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ZSMM

浙江省數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/ZSMMXXXX—2023

免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法

Methodofcalibratingcolorationforimmunohistochemistry

2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實施

浙江數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會??發(fā)布

T/ZSMMXXXX—2023

免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法

1范圍

本文件規(guī)定了免疫組化染色顯色校準(zhǔn)方法相關(guān)的術(shù)語和定義、縮略語、方法原理、試劑和材料、儀

器和設(shè)備、通用質(zhì)控物制備、IHC實驗步驟、免疫組化染色顯色校準(zhǔn)（MCC）和免疫組化染色質(zhì)控數(shù)據(jù)。

本文件適用于病理醫(yī)生或研究人員進(jìn)行免疫組化染色反應(yīng)的顯色校準(zhǔn)質(zhì)控管理、對組織免疫化學(xué)反

應(yīng)的驗證與評估，形成免疫組化顯色結(jié)果最終的質(zhì)量控制規(guī)范。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T22576-2008醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的專用要求

GB/T37864-2019生物樣本庫生物質(zhì)量和能力通用要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

顯色coloration

在免疫組化染色中使用DAB顯色劑使標(biāo)記HRP（辣根過氧化物酶）的抗體經(jīng)過反應(yīng)后產(chǎn)生肉眼可見的

顏色的化學(xué)反應(yīng)。

通用質(zhì)控物allpurposequalitycontrolobject;AQCO

適用于免疫組化染色的系列鼠兔蛋白混合物組合：①該類蛋白混合物特異性與二抗結(jié)合；②該類蛋

白混合物不與其一抗、二抗結(jié)合；③該蛋白混合物可與任何鼠兔屬一抗結(jié)合，配合封閉劑排除未結(jié)合的

一抗。通用質(zhì)控物可用作參照對象，具有規(guī)定特性，足夠均勻和穩(wěn)定，已被證實符合標(biāo)稱特性檢查的預(yù)

期用途。

注：通用質(zhì)控物涉及免疫學(xué)技術(shù)創(chuàng)新應(yīng)用，具體原理詳見附錄A。

通用質(zhì)控載玻片allpurposequalitycontrolslides;AQCS

通用質(zhì)控物（3.2）被預(yù)先鋪貼于粘附載玻片上，用蠟?zāi)し獯?，該載玻片用于任何組織標(biāo)本的免疫

組化染色。

免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法methodofcalibratingcolorationforIHC;MCC

在免疫組化染色中使用通用質(zhì)控載玻片（3.3）,依據(jù)給定的操作指南來校準(zhǔn)組織標(biāo)本的顯色情況。

顯色校準(zhǔn)calibratingcoloration

在免疫組化染色中，通過比對組織標(biāo)本與同步染色的通用質(zhì)控物顯色情況，排除不合格因素，評估

顯色質(zhì)量；同時可用已知抗原濃度的通用質(zhì)控物（3.2）顯色作為顏色深淺標(biāo)準(zhǔn)，輔助校準(zhǔn)組織標(biāo)本的

顯色程度。

質(zhì)控數(shù)據(jù)qualitycontroldata

用于判定檢驗結(jié)果是否符合預(yù)期的數(shù)據(jù)，包括且不限于抗原修復(fù)結(jié)果、一抗效價、二抗效價、顯色

結(jié)果（陰性、弱陽性和/或陽性）等。

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假陽性結(jié)果false-positiveresults

分析物為陰性的樣本或患者，檢測結(jié)果為陽性。

假陰性結(jié)果false-negativeresults

分析物為陽性的樣本或患者，檢測結(jié)果為陰性。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

AQCO:通用質(zhì)控物(AllpurposeQualityControlObject)

AQCS:通用質(zhì)控載玻片(AllpurposeQualityControlSlides)

IHC:免疫組織化學(xué)染色/免疫組化染色(Immunohistochemistry)

MCC:免疫組化染色顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法(MethodofCalibratingColorationforIHC)

PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline)

5試劑和材料

通用質(zhì)控物

5.1.1每片免疫組化染色時使用新的通用質(zhì)控載玻片，通用質(zhì)控物和與患者標(biāo)本同步染色。

5.1.2通用質(zhì)控物應(yīng)至少提供陽性、陰性對照功能。

5.1.3通用質(zhì)控物宜設(shè)置多個（4個以上）梯度抗原濃度靶點提供組織標(biāo)本的顯色參考標(biāo)準(zhǔn)，如：強(qiáng)

陽性（+++）、陽性（++）、弱陽性（+）、陰性等。見圖1。

圖1通用質(zhì)控物靶點

5.1.4通用質(zhì)控物應(yīng)提供組織標(biāo)本內(nèi)抗原修復(fù)情況、一抗效價、二抗效價等評估功能，提供有效的質(zhì)

控信息。

5.1.5通用質(zhì)控物應(yīng)提供顯色背景顏色亮度值（0～255）的功能，來校準(zhǔn)不同光源條件下觀察結(jié)果產(chǎn)

生的差異，以通用質(zhì)控物陰性靶點亮度值=255作為校準(zhǔn)參考。見圖2。

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圖2背景顏色亮度值調(diào)整示意

試劑

5.2.1鼠屬或兔屬一抗工作液（EDTA熱修復(fù)）。

5.2.2羊?qū)俣构ぷ饕海ㄒ豢箒碓从谛∈蠡蛲茫?/p>

5.2.3使用推薦的二抗封閉液之一：BovineIgG（牛IgG）、BSA（牛血清蛋白）、DonkeyIgG(驢IgG)。

5.2.4PBS（pH值=7.2~7.4，含0.05%吐溫-20）。

5.2.5EDTA抗原修復(fù)液（50×，使用時稀釋至1×）。

5.2.63%H2O2。

5.2.7DAB顯色液（辣根過氧化物酶型，pH=7.5~7.6）。

5.2.8蘇木素染色液（0.01%）。

6儀器

免疫組化染色機(jī)應(yīng)具備熱修復(fù)模塊，且能夠按本文件給定的IHC操作步驟設(shè)置相同的運行程序。

7通用質(zhì)控物制備

依次制備蛋白總含量相同但成分比例不同的鼠、兔、驢來源IgG蛋白混合液。

基于鼠、兔IgG中的相同F(xiàn)cyr1位點制備通用型抗原蛋白混合液。

使用蛋白3D打印技術(shù)打印出不同梯度濃度蛋白混合液標(biāo)靶點。見圖3。

使用甲醛固定后，石蠟干封。

圖3蛋白混合液梯度比例

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8IHC操作步驟

鋪貼有標(biāo)本組織的通用質(zhì)控載玻片脫蠟至水。

常規(guī)抗原修復(fù)（修復(fù)溫度不高于97℃）。

PBS浸泡5min×2次,蒸餾水浸泡3min×2次。

3%H2O2室溫孵育5min～0min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min×2次。

滴加一抗工作液（鼠屬或兔屬），37℃孵育1h～2h或4℃過夜。

PBS沖洗5min×3次，滴加封閉液，室溫孵育10min。

PBS沖洗5min×3次，滴加二抗工作液（羊?qū)伲?7℃孵育10～30min。

PBS沖洗5min×3次，DAB顯色3～5min。

自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

9免疫組化染色顯色校準(zhǔn)（MCC）

人工診斷

9.1.1觀察通用質(zhì)控物顯色情況，外觀形態(tài)有無機(jī)械性破損，顯色是否正常，正常顯色應(yīng)為梯度深淺

的二抗顯色與一抗顯色以及陰性不顯色（透明）。

9.1.2觀察組織標(biāo)本的顯色情況，外觀有無機(jī)械性破損，染色是否清晰。

9.1.3通用質(zhì)控物顯色作為內(nèi)參靶標(biāo)顯色，比對組織標(biāo)本與通用質(zhì)控物的顯色情況，評估、校準(zhǔn)出組

織標(biāo)本真實、正確的顯色，完成最后的閱片診斷。見圖4。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織無顯色，二抗內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱，陰性對照無顯

色，一抗內(nèi)參無顯色，則判定本次染色過程一抗失效或沒有正確的一抗，染色質(zhì)量為不合格。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織無顯色，二抗內(nèi)參、陰性對照、、一抗內(nèi)參均無顯色，則判定本

次染色過程抗原修復(fù)出現(xiàn)問題（完全丟失抗原信息）染色質(zhì)量為不合格。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織顯色，二抗內(nèi)參從左至右棕黃色梯次減弱且僅100%濃度靶標(biāo)顯色，

陰性對照無顯色，一抗內(nèi)參僅高濃度靶標(biāo)顯色，則判定本次染色過程一抗、二抗均存在效價

問題，染色質(zhì)量為不合格。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織顯色，二抗內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱，陰性對照無顯色，

一抗內(nèi)參無顯色，則判定本次染色過程出現(xiàn)一抗非特異性染色，染色質(zhì)量為不合格。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織弱顯色，二抗內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱但強(qiáng)度明顯降低，

陰性對照無顯色，一抗內(nèi)參梯次顯色但強(qiáng)度明顯降低，則判定本次染色過程一抗、二抗均存

在效價損失，染色質(zhì)量為不合格。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織弱顯色，二抗內(nèi)參無顯色，陰性對照無顯色，一抗內(nèi)參梯次顯色

但強(qiáng)度明顯降低，則判定本次染色過程抗原修復(fù)出現(xiàn)問題（丟失大部分抗原信息）、二抗均

存在效價損失，染色質(zhì)量為不合格。

——若免疫組化顯色結(jié)果為組織顯色，二抗內(nèi)參從左至右棕黃色顯色梯次減弱，一抗內(nèi)參梯次顯

色，則判定本次染色過程正常，染色質(zhì)量為合格。

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圖4MCC判讀指南

電腦軟件或人工智能診斷

9.2.1使用數(shù)字病理玻片掃描儀將待分析的免疫組化染色玻片掃描為數(shù)字圖像，圖像內(nèi)容應(yīng)包括組織

標(biāo)本與通用質(zhì)控物的全部輪廓。見圖5。

圖5通用質(zhì)控載玻片掃描范圍

9.2.2根據(jù)通用質(zhì)控物提供的顯色背景顏色亮度值（0～255），將數(shù)字圖像的背景顏色校準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)光

源下產(chǎn)生的正確顯色，以通用質(zhì)控物陰性靶點亮度值=255作為校準(zhǔn)參考。見圖6。

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圖6顯色背景顏色亮度調(diào)節(jié)指示

9.2.3病理醫(yī)生利用電腦軟件或人工智能，根據(jù)通用質(zhì)控物提供的抗原濃度信息和對應(yīng)的顯色程度作

為參考，計算組織標(biāo)本的相對光密度與相對抗原濃度，有效評估組織標(biāo)本內(nèi)真實的抗原情況。

10免疫組化顯色校準(zhǔn)數(shù)據(jù)

免疫組化染色質(zhì)控數(shù)據(jù)的儲存信息應(yīng)包括但不限于：

a)標(biāo)本基礎(chǔ)信息：住院號、病理號、患者姓名、患者年齡、患者性別、患者聯(lián)系方式、臨床診

斷、既往史、取材部位；

b)單位基礎(chǔ)信息：醫(yī)院名稱、送檢科室、送檢醫(yī)生、聯(lián)系方式；

c)標(biāo)本接收時間、IHC操作時間、報告出具時間；

d)試劑耗材品牌型號、批次、批號；

e)手工染色或免疫組化自動染色機(jī)信息；

f)一抗、二抗有效濃度驗證記錄；

g)抗原修復(fù)結(jié)果評估；

h)一抗效價評估；

i)二抗效價評估；

j)顯色質(zhì)量評價。

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A

A

附錄A

（資料性）

通用質(zhì)控物技術(shù)原理

A.1通用質(zhì)控物技術(shù)原理

A.1.1該類蛋白混合物（鼠、兔）與通用型羊?qū)俣拱l(fā)生特異性結(jié)合，無法與鼠、兔屬一抗發(fā)生結(jié)合。

A.1.2該類蛋白混合物由100%驢蛋白組成，與鼠、兔屬一抗和通用型羊?qū)俣咕粫l(fā)生結(jié)合。

A.1.3該類蛋白混合物使用一種結(jié)構(gòu)物與鼠、兔屬一抗體上的一個Fcyr1點結(jié)合，該位點為非特異性

位點，鼠、兔屬一抗體均具有相同的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)。替代抗原結(jié)合模式見圖A.1。

圖A.1替代抗原結(jié)合模式圖

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參考文獻(xiàn)

[1]GB19781醫(yī)學(xué)試驗室安全要求

[2]CNAS-CL02-A001：2021醫(yī)學(xué)試驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則的應(yīng)用要求

[3]GB/T22576-2008醫(yī)學(xué)試驗室質(zhì)量和能力的專用要求

[4]GB/T37864-2019生物樣本庫生物質(zhì)量和能力通用要求

[5]WS/T494-2017臨床定性免疫檢驗重要常規(guī)項目分析質(zhì)量要求

[6]CNAS-GL37校準(zhǔn)和測量能力（CMC）表示指南

[7]衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)【2009】31號病理科建設(shè)與管理指南（試行）

[8]CNAS-CL02-A008-2018醫(yī)學(xué)試驗室質(zhì)量和能力準(zhǔn)則在組織病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)用和說明

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《免疫組化顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法》編制說明

一、任務(wù)來源

經(jīng)浙江省數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會批準(zhǔn)，由微邦（武漢）醫(yī)療健康產(chǎn)業(yè)有限公司牽頭，

會同：廣州大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院、深圳市諾高實驗器材有限公司等單位共同

編制《免疫組化顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法》。本文件由浙江省數(shù)理醫(yī)學(xué)學(xué)會發(fā)布并歸口。

請注意本文件的其他內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些

專利的責(zé)任。

二、主要起草單位和主要起草人員

本標(biāo)準(zhǔn)主起草單位：微邦（武漢）醫(yī)療健康產(chǎn)業(yè)有限公司牽頭，會同：廣州

大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院、深圳市諾高實驗器材有限公司等。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：錢峰，汪建陽，李涵，王顯科，楊芳宇，馮驥良。

參與起草人：高志成，童英，王貝晗，舒清明，羅琳，鄒宇量，崔新伍，王

哲，周建華，邵春奎，鄧暉，陳軍，陳兵，黃代斌，林志標(biāo)，岑子祥，王文雄等。

三、編制背景

本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的立項背景之一免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)是臨

床病理診斷中常用的技術(shù)和手段。傳統(tǒng)免疫組化經(jīng)過80年的發(fā)展，已經(jīng)成為病

理診斷的基本性技術(shù)，從20世紀(jì)70年代開始，免疫組化技術(shù)就已經(jīng)應(yīng)用于病理

診斷，對診斷腫瘤、腫瘤分類、判斷預(yù)后給予了巨大的幫助，同時也擴(kuò)展了人們

對于各種疾病及腫瘤形成過程的認(rèn)識，提高了病理診斷與研究的水平。

當(dāng)前我國各地病理實驗室在進(jìn)行免疫組化診斷過程中，也存在一些長期未解

決的弊端與不足，原因在于從臨床采集的手術(shù)標(biāo)本到制成一張合格的免疫組化玻

片，需要經(jīng)過固定、包埋、切片、抗原修復(fù)、一抗、二抗、顯色等多個步驟，每

個操作步驟是否規(guī)范都會或多或少影響最終的制片質(zhì)量，其中的一個核心問題為

最后的顯色環(huán)節(jié)，正確的顯色取決于抗原暴露情況、抗體質(zhì)量、反應(yīng)環(huán)境等等，

是一個綜合因素影響的技術(shù)性問題，如：一抗與抗原未正確結(jié)合或失效、抗原修

復(fù)過程中被破壞、二抗?jié)舛鹊突蚴У葧?dǎo)致最終的標(biāo)本組織不顯色或強(qiáng)度弱，

可能診斷假陰性；抗原修復(fù)條件不合適非特異性抗原結(jié)合一抗會導(dǎo)致最終的標(biāo)本

組織錯誤顯色，可能診斷假陽性。有關(guān)文獻(xiàn)指出無論手工顯色還是機(jī)器顯色，假

陰性或假陽性率甚高，只能依賴有充足診斷經(jīng)驗的病理醫(yī)生從細(xì)胞形態(tài)去判斷顯

色位置、顯色深淺正確與否，鑒別假陰性和假陽性。這種依賴經(jīng)驗學(xué)的現(xiàn)狀使病

理醫(yī)生和病人都承擔(dān)了潛在的醫(yī)療風(fēng)險與壓力。

目前，我國病理醫(yī)生長期缺乏一種可以對每片免疫組化顯色室內(nèi)質(zhì)控（IQC）、

室間質(zhì)評（EQA）的技術(shù)方法。近年來，隨著數(shù)字病理、遠(yuǎn)程診斷、人工智能，

特別是PD1/PDL1為代表的靶向藥的應(yīng)用，對免疫組化顯色質(zhì)量客觀、量化評判

標(biāo)準(zhǔn)的需求越來越高?，F(xiàn)經(jīng)研究決定編制《免疫組化顯色校準(zhǔn)質(zhì)控方法》團(tuán)體標(biāo)

準(zhǔn)，以引導(dǎo)相關(guān)從業(yè)和研究人員熟悉、掌握以MCC技術(shù)為代表的免疫組化顯色

校準(zhǔn)質(zhì)控方法要點，可有效解決最核心的制片質(zhì)量控制問題，實現(xiàn)不同實驗室之

間統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到診斷結(jié)果的互認(rèn)互通，數(shù)據(jù)