與拓展醫(yī)學(xué)診斷：作為診斷試劑，如早孕試紙（抗hCG單抗）、新冠病毒抗原檢測(cè)試劑盒（抗N蛋白單抗）。靶向治療：如利妥昔單抗（抗CD20）治療B細(xì)胞淋巴瘤，通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用（ADCC）特異性殺傷癌細(xì)胞?？蒲泄ぞ撸河糜诘鞍踪|(zhì)定位（免疫熒光）、相互作用分析（Co-IP）、蛋白純化（免疫親和層析）等實(shí)驗(yàn)。全人源化抗體：通過(guò)基因工程技術(shù)（如噬菌體展示庫(kù)、轉(zhuǎn)基因小鼠）改造抗體基因，降低鼠源抗體的免疫原性，目前已成為治療性抗體的主流方向（如PD-1抑制劑帕博利珠單抗）。五、流程圖繪制規(guī)范繪制單克隆抗體制備流程圖時(shí)，需包含以下核心環(huán)節(jié)，并標(biāo)注關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)：graphTDA[抗原免疫小鼠]-->|42天|B[取脾臟分離B淋巴細(xì)胞]B-->C[與骨髓瘤細(xì)胞融合（PEG）]C-->D[HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞]D-->E[有限稀釋法克隆化培養(yǎng)]E-->F[ELISA檢測(cè)陽(yáng)性克隆]F-->G[體外培養(yǎng)/體內(nèi)誘生]G-->H[純化抗體（ProteinA層析）]評(píng)分要點(diǎn)：需明確標(biāo)注“兩次篩選”的位置及目的，并用箭頭清晰連接各步驟，注明關(guān)鍵試劑（如HAT、PEG）和檢測(cè)方法（如ELISA）。六、高考真題鏈接（2025年模擬題改編）例題：下圖為單克隆抗體制備流程示意圖，回答下列問(wèn)題：（1）步驟①中，給小鼠注射的抗原需與______混合乳化，以增強(qiáng)免疫效果；步驟②中，融合體系中除雜交瘤細(xì)胞外，還可能存在______等融合細(xì)胞（寫(xiě)出兩種）。（2）步驟③使用的HAT培養(yǎng)基中，氨基蝶呤的作用是______，該步驟篩選出的細(xì)胞需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，目的是______。（3）若要生產(chǎn)抗新冠病毒的單克隆抗體，步驟④應(yīng)選用______作為檢測(cè)抗原，最終從______中提取抗體。參考答案：（1）弗氏完全佐劑；B淋巴細(xì)胞自身融合體、骨髓瘤細(xì)胞自身融合體（2）阻斷DNA從頭合成途徑；保證抗體的單一性（或獲得遺傳性狀穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株）（3）新冠病毒S蛋白（或RBD蛋白）；細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水七、技術(shù)拓展：全人源單克隆抗體傳統(tǒng)鼠源單克隆抗體在臨床應(yīng)用中易引發(fā)人體抗鼠抗體反應(yīng)（HAMA），因此全人源化改造成為趨勢(shì)。目前主要技術(shù)包括：噬菌體展示技術(shù)：從人外周血淋巴細(xì)胞中克隆抗體基因，構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)，篩選與抗原結(jié)合的人源抗體片段。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)：將人抗體基因?qū)胄∈蠡蚪M，使其產(chǎn)生人源抗體，如Abgenix公司的XenoMouse平臺(tái)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)：通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序解析B淋巴細(xì)胞受體（BCR）序列，直接合成全人源抗體基因，縮短研發(fā)周期。這