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T/CVDA

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVDAXXXXX—XXXX

獸用蛋白質(zhì)納米顆粒（如VLPs）疫苗的質(zhì)

控檢測技術(shù)

Qualitycontroltestingtechnologyofprotein-basednanoparticles(suchasVLPs)for

animalvaccines

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國獸藥協(xié)會發(fā)布

T/CVDAXXXXX—XXXX

獸用蛋白質(zhì)納米顆粒（如VLPs）疫苗的質(zhì)控檢測技術(shù)

1范圍

本文件規(guī)定了獸用蛋白質(zhì)納米顆粒（如VLPs）疫苗的技術(shù)要求、檢測方法、檢測規(guī)則和結(jié)果判定

等標(biāo)準(zhǔn)。

本文件適用于獸用蛋白質(zhì)納米顆粒（如VLPs）疫苗的質(zhì)量評估。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

《中華人民共和國獸藥典》（2020年版）

《中華人民共和國藥典》（2020年版）

《獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽查檢驗(yàn)管理辦法》

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1獸用蛋白質(zhì)納米顆粒（如VLPs）疫苗protein-basednanoparticlesforanimalvaccines(suchasVLPs)

獸用蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗的核心組分是抗原蛋白質(zhì)和佐劑，其中抗原蛋白質(zhì)須經(jīng)組裝形成蛋白質(zhì)納

米顆粒（如VLPs）。

獸用蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗應(yīng)用于豬牛羊馬、禽類、水產(chǎn)和寵物等動(dòng)物疫病防治。

3.2病毒樣顆粒virus-likeparticles（VLPs）

病毒樣顆粒是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成，模擬真實(shí)的天然病毒結(jié)構(gòu)，但不含病毒遺傳物質(zhì)，具有安全

性高、免疫效果好、成本低廉等優(yōu)勢，可應(yīng)用于候選疫苗的研制[1][2]。

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3.3佐劑adjuvant

按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》（三部）生物制品通則“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料

質(zhì)量控制規(guī)程”定義：“佐劑是與一種疫苗抗原結(jié)合以增強(qiáng)【如加強(qiáng)、加快、延長和（或）可能的定向】

其特異性免疫反應(yīng)和疫苗臨床效果的一種或多種成分混合的物質(zhì)?！?/p>

4符號和縮略語

下列縮略語適用于本文件。

VLPs：病毒樣顆粒（virus-likeparticles）

SDS：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel

electrophoresis,SDS）

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）

nm：納米

mg：毫克

μL：微升

mL：毫升

mg/mL：毫克每毫升

min：分鐘

℃：攝氏度

5技術(shù)要求

5.1基本要求

檢測用材料試劑、器械及設(shè)備等應(yīng)符合《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》的有關(guān)要求。

5.2獸用蛋白質(zhì)納米顆?？乖瓉碓纯刂?/p>

獸用蛋白質(zhì)納米顆?？乖ㄈ鏥LPs）主要成分是蛋白質(zhì)，可以利用多種蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)【包括大

腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、HEK293（人胚胎腎細(xì)胞系）表達(dá)系統(tǒng)、CHO

細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）、Vero細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等】進(jìn)行制備。

5.3佐劑來源控制

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獸用疫苗佐劑品類眾多，針對不同獸用蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗可以選擇不同類型佐劑進(jìn)行適當(dāng)配比混

合，使用原料應(yīng)符合《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（三部）附錄“3009獸用生物制品生產(chǎn)

用原材料及輔料的一般要求”。

5.4關(guān)鍵質(zhì)量屬性要求

5.4.1純凈

應(yīng)無菌生長，應(yīng)無支原體生長，應(yīng)無外源病毒污染。

5.4.2濃度

抗原蛋白質(zhì)濃度應(yīng)符合產(chǎn)品說明書和內(nèi)裝標(biāo)簽【主要成分與含量】對每頭份疫苗中抗原含量的規(guī)定，

總蛋白濃度（包括抗原蛋白和非抗原蛋白）一般應(yīng)不高于0.5mg/ml。

5.4.3純度

抗原蛋白質(zhì)純度應(yīng)占總蛋白（包括抗原蛋白和非抗原蛋白）含量不低于50%。

5.4.4分子量大小

抗原蛋白質(zhì)單體分子量大小需要基本符合理論大小，蛋白質(zhì)納米顆粒分子量需基本符合理論大小。

5.4.5形態(tài)結(jié)構(gòu)

在透射電子顯微鏡觀察下，蛋白質(zhì)納米顆粒一般為形態(tài)規(guī)整、邊界清晰、結(jié)構(gòu)完整穩(wěn)定的顆粒。

5.4.6粒徑

蛋白質(zhì)納米顆粒粒徑一般為10nm~200nm[3][4]。

5.4.7蛋白質(zhì)納米顆粒組裝效率

蛋白質(zhì)納米顆粒應(yīng)占比總抗原蛋白質(zhì)含量（包括納米顆粒蛋白質(zhì)抗原和非納米顆粒蛋白質(zhì)抗原）不

低于50%。

5.4.8安全性評價(jià)

免疫動(dòng)物一般無局部或全身不良反應(yīng)。個(gè)別動(dòng)物接種疫苗后，局部可能出現(xiàn)輕度腫脹，體溫輕度升

高，1~3日后恢復(fù)正常。

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5.4.9血清學(xué)抗體反應(yīng)

單劑量免疫接種一般不低于14天產(chǎn)生特異性抗體。

6檢測方法

6.1純凈檢測

無菌檢測：按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（三部）附錄“3306無菌檢測或純粹檢測

法”進(jìn)行檢測。

支原體：按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（三部）附錄“3308支原體檢測法”進(jìn)行檢

測。

外源病毒檢測：按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（三部）附錄“3305外源病毒檢測法”

進(jìn)行檢測。

6.2濃度檢測

按照BCA商品化試劑盒說明書方法，測定蛋白（包括抗原蛋白質(zhì)和非抗原蛋白質(zhì)）濃度。根據(jù)“6.3：

純度檢測”結(jié)果，計(jì)算得到抗原蛋白質(zhì)濃度。

6.3純度檢測

按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（一部）附錄“0541電泳法”的第五法—SDS-聚丙

烯酰氨凝膠電泳法，檢測抗原蛋白質(zhì)占比總蛋白的純度。

6.4分子量大小檢測

按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（一部）附錄“0541電泳法”的第五法——SDS-聚

丙烯酰胺凝膠電泳法，根據(jù)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷抗原蛋白質(zhì)單體分子量大小。

蛋白質(zhì)納米顆粒分子量，可利用多角度激光散射技術(shù)(Multi-AngleLaserLightScattering,MALLS)

進(jìn)行檢測。MALLS是一種基于激光散射原理的分析儀器，能夠直接、精確地測量溶液中生物大分子的

分子量，MALLS通常與高效液相尺寸排阻色譜聯(lián)用，對蛋白質(zhì)納米顆粒的分子量大小及分子量分布進(jìn)

行檢測[5]。

6.5形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測

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取蛋白質(zhì)樣品10~20μL，滴加于銅網(wǎng)膜上，靜置3~10min后，用1%~2%磷鎢酸負(fù)染3~10min，干燥

后通過透射電鏡下觀察，評價(jià)蛋白質(zhì)納米顆粒微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，可使用差示掃描量熱法補(bǔ)充評價(jià)

蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗的穩(wěn)定性[6]。

6.6粒徑檢測

取適量蛋白質(zhì)樣品，可按《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（一部）附錄“0982粒度和粒

度分布測定法”的第三法——光散射法等進(jìn)行檢測。

6.7組裝效率檢測

取適量樣品，按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（一部）附錄“0512高效液相色譜法”

或附錄“0514分子排阻色譜”方法進(jìn)行分析，亦可聯(lián)用多角度激光散射檢測技術(shù)對蛋白質(zhì)納米顆粒分

子量大小和分布做補(bǔ)充分析[7]，得到蛋白質(zhì)顆粒組裝效率應(yīng)不低于50%。

6.8安全性評價(jià)

按照《中華人民共和國獸藥典（2020年版）》（三部）附錄“3010獸用生物制品安全檢測的通用

要求”執(zhí)行。

具體可選用方法（1）或方法（2）：

（1）用小鼠、豚鼠或其他替代動(dòng)物檢測，選取適量體重、日齡、數(shù)量的動(dòng)物，按照疫苗使用方法

進(jìn)行免疫（注射、口服或噴鼻等），觀察7~14日，應(yīng)全部健活。

（2）用本體動(dòng)物檢測，按照疫苗安全檢測方法進(jìn)行檢測，觀察免疫動(dòng)物的臨床指標(biāo)，包括但不限

于體重增長、體溫監(jiān)測、局部或全身不良反應(yīng)，接種部位不存在（包括但不限于肌肉纖維壞死、結(jié)締組

織增生等）病理學(xué)變化。不得出現(xiàn)因接種疫苗引起的死亡及明顯的不良反應(yīng)。

6.9抗體反應(yīng)評價(jià)

血清特異性抗體與抗原蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，可通過ELISA進(jìn)行評價(jià)，具體操作方法可根據(jù)不同的實(shí)

驗(yàn)室體系進(jìn)行調(diào)整，可通過包被合適濃度的抗原蛋白質(zhì)，再先后進(jìn)行封閉、血清孵育和酶標(biāo)二抗孵育，

再通過顯色液顯色和終止液終止，根據(jù)酶標(biāo)儀測得吸光值來評價(jià)血清特異性抗體與抗原蛋白質(zhì)的反應(yīng)活

性。

7檢測規(guī)則和結(jié)果判定

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7.1檢驗(yàn)規(guī)則

7.1.1組批

以相同材料、相同生產(chǎn)工藝、連續(xù)生產(chǎn)或同一批次生產(chǎn)的產(chǎn)品為一組批。

7.1.2采樣

按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第645號文件《獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽查檢驗(yàn)管理辦法》執(zhí)行。

7.1.3檢測項(xiàng)目

每批制品均按本文件6.1~6.9所列方法進(jìn)行檢測，包括純凈、濃度、純度、分子量大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、

粒徑、組裝效率、安全性評價(jià)和效力評價(jià)共九個(gè)項(xiàng)目。

7.2結(jié)果判定

所有檢測項(xiàng)目結(jié)果均符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定指標(biāo)，則判定該批產(chǎn)品屬于獸用蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗。

如果檢測項(xiàng)目有任何一項(xiàng)不符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則從原批次重新隨機(jī)加倍抽樣，所有檢測項(xiàng)目重新復(fù)

驗(yàn)。若復(fù)驗(yàn)結(jié)果有任何一項(xiàng)不符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判定該批產(chǎn)品不屬于獸用蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗。

參考文獻(xiàn)

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ExpertRevVaccines.2010;9(10):1149-1176.

[2]HuangX,WangX,ZhangJ,XiaN,ZhaoQ.Escherichiacoli-derivedvirus-likeparticlesinvaccine

development.NPJVaccines.2017;2:3.

[3]WangD,YuanY,LiuB,EpsteinND,YangY.Protein-basednano-vaccinesagainstSARS-CoV-2:Current

designstrategiesandadvancesofcandidatevaccines.IntJBiolMacromol.2023;236:123979.

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NatRevImmunol.2010;10(11):787-796.

[5]徐嫄，楊延麗，鄒興啟，李翠，朱元源，秦義嫻，李琰，盛亞男，劉業(yè)兵，彭國瑞，徐小艾，張松

平，趙啟祖.應(yīng)用高效體積排阻色譜偶聯(lián)多角度激光散射鑒定豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗及病毒樣顆粒疫

苗抗原[J].生物工程學(xué)報(bào).2022;38(8):2948-2958.

[6]YangY,ZhaoQ,LiZ,SunL,MaG,ZhangS,SuZ.Stabilizationstudyofinactivatedfootandmouth

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