CCSB39DB42湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB42/T2227.1—2024前言 V 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14質(zhì)量要求 25抽樣、檢驗、留樣和判定 46標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運輸和貯存 6附錄A（資料性）羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方 8附錄B（資料性）羊肚菌菌種ITS序列分析法 9附錄C（資料性）羊肚菌交配型鑒定 DB42/T2227.1—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB42/T2227《食用菌菌種質(zhì)量檢驗規(guī)范》的第1部分。DB42/T2227已發(fā)布了以下部分：——第1部分：羊肚菌；——第2部分：荷葉離褶傘。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口管理。本文件主要起草單位：湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所、十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、房縣蔬菜服務(wù)中心、房縣土城鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、湖北飄揚食品科技有限公司。本文件主要起草人:王卓仁、劉啟燕、趙會長、周洪英、孫波、吳洪麗、吳建志、陳朝暉、王明安、李軍、李世華、羅義、蒙天祿、湯茂勇、湯一名。本文件實施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；對本文件的有關(guān)修改意見建議請反饋至湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，聯(lián)系電郵箱：wangzhuoren@。DB42/T2227.1—2024V引言隨著食用菌產(chǎn)業(yè)在湖北省穩(wěn)步發(fā)展，需規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化引導(dǎo)食用菌菌種生產(chǎn)，從源頭上保障食用菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，保障企業(yè)及菇農(nóng)實現(xiàn)較大經(jīng)濟效益，滿足食用菌消費市場要求。該文件制定的目的是規(guī)范食用菌菌種質(zhì)量檢驗規(guī)程，整體提升我省食用菌菌種質(zhì)量。該文件不同部分的劃分，主要依據(jù)為食用菌品種的不同，亦便于該文件各部分單獨使用。DB42/T2227《食用菌菌種質(zhì)量檢驗規(guī)范》擬由以下部分構(gòu)成?！?部分：羊肚菌。本文件規(guī)定了羊肚菌菌種的質(zhì)量要求、抽樣、檢驗、留樣、判定及標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運輸、貯存等。本文件僅適用于梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌等可人工栽培的羊肚菌菌種的生產(chǎn)、流通和使用。——第2部分：荷葉離褶傘。本文件規(guī)定了荷葉離褶傘菌種的質(zhì)量要求、抽樣、檢驗、留樣判定及標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運輸、貯存等。本文件適用于荷葉離褶傘菌種的生產(chǎn)、流通和使用?！?部分：斑玉蕈。本文件規(guī)定了斑玉蕈菌種的術(shù)語和定義、質(zhì)量要求、抽樣、檢驗、留樣、判定及標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運輸、貯存等。本文件適用于斑玉蕈菌種的生產(chǎn)、流通和使DB42/T2227.1—20241食用菌菌種質(zhì)量檢驗規(guī)范第1部分：羊肚菌本文件規(guī)定了羊肚菌（Morchellaspp.）菌種的質(zhì)量要求、抽樣、檢驗、留樣、判定及標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運輸、貯存等。本文件適用于梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）和七妹羊肚菌（M.eximia）等可人工栽培的羊肚菌菌種的生產(chǎn)、流通和使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728—2006食用菌術(shù)語GB/T37671—2019金針菇菌種NY/T528—2010食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1742—2009食用菌菌種通用技術(shù)要求3術(shù)語和定義GB/T12728—2006、GB/T37671—2019界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羊肚菌Morchellaspp.又名：麻子菌、羊肚菜、羊肚蘑、陽雀菌、羊蜂窩蛾子等，隸屬于真菌界、子囊菌門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬。子囊果圓錐形至寬圓錐形，偶見卵圓形，幼嫩時蒼白色至深灰色，隨著成熟逐漸變?yōu)樯罨易厣两鹾谏?。菌柄通?；砍拾魻钪两魻睿砻婀饣蚺家姲咨蹱铑w粒，基部在成熟過程中逐漸發(fā)育有縱向的脊和腔室，菌柄白色至淺棕色，菌肉白色至浸狀棕色，中空。子囊孢子橢圓、光滑、同質(zhì)。3.2由羊肚菌營養(yǎng)菌絲聚集而成的顆粒狀（或塊狀）黃褐色休眠組織。3.3種性characterofvariety食用菌的品種特性。一般包括生理特性、農(nóng)藝性狀和商品性狀。[來源：GB/T12728—2006，2.5.4]3.4液體菌種liquidspawn培養(yǎng)基為液體狀態(tài)的菌種。2DB42/T2227.1—2024[來源：GB/T12728—2006，2.5.30]搖瓶液體菌種liquidspawnculturingbyerlenmeyerflaskonashaker由母種移植到瓶裝液體培養(yǎng)基中在搖床上恒溫振蕩擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。[來源：GB/T37671—2019，3.13]發(fā)酵罐液體菌種liquidspawnculturingbyfermentationtank由搖瓶液體菌種移植到發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。[來源：GB/T37671—2019，3.14]3.7通氣量ventilationvolume液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入培養(yǎng)基中的無菌空氣量。用L/min表示。[來源：GB/T37671—2019，3.15，有修改]4質(zhì)量要求4,1菌種生產(chǎn)用水菌種生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749的規(guī)定。4.2菌種分類根據(jù)來源、繁殖代數(shù)與生產(chǎn)目的，羊肚菌菌種分為母種、原種、栽培種；根據(jù)培養(yǎng)基質(zhì)的形態(tài)，分為固體菌種和液體菌種。4.3母種4.3.1容器規(guī)格應(yīng)符合NY/T528—2010中的規(guī)定。4.3.2感官要求應(yīng)符合表1規(guī)定。表1母種感官要求無無4.3.3接種量：接種塊大小控制在（3mm～5mm）×（3mm～5mm）。4.3.4母種培養(yǎng)條件和時間：參考附錄A中A1培養(yǎng)基的配方，15℃~18℃避光恒溫培養(yǎng)，應(yīng)在5d～7d長滿斜面培養(yǎng)基表面。4.3.5母種真實性鑒定：母種的真實性鑒定要求參照5.2.1和5.2.2。4.3.6母種栽培性狀：母種需經(jīng)出菇試驗，確證種性合格后，方可用于擴大繁殖或出售。DB42/T2227.1—202434,4原種4.4.1固體原種容器規(guī)格應(yīng)符合NY/T528—2010中的規(guī)定。感官要求應(yīng)符合表2規(guī)定。表2固體原種感官要求無無每支母種接原種數(shù)量和接種物大?。?瓶（袋）～8瓶（袋），≥12mm×15mm。菌絲長滿培養(yǎng)基的時間：采用附錄A中規(guī)定的配方在15℃~18℃避光恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿750ml菌種瓶培養(yǎng)基的時間為14d～20d。4.4.2液體原種（搖瓶液體菌種）容器規(guī)格應(yīng)符合GB/T37671—2019中的規(guī)定。感官要求應(yīng)符合表3規(guī)定。培養(yǎng)基裝液量：容器的40%～60%。母種接種塊大小和接種量5mm～10mm)×（5mm～10mm),4塊～8塊。液體原種培養(yǎng)條件和時間：采用附錄A中規(guī)定的配方在振蕩頻率100r/min～120r/min的搖床上，溫度15℃~18℃,避光培養(yǎng)，菌絲長滿培養(yǎng)基的時間為4d～6d。4.4.3液體原種（發(fā)酵罐液體菌種）容器規(guī)格應(yīng)符合NY/T528—2010中的規(guī)定。表3搖瓶液體菌種感官指標(biāo)要求無感官要求應(yīng)符合表4規(guī)定。DB42/T2227.1—20244表4發(fā)酵罐液體菌種感官指標(biāo)要求無培養(yǎng)基裝液量：容器的40%～60%。液體菌種接種量：與培養(yǎng)基投料量的體積比為0.05%～0.1%。發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)條件和時間：采用附錄A中規(guī)定的配方，通氣量0.5L/min～1.2L/min、罐壓保持在0.02MPa～0.04MPa之間，溫度15℃~18℃,菌絲長滿培養(yǎng)基的時間為4d～6d。4.5栽培種4.5.1容器規(guī)格應(yīng)符合NY/T528—2010中的規(guī)定。4.5.2感官要求應(yīng)符合表5規(guī)定。表5栽培種感官要求無無核4.5.3每瓶（袋）原種接栽培種數(shù)量：50瓶（袋300瓶（袋）。4.5.4菌絲長滿培養(yǎng)基時間：采用附錄A中規(guī)定的配方在15℃~18℃避光恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿培養(yǎng)基5抽樣、檢驗、留樣和判定5.1.1母種按品種、培養(yǎng)條件、接種時間分批編號，原種和栽培種按菌種來源、制種方法和接種時間分批編號。按批隨機抽取被檢樣品。5.1.2固體菌種的母種、原種和栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%，5%，1%。但每批抽樣數(shù)量不得少于10支（瓶、袋）；超過100支（瓶、袋）的，可進行兩級抽樣。液體菌種的搖瓶菌種的抽樣量為每批1個～2個搖瓶，發(fā)酵罐菌種為每罐100mL～500mL。5.2檢驗測試菌株的ITS序列分別與梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌或七妹羊肚菌等羊肚菌的ITS序列進行比對，相似性達97%以上為相應(yīng)類別的種類。參考附錄B操作。DB42/T2227.1—202455.2.2交配型基因檢測在ITS序列檢測確定相關(guān)菌株為栽培羊肚菌相應(yīng)種類的基礎(chǔ)上，參考附錄C操作，對測試菌株的DNA產(chǎn)物分別使用羊肚菌交配型特異性引物對Mat1-1-1TF/R、MAT1-2-1TF/R進行PCR擴增，根據(jù)擴增條帶的有無，兩對引物擴增條帶同時存在則判定該測試菌種具備完整的交配型基因，是有效菌種；否則視為某一種交配型基因缺失菌株，不作為有效菌種。5.2.3感官檢驗感官檢驗按表6逐項進行。表6感官要求檢驗方法//5.2.4微生物學(xué)檢驗菌絲體形態(tài)、螨蟲檢驗：檢測方法應(yīng)符合GB/T37671—2019中5.1.4的規(guī)定。細菌檢驗：檢測方法應(yīng)符合GB/T37671—2019中5.1.2的規(guī)定。霉菌檢驗：檢測方法應(yīng)符合GB/T37671—2019中5.1.3的規(guī)定。5.2.5菌種培養(yǎng)條件和時間母種：PDA培養(yǎng)基，參考附錄A中的配方在15℃~18℃條件下培養(yǎng)，觀測菌絲長滿斜面所需原種和栽培種:參考附錄A中的配方任選其一在15℃~18℃培養(yǎng)，觀測菌絲長滿培養(yǎng)基所需母種栽培農(nóng)藝性狀：將被檢母種制作成固體原種，參考附錄A中的配方，制成菌瓶(袋)。按照常規(guī)方法整地做畦、播種、補營養(yǎng)袋、催菇、出菇管理，根據(jù)表7所列項目，做好栽培記錄。表7母種栽培農(nóng)藝性狀檢驗記錄DB42/T2227.1—20246固體菌種各級菌種應(yīng)留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)每個批號3支（瓶、袋）～5支（瓶、袋），于0℃~4℃貯存，貯存至使用者在正常生產(chǎn)條件下該批菌種出菇。5.4判定判定規(guī)則按質(zhì)量要求進行。檢驗項目全部符合要求時，為合格菌種，其中任何一項不符合要求，均為不合格菌種。6標(biāo)簽、標(biāo)志、包裝、運輸和貯存6.1標(biāo)簽、標(biāo)志6.1.1產(chǎn)品標(biāo)簽每支（瓶、袋、罐）菌種應(yīng)貼有清晰注明以下要素的標(biāo)簽：a)產(chǎn)品名稱（菌種類別、菌種名稱、菌株代號）；b)生產(chǎn)單位；c)接種日期；d)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。6.1.2包裝標(biāo)簽菌種包裝應(yīng)貼有清晰注明以下要素的包裝標(biāo)簽：a)產(chǎn)品名稱（菌種類別、菌種名稱、菌株代號）；b)品種適宜種植區(qū)域、種植季節(jié)；c)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)；d)保質(zhì)期、貯存條件；e)菌種生產(chǎn)經(jīng)營許可證編號；f)廠名、廠址、聯(lián)系電話；6.1.3包裝儲運圖示按GB/T191的規(guī)定，應(yīng)注明以下圖示標(biāo)志：a)小心輕放標(biāo)志；b)防水、防潮、防凍標(biāo)志；c)防曬、防高溫標(biāo)志；6.2包裝6.2.1母種外包裝采用木盒或有足夠強度的紙箱，內(nèi)填棉花、碎紙等緩沖物。6.2.2原種、栽培種外包裝可采用潔凈、干燥的塑料箱、編織袋、泡沫箱或有足夠強度的紙箱。6.3.1不應(yīng)與有毒、有害、有異味的物品混裝混運。DB42/T2227.1—20246.3.2運輸工具應(yīng)清潔、衛(wèi)生、無污染物。6.3.3氣溫達26℃以上時，應(yīng)用2℃~6℃的冷藏車運輸。6.3.4運輸中應(yīng)有防震、防曬、防塵、防雨淋、防雜菌污染的措施。6.4貯存6.4.1母種在3℃±1℃冰箱中貯存，貯存期不超過60d。6.4.2固體原種和固體栽培種的貯存溫度和時間參考NY/T1742—2009中7.4.2的規(guī)定6.4.3搖瓶液體菌種、發(fā)酵罐液體菌種均應(yīng)及時使用，不貯存。DB42/T2227.1—20248羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方表A.1給出了羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方。表A.1羊肚菌菌種培養(yǎng)基配方DB42/T2227.1—20249羊肚菌菌種ITS序列分析法B.1檢測流程待測菌種→菌絲DNA提取→PCR擴增→序列測定→比對分析→結(jié)果判定。B.2菌體培養(yǎng)待測菌種固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，硫酸鎂1.0g，磷酸二氫鉀1.0g，酵母膏2.0g，瓊脂20.0g，補水至1L，pH自然，121°C高溫高壓滅菌25min，備用。滅菌培養(yǎng)基趁熱分裝至平板中，冷卻，接種，16℃±2℃黑暗培養(yǎng)5d～10d備用。B.3DNA提取和純化CTAB（cetyltrimethylammoniumbromide）法：a)刮取待測菌種菌絲體，裝于預(yù)先裝有少許石英砂的1.5mL離心管中，加入菌絲后再加入少許石英砂；b)加入600μL的2×CTAB裂解液:先加入300μL，研磨后再加入300μL。用研磨棒將混合物充分研磨至均勻的勻漿物。置65°C水浴鍋中水浴1h（其間每隔10min翻轉(zhuǎn)混勻一次）；c)從水浴鍋中取出，4℃下12000rpm離心1min，取上清，加入等體積的的酚：氯仿：異戊醇（體積比25:24:1），翻轉(zhuǎn)幾次，4℃下12000rpm離心10min。收集上層水相，轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。該步驟重復(fù)1-2次，直至兩相界面上無沉淀為止；e)加入等體積的氯仿抽提一次，收集上層水相入新的離心管中，加入0.5-1倍體積的異丙醇，4°f)小心棄去上清液，將離心管壓在干凈的吸水紙上，吸干殘留的上清液；g)沿離心管內(nèi)壁自上而下緩慢加入1ml75%的冷乙醇，盡量將管壁上的沉淀洗入管底，動作要輕柔，12000rpm離心2min，棄上清，重復(fù)一次；h)置室溫或真空干燥器中干燥。干燥后加入100μLTE緩沖液溶解，-20°C保存?zhèn)溆?；B.4PCR擴增TCCTCCGCTTATTGATATGC)對提取的基因組DNA進行PCR擴增，獲取待測菌種的ITS序列。反應(yīng)體系：10×PCRbuffer5μL，10mMdNTPmix4μ模板1μL；無菌超純水補足至50μL。反應(yīng)條件：94℃4min；94℃30s→54℃30s→72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min；4℃5min。B.5序列測定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用DNA純化回收試劑盒回收600bp大小的片段，與T-載體(TakarapMD-19T)連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5ɑ感受態(tài)細胞中，然后在含有Amp，IPTG,X-Gal的LB平板上進行藍白斑篩選，并進行菌落PCR篩選出陽性克隆，陽性克隆送至相關(guān)基因測序單位采DB42/T2227.1—2024用通用測序引物（RV-M：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG/M13-47：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC）進行雙B.6序列分析測序所得的序列通過拼接，去掉載體本身的序列后在NCBI（/BLAST）數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站進行比對，待測菌種與數(shù)據(jù)庫中某菌的序列同源性達到97%以上時，判斷待測菌種與該已知菌歸屬同一個屬。當(dāng)待測菌株ITS序列與梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌或七妹羊肚菌對照標(biāo)準(zhǔn)種的ITS序列的相似性≥97%時，該測定菌株就是梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌或七妹羊肚菌等羊肚菌菌種。梯棱羊肚菌對照標(biāo)準(zhǔn)種ITS序列的GeneBank登錄號為MH545493.1，其堿基序列是：ATCATTACCAAGAACCACACAGAAAAGGGCAGCCGAGGGGCCACCAGGGCTAGTAGCTTTACGTTGTTGAACGTCCTGGCCGGACCCGGAGCCGCCCCCATCTAAACCCTCTGCGTACCTGTCCCGCCTTGCTTCCCCCGGCTACCCGCTGGGGGGAGGAACAACAACCAAAACTCTTTGTGAACAAGCCGACGTCAGAATCATAACAAAACAAAAAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCCACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAAAAACCTCCTCCCCCATCGGGTTTGATTACTATCGTTGGGGGGTTTTGGCCTAATGGGATAGCGATTGGCAATTAGTTTCCCAATGTCCTAAATAGACGTAGACCCGCCTCCAGATGCGACAGCACCGAGGCCATCAACCGTGGAGTTATGGGATATATAGGCTTGCAGTAAAATGCTCACCTTTCTCCATACGCCGATGGCACACCGGTCGCAGTTGCGGGCGTAAATTGGAGCCCTTTTTTCAGGACCCTCGTGGCCTAGCATCCACCATACACAATTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA。六妹羊肚菌對照標(biāo)準(zhǔn)種ITS序列的GeneBank登錄號為OM956369.1，其堿基序列是：CCTCCCGATGAGGGGGGCCTGCGGAAGGATCATTACCAAGAACCACACAGAAAAGGGCTGCTATAGGGGCCGGCAGGGCTAGTAGCTTTACGTTGTTGAACGTCCTGTTTGGACCCGTTGGCAGCCCCCATCTAAACCCTCTGCGTACCTGTCCCCCCTTGCTTCCCCCGGCACCTCGCTGGGGGGAGGAACAACAACCAAAACTCTTTGTGAACAAACAGACGTCAGAATTACAAAAACAAAAAAAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCCACATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAAAAACCTCCTCCCCCTTCGGGTTTGATTACTATCGTTGGGGGGTTTTGGCCTAATGGGATAGCGATTGGCAATTAGTTTCCCAATGTCCTAAATAGACGTAGACCCGCCTCCAGATGCGACAGCACCGAGGCCATCAACCGTGGAGTTATGGGATATATAGGCTTGCAGTAAAATGCTCACCTTTCTCCATACGCCGATGGCACACCGGTCGCAGTTGCGGGCGTAAATTGGAGTCCTCTTCAGGACCCTCGTGGCCTAGCATCCACCATACATAATTGACCTCGGATCAGGTAG。七妹羊肚菌對照標(biāo)準(zhǔn)種ITS序列的GeneBank登錄號為JQ618758.1，其堿基序列是：TGCGGAAGGATCATTACCAAGAACCACACAGAAAAGGGCAGCCGAGGGGCCAACCAGGGCTAGTAGCTTTACGTTGTTGAACGTCCTGGAACGGACCCGGAGCCGCCCCCATCTAAACACTCTGCGTACCCATCCCACCTTGCTTCCCCCGGCCATCCGCT