ICS65.202

B61

DB35

福建省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB35/T1927—2020

獼猴桃無(wú)病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticeforpropagationofvirus-freekiwifruitnurserystock

2020-09-29發(fā)布2020-12-29實(shí)施

福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB35/T1927—2020

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義........................................................................1

4病毒的檢測(cè)........................................................................1

5無(wú)病毒母株的獲取..................................................................1

6無(wú)病毒母本園的建立與管理..........................................................2

7無(wú)病毒苗木的繁育..................................................................3

8無(wú)病毒苗木的質(zhì)量要求及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)....................................................4

9無(wú)病毒苗木的標(biāo)識(shí)與包裝............................................................4

附錄A（資料性附錄）獼猴桃病毒PCR檢測(cè)法............................................5

I

DB35/T1927—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所、柘榮縣迦百農(nóng)種植專(zhuān)業(yè)合作社。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳義挺、馮新、賴瑞聯(lián)、高敏霞、陳文光、陳婷、吳如健、林鳳嵐。

II

DB35/T1927—2020

獼猴桃無(wú)病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了獼猴桃無(wú)病毒苗木的病毒的檢測(cè)、無(wú)病毒母株的獲取、無(wú)病毒母本園的建立與管

理、無(wú)病毒苗木的繁育、無(wú)病毒苗木的質(zhì)量要求及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、無(wú)病毒苗木的標(biāo)識(shí)與包裝。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于福建省栽培的獼猴桃品種的無(wú)病毒苗木的繁育。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T2828.10計(jì)數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序第10部分：GB/T2828計(jì)數(shù)抽樣檢驗(yàn)系列標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)則

GB19174—2010獼猴桃苗木

DB35/T935—2009建寧獼猴桃育苗技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

無(wú)病毒母株virus-freemotherplant

通過(guò)病毒脫除處理或直接篩選獲得的、經(jīng)檢測(cè)并確認(rèn)不攜帶本文件規(guī)定的病毒的植株。

3.2

無(wú)病毒苗木virus-freeseedling

未攜帶有本文件規(guī)定的病毒的獼猴桃苗木。

3.3

無(wú)病毒母本園virus-freemotherblock

用于提供獼猴桃無(wú)病毒母株保存的圃地。

4病毒的檢測(cè)

4.1病毒的種類(lèi)

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的獼猴桃病毒包括：獼猴桃病毒A（ActinidiavirusA，AcVA）、獼猴桃病毒B（Actinidia

virusB，AcVB）、獼猴桃病毒X（ActinidiavirusX，AVX）、黃瓜壞死病毒（Cucummbernecrosisvirus，

CNV）、苜?；ㄈ~病毒（Alfalfamosaicvirus，AMV）、櫻桃卷葉病毒（CherryLeafRollvirus，CLRV）、

長(zhǎng)葉車(chē)前草花葉病毒（RibgrassMosaicvirus，RMS）、天竺葵帶狀斑點(diǎn)病毒（Pelargoniumzonatespot

virus，PZSV）和柑橘葉斑駁病毒（Citrusleafblotchvirus，CLBV）。

1

DB35/T1927—2020

4.2病毒的檢測(cè)

參見(jiàn)附錄A。

5無(wú)病毒母株的獲取

5.1脫毒材料的選擇

選擇品種純正、經(jīng)觀察未發(fā)現(xiàn)病毒病癥狀且生長(zhǎng)健壯、性狀優(yōu)良的植株，參照4.2的方法進(jìn)行病毒

檢測(cè)，確定不攜帶4.1規(guī)定的病毒的可作為無(wú)病毒母株；經(jīng)檢測(cè)，確定植株已感染4.1規(guī)定的病毒，則應(yīng)

進(jìn)行脫毒處理，病毒脫除后培育的獼猴桃植株，經(jīng)檢測(cè)為無(wú)病毒的，也可作為無(wú)病毒母株。

5.2病毒的脫除

5.2.1熱處理脫毒法

在春秋季節(jié)且氣溫為20℃～25℃時(shí)，將2～3年生獼猴桃營(yíng)養(yǎng)缽苗移入溫室，調(diào)節(jié)溫度至30℃預(yù)

培養(yǎng)3d；之后每天增加1℃，達(dá)到45℃時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)進(jìn)行熱處理；熱處理20d后，每株切取新抽發(fā)嫩

梢頂端0.8cm～1.5cm的部位10個(gè)，采用舌接法嫁接到無(wú)病毒獼猴桃砧木上。溫室濕度保持在60%～80%。

成活后全部參照4.2的方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，確認(rèn)病毒脫除后可作為無(wú)病毒母株材料保存。

5.2.2莖尖培養(yǎng)脫毒法

5.2.2.1外植體獲取和消毒

從生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的獼猴桃樹(shù)上剪取新梢頂端2cm～3cm長(zhǎng)的部位作為外植體，用70%酒精消

毒35s后，用0.1%氯化汞溶液浸泡滅菌4min，無(wú)菌水沖洗4～5次。

5.2.2.2外植體接種與初代培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境中，在解剖鏡下，剝除外植體的幼葉和外部葉原基，留下約（0.1±0.05）cm的莖尖分

生組織，接種于分化培養(yǎng)基（MS+1.5mg/LZT+0.5mg/LIBA，pH5.8，附加7.0g/L瓊脂和3.0%蔗糖），

在溫度（25±1）℃、光照2000Lx、光周期為12h光/12h暗的條件下進(jìn)行初代培養(yǎng)，40d后分化

出新芽。

5.2.2.3增殖培養(yǎng)和病毒檢測(cè)

將新芽接種于增殖培養(yǎng)基（MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIBA，pH5.8，附加7.0g/L瓊脂和3.0%蔗糖），

培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同，每35d轉(zhuǎn)接繼代1次，共需要9次。獲得的所有獼猴桃試管苗應(yīng)進(jìn)行病毒的初

次檢測(cè)，剔除帶病毒植株。

5.2.2.4生根培養(yǎng)

以不帶病毒的增殖苗為材料，切取1.5cm～2cm長(zhǎng)的嫩梢轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.7mg/LIBA，

pH5.8，附加7.0g/L瓊脂和3.0%蔗糖），在（25±1）℃條件下培養(yǎng)20d進(jìn)行生根和壯苗。

5.2.2.5煉苗和移栽

煉苗：選擇生長(zhǎng)健壯、苗高3cm、根數(shù)3條以上的組培苗，松開(kāi)瓶蓋置于60%～80%遮光率的蔭棚內(nèi)，

期間控制蔭棚內(nèi)溫度（25±1）℃，采用噴霧灑水保持濕度70%～90%，放置3d～5d。隨后，打開(kāi)瓶

蓋，采用噴霧灑水保持濕度60%～80%，光照增強(qiáng)至3000Lx～4000Lx，繼續(xù)煉苗3d～5d。

2

DB35/T1927—2020

移栽：將組培苗根部培養(yǎng)基洗去，移栽至含有園土和泥炭土（體積比1:1）混合基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽（口

徑×高為16cm×16cm），澆透水，置于覆蓋60目防蟲(chóng)網(wǎng)的溫網(wǎng)室內(nèi)，在營(yíng)養(yǎng)缽上覆蓋塑料薄膜，期間

及時(shí)噴水以保持莖葉濕潤(rùn)，15d后揭去薄膜。

6無(wú)病毒母本園的建立與管理

6.1地點(diǎn)

圃地所在區(qū)域應(yīng)為非獼猴桃潰瘍病發(fā)生區(qū)與獼猴桃適栽區(qū)。選擇疏松肥沃、排水良好、微酸性的砂

質(zhì)壤土，且5年內(nèi)未栽植過(guò)果樹(shù)的地塊。全圃采用60目防蟲(chóng)網(wǎng)覆蓋，圃地只設(shè)一個(gè)出入口且配置緩沖區(qū)，

與其他果園或苗圃距離大于2km。

6.2無(wú)病毒母株的種植

經(jīng)檢測(cè)確定不攜帶4.1規(guī)定的獼猴桃病毒，或經(jīng)5.2獼猴桃病毒脫除的植株可作為無(wú)病毒母株栽種，

株行距為3m×4m。

6.3無(wú)病毒母本園的管理

每月定期觀察圃內(nèi)獼猴桃無(wú)病毒母株是否有病毒病癥狀，每年春梢萌發(fā)后10d進(jìn)行病毒檢測(cè)，經(jīng)檢

測(cè)，淘汰不符合3.2定義的植株。

7無(wú)病毒苗木的繁育

7.1組培苗培育

7.1.1外植體獲取、消毒和初代培養(yǎng)

參照5.2.2.1和5.2.2.2的方法。

7.1.2增殖培養(yǎng)

將新芽接種于增殖培養(yǎng)基（MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIBA，pH5.8，附加7.0g/L瓊脂和3.0%蔗糖），

培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)相同，每35d轉(zhuǎn)接繼代1次。

7.1.3生根和壯苗培養(yǎng)

參照5.2.2.4的方法。

7.1.4煉苗和移栽

參照5.2.2.5的方法。

7.1.5苗圃培育

選擇疏松肥沃、排灌水方便、光照良好、冬春季無(wú)霜凍的地塊作為苗圃地；冬春季有霜凍的區(qū)域，在

溫室大棚建立苗圃。將成活的無(wú)病毒苗木連同營(yíng)養(yǎng)缽放到苗圃中培養(yǎng)。苗木的管理參照DB35/T935—2009

的要求執(zhí)行。

3

DB35/T1927—2020

7.2嫁接苗培育

7.2.1砧木準(zhǔn)備

選擇生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的，參照4.2的方法檢測(cè)后不攜帶病毒、莖粗達(dá)0.6cm以上的獼猴桃砧木

苗，嫁接前砧木苗摘心，并去除基部萌蘗。

7.2.2嫁接

7.2.2.1接穗選擇

取生長(zhǎng)健壯、芽體飽滿、無(wú)病害的當(dāng)年生木質(zhì)化的獼猴桃無(wú)病毒母株枝條，掛牌標(biāo)記母株編號(hào)。冬

季剪下的接穗，應(yīng)立即放在陰涼處，用2%濕沙埋藏備用。

7.2.2.2嫁接時(shí)間與方法

冬季落葉后到傷流期前10d，采用切接法把接穗嫁接到獼猴桃無(wú)病毒砧木上，用1.0cm～1.5cm

寬的塑料薄膜纏繞，只露出接芽。嫁接位置距地面10cm～15cm，按品種及母株編號(hào)分別嫁接并記載，

并做好嫁接苗的防凍措施。

7.2.2.3嫁接苗管理

嫁接后及時(shí)灌水、施肥、摘心和病蟲(chóng)害防控。及時(shí)抹除砧木上的萌蘗。當(dāng)接穗抽出10cm～20cm

新梢時(shí)，選留1條生長(zhǎng)良好的粗壯枝，抹除其他枝條。成苗后，嫁接苗管理應(yīng)按照DB35/T935—2009的

要求執(zhí)行。

8無(wú)病毒苗木的質(zhì)量要求及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

8.1質(zhì)量要求與保證

苗木出圃前，定期觀察獼猴桃苗木形態(tài)特征，剔除有病毒病癥狀的植株。病毒脫除的獼猴桃苗木出

圃前，每批次應(yīng)進(jìn)行1次病毒檢測(cè)，按照GB/T2828.10規(guī)定的方法進(jìn)行抽檢。若檢測(cè)出攜帶病毒，應(yīng)根

據(jù)標(biāo)記，追蹤其母株并進(jìn)行病毒檢測(cè)。若母株也攜帶病毒，則立即清除該母株及其周邊臨近的植株；若

母樹(shù)不帶病毒，則立即清除攜帶病毒的苗木及其周邊臨近植株。

8.2苗木分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

獼猴桃無(wú)病毒苗木的分級(jí)應(yīng)按照GB19174—2010的要求執(zhí)行。

9無(wú)病毒苗木的標(biāo)識(shí)與包裝

9.1標(biāo)識(shí)

獼猴桃無(wú)病毒母株標(biāo)簽應(yīng)包括品種、母株編號(hào)、病毒檢測(cè)單位、母株培育單位等信息。獼猴桃無(wú)病

毒苗木標(biāo)簽應(yīng)包括品種、等級(jí)、株數(shù)、病毒檢測(cè)單位、生產(chǎn)單位、地址等信息。

9.2包裝

獼猴桃無(wú)病毒苗木應(yīng)按照品種和等級(jí)分別包裝。包裝內(nèi)外應(yīng)附有苗木標(biāo)簽。

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DB35/T1927—2020

AA

附錄A

（資料性附錄）

獼猴桃病毒PCR檢測(cè)法

A.1范圍

本附錄提供的PCR檢測(cè)法適用于已知核酸序列的獼猴桃病毒的檢測(cè)。

A.2原理

PCR是一種體外擴(kuò)增特異DNA序列的技術(shù)。獼猴桃病毒檢測(cè)時(shí)，首先解析已知病毒核酸序列并設(shè)計(jì)PCR

擴(kuò)增引物，然后提取待檢測(cè)植株核酸并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)電泳條帶的有無(wú)或擴(kuò)增獲得的核酸序列測(cè)序，

判斷植株是否攜帶病毒。

A.3儀器設(shè)備

所需要的儀器設(shè)備包括：

a)高速冷凍離心機(jī)；

b)移液器；

c)PCR儀；

d)電泳儀；

e)凝膠成像儀；

f)恒溫水浴鍋。

A.4試劑

所需要的試劑包括：CTAB裂解液、β-巰基乙醇、液氮、苯酚、氯仿、異戊醇、蒸餾水、氯化鋰、

無(wú)水乙醇、dNTP、RNA酶、AMV-RT緩沖液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、磷酸緩沖液、核

酸染料。

A.5病毒檢測(cè)

A.5.1總RNA提取

總RNA提取步驟如下：

a)1.5mL離心管中加入1mLCTAB裂解液和20μLβ-巰基乙醇，于65℃中預(yù)熱；

b)稱(chēng)取0.1g待檢測(cè)植株葉片于液氮中迅速研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的裝有CTAB裂解

液的離心管中，渦旋30s，65℃溫浴20min，期間顛倒混勻2～3次；

c)加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇混合液（V:V:V=25:24:1），顛倒混勻，4℃、12000rpm條

件下離心15min；

5

DB35/T1927—2020

d)移上清液至新離心管中，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇混合液（V:V:V=25:24:1），重復(fù)步驟

c）一次；

e)移上清液至新離心管中，加入等體積的氯化鋰溶液（8M），顛倒混勻，-20℃沉淀2h；

f)4℃、12000rpm條件下離心10min，棄上清，加入500μL無(wú)水乙醇，靜置5min；

g)4℃、12000rpm條件下離心10min，棄上清，加入500μL75%乙醇清洗管底沉淀；

h)倒掉乙醇并吸干殘留液體，風(fēng)干10min，用50μL無(wú)RNA酶水溶解沉淀，檢測(cè)總RNA完整性

和濃度。合格后，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

A.5.2cDNA合成

0.2mL的離心管中依次加入30ng～50ng總RNA、1μL的dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各

為2.5mmol/L）、0.5μL隨機(jī)引物（50μmol/L）、0.5μLoligod（T）18（50μmol/L），無(wú)菌蒸

餾水定容至14.5μL。65℃處理5min后取出置于冰上冷卻2min。再加入4μL的5×AMV-RT緩沖液、

0.5μLRNA酶抑制劑、1μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶，混合均勻后37℃處理2h合成cDNA，然后70℃處理15min

以去除殘余酶活性。

A.5.3PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組成：熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶1U、10×PCR緩沖液2μL、cDNA模板1μL，上下游

引物各0.4μmol/L，補(bǔ)足無(wú)菌蒸餾水至終體積25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變

性30s，TM退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次；72℃繼續(xù)延伸5min（PCR擴(kuò)增引物序列與擴(kuò)增產(chǎn)物

大小參照表A.1）。

表A.1PCR引物序列與擴(kuò)增產(chǎn)物大小

病毒名稱(chēng)參考引物序列（5’-3’）產(chǎn)物/bp

F：ATGATGGGGTGTTCTATGGGTGGCT

獼猴桃病毒A269

R：CTCATTCTCCAMCCRCARAAGAG

F：AATTCGGACCACTCCTGAGGC

獼猴桃病毒B529

R：CTCATTCTCCAMCCRCARAAGAG

F：CCTGAATTGAAAACCTTTGCTGCCACTT

獼猴桃病毒X175

R：TAGAAAAACCACACTAACCCGGAAATGC

F：AAGGGTAAGGATGGTGAGGA

黃瓜壞死病毒587

R：TTTGGTAGGTTGTGGAGTGC