ICS07.100.01

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2072—2021

動(dòng)物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢測

DetectionofEscherichiacoliO157:H7/NMinanimalbedding

2021-01-25發(fā)布2021-02-25實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2072—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。

本文件起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關(guān)、二連浩特市疾病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)

牧業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：趙治國、崔強(qiáng)、郭文麗、延涵、王海艷、陳林軍、敖威華、韓祎陟、靳木子、

羅曉平、李軍燕。

I

DB15/T2072—2021

動(dòng)物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢測

1范圍

本文件規(guī)定了動(dòng)物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM的定性檢測方法、設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑。

本文件適用于動(dòng)物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM定性檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則

SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則

SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實(shí)用指南

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

動(dòng)物墊料animalbedding

用于吸收動(dòng)物排泄物，使動(dòng)物保持舒適生活環(huán)境的鋪墊物。

注：包括動(dòng)物籠內(nèi)非直接與動(dòng)物機(jī)體接觸的鋪墊物。

4設(shè)備和材料

4.1設(shè)備和材料

4.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

4.3均質(zhì)器。

4.4振蕩器。

4.5電子天平：感量0.1g，0.0001g。

4.6全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

4.7全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

4.8酶聯(lián)免疫分析儀。

4.9二級(jí)生物安全柜。

4.10pH計(jì)。

4.11生物顯微鏡。

1

DB15/T2072—2021

4.12微量移液器。

4.13無菌錐形瓶：容量500mL，250mL。

4.14無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。

4.15無菌培養(yǎng)皿：15mm×90mm。

4.16無菌棉簽。

4.17無菌鑷子。

4.18無菌剪刀。

4.19無菌勺。

4.20無菌玻片。

4.21無菌接種環(huán)。

5培養(yǎng)基和試劑

5.1實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。

5.2改良EC肉湯（mEC+n）：見附錄A中A.2。

5.3改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）：見附錄A中A.3。

5.4三糖鐵瓊脂（TSI）：見附錄A中A.4。

5.5營養(yǎng)瓊脂：見附錄A中A.5。

5.6半固體瓊脂：見附錄A中A.6。

5.7月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（MUG-LST）：見附錄A中A.7。

5.8氧化酶：見附錄A中A.8。

5.9革蘭氏染液：見附錄A中A.9。

5.10大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基。

5.11大腸埃希氏菌O157和H7診斷血清。

5.12生化鑒定試劑盒。

5.13革蘭氏陰性菌生化鑒定卡。

5.14飛行質(zhì)譜儀靶板。

5.15大腸埃希氏菌O157:H7/NMATCC35150或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

5.16EHEC腸道出血性大腸埃希氏菌ATCC35130或等效菌株。

5.17大腸埃希氏菌株ATCC25922或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

6檢驗(yàn)程序

大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)流程序見圖1。

2

DB15/T2072—2021

樣品制備

2

檢樣25g或25cm樣液+225mLmEC+n肉湯

36℃±1℃，18h～24h

CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基平板

36℃±1℃，18h～24h

挑取可疑菌落5~10個(gè)接種TSI，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌

MUG-LST

陰性陰性

非E.coilO157血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

生化實(shí)驗(yàn)或輔助鑒定

結(jié)果報(bào)告

圖1大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)流程

3

DB15/T2072—2021

7操作步驟

7.1取樣

7.1.1取樣原則

應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。取樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。

7.1.2樣品處理

7.1.2.1顆粒狀或粉末樣品

對(duì)送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進(jìn)行隨機(jī)多點(diǎn)取樣至少250g，充分混勻后稱取25g顆粒狀或粉末

狀墊料樣品，加入225mLmEC+n肉湯，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，

進(jìn)行預(yù)增菌。

7.1.2.2平面樣品

無菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmí5cm）放在平面墊料表面，用浸有無菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理

鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來回均勻涂抹整個(gè)方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去

棉拭子與手接觸的部分，將棉拭子頭置入裝有25mL無菌稀釋液的無菌錐形瓶中，根據(jù)樣品面積大小重

復(fù)取樣1～4個(gè)規(guī)格板面積，相應(yīng)地將棉拭子頭置入25mL～100mL的無菌稀釋液中，充分振搖制成樣品

原液（1mL原液對(duì)應(yīng)的樣品面積為1cm2），取樣量見表1。取25mL樣品原液加入225mLmEC+n肉湯，

充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，進(jìn)行預(yù)增菌。

表1不同面積平面類墊料樣品取樣量

樣品面積取樣量

規(guī)格板數(shù)

m2cm2

小于0.25（含）251

0.25～0.5（含）502

0.5～0.75（含）753

大于0.751004

7.2分離培養(yǎng)

分別用接種環(huán)取增菌的mEC+n肉湯增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)CT-SMAC平板和一個(gè)大腸埃希氏菌

O157顯色培養(yǎng)基平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落，根據(jù)菌落形態(tài)初

步判定典型和可疑菌落，大腸埃希氏菌O157在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征見表2。

根據(jù)菌落形態(tài)挑取5～10個(gè)典型菌落或可疑菌落（少于5個(gè)時(shí)，全部挑?。?，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平

板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

表2大腸埃希氏菌O157在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板大腸埃希氏菌O157菌落形態(tài)

CT-SMAC平板菌落為圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色。

大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基依據(jù)顯色培養(yǎng)基的說明書判定。

4

DB15/T2072—2021

7.3鑒定

7.3.1革蘭氏染色鏡檢

大腸埃希氏菌O157:H7/NM為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，有鞭毛，動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果呈陽性。其鞭毛抗原

丟失，動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

7.3.2生化鑒定

挑取純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行大腸埃希氏菌O157生化鑒定，在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板

上分別挑取5～10個(gè)可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌株(ATCC

25922或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陽性對(duì)照和腸道出血性大腸埃希氏菌（ATCC35130或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株）做陰性對(duì)

照，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。

在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST

肉湯管于長波紫外燈下觀察（MUG陽性的大腸埃希氏菌株應(yīng)有熒光產(chǎn)生，MUG陰性的應(yīng)無熒光產(chǎn)生），

大腸埃希氏菌O157：H7/NM為MUG試驗(yàn)陰性，無熒光。

大腸埃希氏菌O157生化試驗(yàn)，具體依據(jù)大腸埃希氏菌O157生化鑒定試劑盒說明書進(jìn)行，大腸埃希氏

菌O157生化試驗(yàn)結(jié)果見附錄B。

7.3.3輔助鑒定

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況，選用全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等進(jìn)行鑒定，具體操作依據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)GB/T33682和設(shè)備操作規(guī)范進(jìn)行。

7.3.4血清學(xué)鑒定

在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)。對(duì)于

H7因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代3次。若動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果為陰性，

則確定為無動(dòng)力菌株。

8結(jié)果報(bào)告

綜合生化鑒定結(jié)果、輔助鑒定結(jié)果和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g（cm2）動(dòng)物墊料樣品中檢出或未

檢出大腸埃希氏菌O157：H7/NM。

9生物安全措施

為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測致病菌，所有培養(yǎng)物應(yīng)小心處置，應(yīng)按照GB

19489的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

10廢棄物處理和防治污染的措施

檢測過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。

5

DB15/T2072—2021

附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基和試劑

A.1培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證

按照SN/T1538.1和SN/T1538.2執(zhí)行，并對(duì)制備好的培養(yǎng)基進(jìn)行性能測試，如使用等效的脫水合成

培養(yǎng)基，使用前對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)收并按其說明書使用。

A.2改良EC肉湯(mEC+n)

A.2.1成分

胰蛋白胨20.0g

3號(hào)膽鹽1.12g

乳糖5.0g

K2HPO4?7H2O4.0g

K2HPO41.5g

NaCL5.0g

新生霉素鈉鹽溶液(20mg/mL)1.0mL

蒸餾水1000Ml

A.2.2制法

除新生霉素外，所有成分溶解在水中，加熱煮沸，在20℃～25℃下調(diào)節(jié)pH至6.9±0.1，分裝。于

121℃高壓滅菌15min，備用。制備濃度為20mg/mL的新生霉素儲(chǔ)備溶液，過濾法除菌。待培養(yǎng)基溫度冷

至50℃以下時(shí)，按1000mL培養(yǎng)基內(nèi)加1mL新生霉素儲(chǔ)備液，使最終濃度為20mg/L。

A.3改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂

A.3.1山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂

A.3.1.1成分

蛋白胨20.0g

山梨醇10.0g

3號(hào)膽鹽1.5g

氯化鈉5.0g

中性紅0.03g

結(jié)晶紫0.001g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.3.1.2制法

除瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅外，所有成分溶解在蒸餾水中，加熱煮沸，在20℃～25℃下調(diào)節(jié)pH至

7.2±0.2,加入瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅,煮沸溶解，分裝。于121℃高壓滅菌15min。

A.3.2亞碲酸鉀溶液

A.3.2.1成分

6

DB15/T2072—2021

亞碲酸鉀0.5g

蒸餾水200mL

A.3.2.2制法

將亞碲酸鉀溶于水，過濾法除菌。

A.3.3頭孢克肟(Cefixime)溶液

A.3.3.1成分

頭孢克肟1.0mg

95%乙醇200mL

A.3.3.2制法

將頭孢克肟溶解于95%乙醇中，靜置1h待其充分溶解后過濾除菌。分裝試管，儲(chǔ)存于-20℃，有效期

1年。解凍后的頭孢克肟溶液不應(yīng)再凍存，且在2℃～8℃下有效期14d。

A.3.4CT-SMAC制法

取1000mL滅菌融化并冷卻至46℃±1℃的山梨醇麥康凱(SMAC)瓊脂，加入1mL亞碲酸鉀溶液和10mL

頭孢克肟溶液，使亞碲酸鉀濃度達(dá)到2.5mg/L，頭孢克肟濃度達(dá)到0.05mg/L，混勻后傾注平板。

A.4三糖鐵瓊脂(TSI)

A.4.1成分

蛋白胨20.0g

牛肉浸膏5.0g

乳糖10.0g

蔗糖10.0g

葡萄糖1.0g

硫酸亞鐵銨[(NH4)2Fe(SO4)2?6H2O]0.2g

氯化鈉5.0g

硫代硫酸鈉0.2g

酚紅0.025g或5.0g/L溶液5.0mL

瓊脂12.0g

蒸餾水1000mL

A.4.2制法

除酚紅和瓊脂外,將其他成分加于400mL蒸餾水中，煮沸溶解，在20℃～25℃下調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2。

另將瓊脂加于600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，加入5%酚紅水溶液5mL，混勻，分

裝小號(hào)試管，每管約2mL～4mL。于121℃10min或115℃15min，制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立

即使用，在2℃～8℃條件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。

A.5營養(yǎng)瓊脂

A.5.1成分

蛋白胨10.0g

7

DB15/T2072—2021

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.5.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝。于121℃高壓滅菌15min。

A.6半固體瓊脂

A.6.1成分

蛋白胨1.0g

牛肉膏0.3g

氯化鈉0.5g

瓊脂0.3g～0.4g

蒸餾水100mL

A.6.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2，分裝小試管，于121℃高壓

滅菌15min，直立凝固備用。

A.7月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯-MUG(LST-MUG)

A.7.1成分

胰蛋白胨20.0g

氯化鈉5.0g

乳糖5.0g

磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.75g

十二烷基硫酸鈉0.1g

4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)0.1g

蒸餾水1000mL

A.7.2制法

將各成分溶解于蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，于20℃～25℃下調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2，分裝到帶有

倒管的試管中，每管10mL，于121℃高壓滅菌15min。

A.8氧化酶試劑

A.8.1蛋白胨水

A.8.1.1成分

N，N'-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽

或N，N，N'，N'-四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.0g

蒸餾水100mL

8

DB15/T2072—2021

A.8.1.2制法

少量新鮮配制，于冰箱內(nèi)避光保存，在7d內(nèi)使用。

A.8.2試驗(yàn)方法

用無菌棉拭子取單個(gè)菌落，滴加氧化酶試劑，10s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，即為氧化酶試驗(yàn)陽性。不

變色者為氧化酶試驗(yàn)陰性。

A.9革蘭氏染色液

A.9.1結(jié)晶紫染色液

A.9.1.1成分

結(jié)晶紫1.0g

95%乙醇20mL

1%草酸銨水溶液80mL

A.9.1.2制法

將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.9.2革蘭氏碘液

A.9.2.1成分

碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水300mL

A.9.2.2制法

將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.9.3沙黃復(fù)染液

A.9.3.1成分

沙黃0.25g

95%乙醇10mL

蒸餾水90mL

A.9.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.9.4染色法

A.9.4.1涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染