第四節(jié)沉淀分離沉淀：添加某些物質(zhì)或改變某些條件使待提取酶或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低，而形成無定形沉淀的過程。沉淀分離：利用條件改變時不同物質(zhì)溶解度改變程度不同的性質(zhì)，使酶或雜質(zhì)形成沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。一、一般沉淀操作的過程1、樣品中加入沉淀劑或改變條件；2、沉淀物的陳化；3、離心或過濾，收集或除去沉淀物；二、方法（一）鹽析：通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)溶解度降低，從溶液析出的過程。溶解度會為零嗎？1、鹽對溶解度的影響生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)：帶某種電荷，相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系周圍有水化膜，避免了相互碰撞當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時：

鹽溶－低鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度增大

鹽析－高鹽濃度下,蛋白質(zhì)溶解度下降，2、鹽溶與鹽析原理鹽析：A.中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜；B.無機(jī)離子中和表面電荷，分子間的排斥力減弱，相互靠攏；鹽溶：A.中性鹽使表面電荷增多，分子間的排斥力增強(qiáng)，占優(yōu)勢；B.中性鹽的親水性使水化膜變薄，劣勢；鹽使蛋白質(zhì)脫水化膜示意圖疏水區(qū)鹽使蛋白質(zhì)溶解度增加示意圖3、影響鹽析的因素溶質(zhì)種類溶質(zhì)濃度：

pH值：欲分離蛋白質(zhì)pI附近；鹽析溫度：室溫或低溫；蛋白質(zhì)濃度大，鹽用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽用量大，分辨率高；4、鹽析的方法（1）一次鹽析：主要含目的蛋白質(zhì)（2）分段鹽析：含多種蛋白質(zhì)的混合液，使不同蛋白質(zhì)分批分離。如一種酶在30%飽和度的硫酸銨中完

全不沉淀，在70%飽和度的硫酸銨中幾

乎完成沉淀。5、提高鹽濃度的方法飽和度：溶液中加入的飽和鹽溶液的體積與混合

溶液總體積之比。（1）加飽和溶液飽和度溶液的配制：見課本P87例1：用硫酸銨沉淀某酶需0.3的飽和度，現(xiàn)有70ml酶液，需飽和硫酸銨多少ml？特點(diǎn)：飽和度低、溫和6、提高鹽濃度的方法例3：如果沉淀某一種酶需要60%飽和度的硫酸銨，那么1L溶液中需硫酸銨固體的量是多少？（2）直接加鹽法例2：往酶液中加入硫酸銨，使其終濃度為390g/L。酶液500ml，硫酸銨多少？例4：如果一種酶在30%飽和度的硫酸銨中完

全不沉淀，在70%飽和度的硫酸銨中幾

乎完成沉淀，怎么沉淀這種酶？特點(diǎn)：飽和度高，易局部過飽和（二）有機(jī)溶劑沉淀法通過加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。1、原理：（1）降低了溶液的介電常數(shù)，溶質(zhì)間靜電斥力減少，從而聚集；（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了蛋白質(zhì)表面水化膜的厚度，導(dǎo)致凝聚。2、主要影響因素溫度：低溫（防止變性和提高收率）時間：短時溶液pH值：欲分離酶的pI附近樣品濃度:0.5~2%

?。喝軇┯昧看?，回收率低，共沉作用小 濃：溶劑用量小，共沉作用強(qiáng)，分辨率低3、常用沉析劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，毒性大；特點(diǎn)：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48

丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取水溶性好4、特點(diǎn)分辨率高；溶劑易分離，并可回收使用；不含無機(jī)鹽易使蛋白質(zhì)失活；（三）等電點(diǎn)沉淀法通過調(diào)節(jié)溶液pH至酶的pI，使酶的溶解度最低而沉淀析出。1、原理：酶所帶靜電荷為0，靜電斥力消失，分子聚集。2、應(yīng)用水化膜仍存在，酶仍有一定溶解度，沉淀不完全，所以常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法一起使用。單獨(dú)使用時，常用于除去pI相差較大的雜蛋白。3、操作時注意事項（1）受無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會發(fā)生“漂移”，陽-高，陰-低（2）酸堿調(diào)節(jié)要慢，注意攪拌（四）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀，而不影響所需的酶。方法熱變性酸堿變性金屬離子變性慎重使用?。?！第五節(jié)膜分離高分子膜做過濾介質(zhì)的過濾，也稱膜過濾包括微濾、超濾、納濾、反滲透、透析等常用于酶分離純化的有超濾和透析1、超濾：超濾膜（2nm≤截留顆粒R≤0.2μm）截留分子質(zhì)量介于500~1000kD的大分子和膠體粒子。分離病毒、生物大分子，用于酶的分離純化、

濃縮、脫鹽和換液減小濾餅層的堆積，保證過濾速度的穩(wěn)定常采用切向流過濾，液體流動方向與過濾方向垂直小型切向流超濾的膜包及超濾濃縮示意圖采用超濾離心管實(shí)現(xiàn)濃縮和換液的示意圖不同孔徑的超濾膜具有不同的蛋白分離范圍截留分子量：被截留物質(zhì)的最小分子量選擇截留分子量為目的蛋白分子量的1/3的超濾膜2.透析小分子利用擴(kuò)散作用擴(kuò)散到膜外，大分子被截留在膜內(nèi)，從而使大、小分子分離的方法主要用于實(shí)驗(yàn)室水平的除鹽、有機(jī)溶劑及小分

子抑制劑等。第六節(jié)萃取分離利用各種組分在兩個互不相溶的液相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如有機(jī)溶劑萃取、超臨界萃取雜質(zhì)溶質(zhì)萃取劑LightphaseHeavyphase原溶劑1.雙水相萃取

利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中溶解度不同而達(dá)到分離。2.6％PEG7.6％Dextran4.9％PEG1.8％Dextran1、雙水相含有一定濃度的兩種高聚物或高聚物和鹽或正負(fù)離子表面活性劑的水溶液形成的互不相溶有明顯界面的兩個水相。2、雙水相系統(tǒng)：（1）PEG－鹽（2）PEG－DEXTRAN（3）正/負(fù)離子表面活性劑3、雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)（1）平衡時間短（2）含水量高，適合于生物活性物質(zhì)的分離純化（3）設(shè)備簡單（4）操作簡便（5）易于放大2.反膠束萃取利用反膠束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。1、膠束：表面活性劑在水溶液中超過一定濃度時，自發(fā)形成的一種納米尺度的聚集體。極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”，溶解非極性物質(zhì)水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”2、反膠束：表面活性劑在有機(jī)溶劑中超過一定濃度時，自發(fā)形成的一種納米尺度的聚集體。極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”，“水池”溶解極性物質(zhì)保護(hù)作用有機(jī)溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”3、反膠束萃取的原理兩相界面的表面活性劑在帶相反電荷蛋白質(zhì)的靜電引力下發(fā)生變