[19]中華人民共和國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局[21]申請(qǐng)?zhí)?2139960.3[43]公開日2003年7月16日 [11]公開號(hào)CN1429844A[54]發(fā)明名稱檢測或測定3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿(MDMA)的方法和試劑盒本發(fā)明描述一種在MDMA的N位置上用交聯(lián)劑衍生的半抗原。本發(fā)明提供一種含有前述結(jié)合劑賦予抗原性載體物質(zhì)上的半抗原，和含有前述的與可檢測試劑共價(jià)結(jié)合的半抗原的綴合物。另外，本發(fā)明還涉及對(duì)抗前述免疫原產(chǎn)生抗體。最后，本發(fā)明涉及檢測或測定生物流體中MDMA和N-烷基化的亞甲基二氧基苯異丙胺的方法和試劑盒。本發(fā)明的抗體不與苯異丙胺和脫氧麻黃堿發(fā)生明顯的交叉反寸◎OZU知識(shí)產(chǎn)權(quán)出版社出版02139960.3權(quán)利要求書第1/2頁21.一種如下通式的免疫原：510其中，交聯(lián)劑包括-R-X,R是二價(jià)連接基團(tuán)和X是末端基團(tuán)，且其中W?是賦予抗原性載體物質(zhì)。2.一種如下通式的綴合物：其中，交聯(lián)劑包括-R-X,R是二價(jià)連接基團(tuán)和X是末端基團(tuán)，且其中20W?是可檢測的標(biāo)記試劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的免疫原或綴合物，其中R包含：其中Z是取代的或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基部分或取代或未取代的亞芳基，優(yōu)選亞苯基，部分；Y是取代或未取代的、25直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基部分；a是0或1且b是件是a和b不能同時(shí)為0。4.根據(jù)權(quán)利要求3的免疫原或綴合物，其中b是0,a是1,和Z是C?-6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基部分。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的免疫原或綴合物，其中Z是C3-4未取代的、30直鏈、飽和的亞烷基部分。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的免疫原或綴合物，其中X選自羧酸或3其酯、胺、馬來酰亞胺、鹵代羧酸或其酯、硫代羧酸或其酯、醛、吡啶基二硫醇或乙烯基砜部分。7.根據(jù)權(quán)利要求6的免疫原或綴合物，其中X選自羧酸(-COOH)、胺(-NH?)和硫代羧酸酯(-S-CO-CH?)。58.根據(jù)權(quán)利要求1和3-7任意一項(xiàng)的免疫原，其中載體物質(zhì)是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成的多肽或半合成的多肽。9.對(duì)抗根據(jù)權(quán)利要求1和3-8任意一項(xiàng)的免疫原產(chǎn)生的抗體，所述抗體能夠與3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)表位結(jié)合，優(yōu)選與10.制備權(quán)利要求9的抗體的方法，該方法包括通過重復(fù)給予根據(jù)權(quán)利要求1和3-8任意一項(xiàng)的免疫原免疫動(dòng)物，優(yōu)選脊椎動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，和收集從免疫動(dòng)物得到的血清的步驟。11.根據(jù)權(quán)利要求2-7任意一項(xiàng)的綴合物，其中標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)包括用根據(jù)權(quán)利要求2-7或11任意一項(xiàng)的綴合物或其混合物和用根據(jù)權(quán)利盒包括根據(jù)權(quán)利要求2-7或11任意一項(xiàng)的綴合物或其混合物以及根據(jù)權(quán)利要求9的抗體或其混合物。14.根據(jù)權(quán)利要求2-7或11任意一項(xiàng)的綴合物或其混合物的用途，用根據(jù)權(quán)利要求9的抗體或其混合物檢測或測定試樣如生物流體中MDMA及其02139960.3說明書第1/15頁4檢測或測定3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿(MDMA)的方法和試劑盒5本發(fā)明涉及一種檢測或測定MDMA(3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿(methylenedioxymethamphetamine))及其亞甲基二氧基(methylenedioxy)類似物的方法和試劑盒?！皺z測”的意思是對(duì)物質(zhì)存在或不存在的定性分析?！皽y定”的意思是對(duì)物質(zhì)的量的定量分析?！皝喖谆趸愃莆铩钡囊馑际莵喖谆趸疆惐?MDA)的N-(一-或二-)烷基化(例如，N-甲基化或N-乙基化)衍生物。原性的載體物質(zhì)(antigenicity-conferringcarriermateria1)或標(biāo)記劑共價(jià)連接的半抗原，以便分別產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原或綴合物(conjugate)。本發(fā)明還描述了對(duì)于這些免疫原產(chǎn)生的抗體如何用于展開特異性試驗(yàn)，該類似物鑒定研制中。(methylenedioxyethylamphetamine)(MDEA)有交叉反應(yīng)。本發(fā)明的方法和02139960.3說明書第2/15頁5變化。極其頻繁地使用的各種秘密產(chǎn)品的化合物是3,4-亞甲基二氧基脫氧2),也稱為Eve,和3,4-亞甲基二氧基苯異丙胺(MDA,3)。這些化合物主要對(duì)5-羥色胺系統(tǒng)，其次對(duì)多巴胺系統(tǒng)發(fā)揮它們的作用。亞甲基二氧基苯10們能引起許多不利作用和并發(fā)癥已經(jīng)逐漸顯著,它們中的一些能夠?qū)е轮旅慕Y(jié)果。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MDMA和MDA會(huì)損害迄今為止所有經(jīng)過實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的5-羥色胺神經(jīng)元，且更嚴(yán)重的是人類使用者有5-羥色胺神經(jīng)毒性的危險(xiǎn)，特別是在大劑量重復(fù)使用藥物之后。昂貴且作為篩選工具使用消耗時(shí)間。特異性的結(jié)合反應(yīng)，如抗體-抗原相互作用，已經(jīng)廣泛地用于免疫測定來檢測生物流體中存在的各種物質(zhì)。20因此，例如，放射免疫測定能夠用于測定MDMA及其亞甲基二氧基類似及其亞甲基二氧基類似物。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種已知的用于各種苯異丙胺衍生物定25性和半定量測定的非放射性替代方法。但是，技術(shù)人員能夠理解苯異丙胺驗(yàn)室)描述了通過熒光偏振免疫測定檢測和測定苯異丙胺的試劑、方法和試劑盒。EP0399184A2由各種苯異丙胺制備半抗原，免疫原和抗體，它們30劑以高于加入的MDMA、MDEA和MDA的濃度計(jì)算所表現(xiàn)的交叉反應(yīng)性低于30%(見表2)。另外，EP-A-820984描述的制備苯異丙胺和脫氧麻黃堿的半02139960.36及其亞甲基二氧基類似物含有與苯環(huán)稠合的亞甲基二氧基環(huán)。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種已知的用于苯異丙胺類的一般測定5的非放射性替代方法。特別地，Emit(注冊(cè)商標(biāo))IIPlusMonoclona1(Syva公司供給)和Cedia(注冊(cè)商標(biāo))DUA(Microgenetics/Roche供給)皆為對(duì)苯異丙胺的EIAs。當(dāng)相對(duì)D-脫氧麻黃堿100%時(shí)，對(duì)于MDMA(Cedia)各自的交叉反應(yīng)性為69%,對(duì)于MDMA為14.3%(當(dāng)相對(duì)于D,L-脫氧麻黃堿(Emit)為100%0xfordshire,0X144RU,英國)獲得的MDMA只是篩選檢測，它需要通過15而確認(rèn)。因此，當(dāng)與相對(duì)脫氧麻黃堿為100%比較，對(duì)于MDMA(758-1250%),MDEA(50-100%)和N-甲基-1-(3,4-亞甲基二氧基苯基)-2-丁胺(MBDB)(150-200%),Cozart脫氧麻黃堿EIA(2001年10月得到，now2010月得到，nowwithdrawn)顯示明顯的交叉反應(yīng)活性。這兩種Cozart檢測方法現(xiàn)在已經(jīng)被單獨(dú)的Cozart脫氧麻黃堿試劑盒代替，該試劑盒當(dāng)與脫氧麻黃堿顯示100%交叉反應(yīng)活性相比時(shí)，相對(duì)于MDMA顯示43-49%的交叉反對(duì)于各種上文提到的檢測方法的交叉反應(yīng)活性數(shù)據(jù)已經(jīng)相對(duì)于MDMA為25100%重新計(jì)算，并且這些數(shù)據(jù)按照?qǐng)D表的形式在下表中給出：7化合物苯異丙胺1-一-一一一一-一-一----一--一發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的一些或全部缺點(diǎn)，或者另外提供一基二氧基類似物數(shù)量的方法和試劑盒。本發(fā)明的目的是通過制備對(duì)MDMA及其亞甲基二氧基類似物高度特異性的、對(duì)d-苯異丙胺和(+)-脫氧麻黃堿的交叉反應(yīng)不明顯的抗體，克服缺乏于d-苯異丙胺和(+)-脫氧麻黃堿任何一個(gè))的交叉反應(yīng)活性當(dāng)相對(duì)于MDMA為100%時(shí)相比，少于大約7.5%,優(yōu)選低于大約5%,較優(yōu)選低于大約1%,更優(yōu)選低于大約0.5%,最優(yōu)選低于大約0.25%。為了達(dá)到這樣的特異性，15本發(fā)明優(yōu)選的具體例子的進(jìn)一步目的在于研制能夠結(jié)合結(jié)構(gòu)上的表02139960.38(crosslinker)置換(換句話說，衍生)。第一方面，本發(fā)明提供一種如下結(jié)構(gòu)的免疫原：其中，R是二價(jià)連接基團(tuán)和X是末端基團(tuán)(或W?銜接物(linker)),且其中W?是賦予抗原性的載體物質(zhì)。優(yōu)選地，載體物質(zhì)是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成的多肽或半合成的多肽。第二方面，本發(fā)明提供一種如下結(jié)構(gòu)的綴合物；其中R是二價(jià)連接基團(tuán)和X是末端基團(tuán)(或W?銜接物),且其中W?是可檢測的標(biāo)記試劑。優(yōu)選地，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或它們的混合物。更優(yōu)選地，標(biāo)記試劑是酶，優(yōu)選過氧化物酶，最優(yōu)選辣根過氧化物酶(HRP)。換句話說，或者附加地，發(fā)光物質(zhì)可以是生物發(fā)光物質(zhì)、25化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)。在第一和第二方案中的交聯(lián)劑是-R-X-。優(yōu)選地，R包含：其中Z是取代的或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基30部分(moiety)或取代或未取代的亞芳基，優(yōu)選亞苯基部分；Y是取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基部分；a是0或1且02139960.3說明書第6/15頁91,條件是a和b不能同時(shí)為0。換句話說，Z和Y中的一個(gè)或者Z和Y一直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基部分。5有利地，X在與W?或W?反應(yīng)前選自羧酸或其酯、胺、馬來酰亞胺、鹵代羧酸或其酯、硫代羧酸或其酯、醛、吡啶基二硫醇或乙烯基砜部分。另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)于本發(fā)明第一方面的免疫原產(chǎn)生的抗體，這性?？贵w對(duì)于結(jié)構(gòu)上相關(guān)的苯異丙胺和脫氧麻黃堿的交叉反應(yīng)活性應(yīng)低于10%,優(yōu)選低于5%。更優(yōu)選低于1%,最優(yōu)選低于0.5%。優(yōu)選地，將抗體固定在支撐底物上。優(yōu)選地，抗體是多克隆的?；蛘?，抗體是單克隆的。15本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備抗體的方法，該方法包含通過重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明的第一方面的免疫原免疫動(dòng)物，優(yōu)選脊椎動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，和收集從免疫動(dòng)物得到的血清的步驟。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括將所述血清抗體固定到支撐底物上，優(yōu)選固體支持物，最優(yōu)選聚苯乙烯固體支持物。按照這一方法制備的抗體是多克隆的。類似物的方法，該方法包括用本發(fā)明的綴合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物接觸試樣；檢測或測定結(jié)合的綴合物的數(shù)量；并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷試樣中MDMA及其亞甲基二氧基類似物的存在或數(shù)量。25劑盒，該試劑盒包括用本發(fā)明的綴合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物。該試劑盒可以任意地包括應(yīng)用所述綴合物和所述抗體在試樣中檢測優(yōu)選地，試樣是溶液，如生物流體。更優(yōu)選地，試樣是血清或尿。最30本發(fā)明的方法和試劑盒中，首選各自不同的交聯(lián)劑(免疫原的和綴合物02139960.3說明書第7/15頁半抗原衍生物N-(3-羧基丙基)MDMA(化合物7),N-(4-氨基丁基)MDMA(化合物9)和N-(3-乙?；虼?MDMA(化合物10)按照?qǐng)D-1的概要制備。首先從3,4-(亞甲基二氧基)苯乙酸(化合物4)用兩步制備3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿(化合物1):將化合物4與乙酸酐/吡啶反應(yīng)，接合物1依下各項(xiàng)獲得：半抗原715在催化劑碘化鉀的存在下，將化合物1與乙基-4-溴丁酸酯(bromobutyrate)在乙腈中回流反應(yīng)得到化合物6的酯。通過在四氫呋喃(THF)/水中用氫氧化鉀皂化化合物6后得到半抗原7,N-(3-羧基丙半抗原9半抗原1025(iodopropy1thioacetate)在乙醇中回流反應(yīng)制備得到半抗原10[N-(3`-02139960.3說明書第8/15頁血清蛋白，例如球蛋白、接目鏡蛋白和脂蛋白。說明性的蛋白質(zhì)載體包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛γ-球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)等等?；蛘?，可以應(yīng)用具有足夠數(shù)目有用的氨基如賴氨酸的合成的聚(氨基酸)、其它合成或天然的帶有反應(yīng)官能基的聚合物材料。特別是5能夠結(jié)合到半抗原產(chǎn)生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。每個(gè)半抗原也能夠共價(jià)連接標(biāo)記試劑，如酶(例如，辣根過氧化物酶),具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)或放射性標(biāo)記以產(chǎn)生綴合物(或檢測試劑)用于免疫檢測。熒光物質(zhì)可以是，例如一價(jià)的熒光素殘基或其衍生物。為了確認(rèn)載體物質(zhì)上結(jié)合有適當(dāng)?shù)陌肟乖?，在免疫前，使用矩陣輔助10紫外激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)對(duì)每個(gè)免疫對(duì)于優(yōu)選的載體物質(zhì)即牛血清白蛋白而言，優(yōu)選每摩爾載體最少6摩爾半用半抗原制備綴合物和免疫原時(shí)，如果其中存在巰基，例如半抗原10,馬來酰亞胺、鹵素、吡啶基二硫醇或乙烯基砜必須首先各自引入標(biāo)記試劑15或載體物質(zhì)，使用異雙官能交聯(lián)劑(heterobifunctionallinkers)如(但不限制于)N-(γ-馬來酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯(GMBS);琥珀酰亞胺基(succinimidy1)4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC);(間-馬來酰亞胺苯甲?；?maleimidobenzoy1))-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS);琥珀酰亞胺基4-(對(duì)-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(SMPB);N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?20氨基苯甲酸酯(SIAB);溴代乙酰基-甘氨酸N-羥基琥珀酰亞胺；N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(propionate)(SPDP);乙烯基砜(viny1sulphone)(美國Pier質(zhì)隨后能夠通過半抗原，例如半抗原10中存在的巰基綴合(conjugate)。對(duì)于沒有巰基的半抗原，例如半抗原7和9,使用沒有事先修飾的標(biāo)記試劑25或載體物質(zhì)進(jìn)行綴合，適當(dāng)?shù)氖褂镁Y合的標(biāo)準(zhǔn)方法，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(carbodiimide)(EDC)或混合的酸酐。特別地，通過EDC使半抗原7與例如HRP綴合，通過偏高碘酸鈉與半抗原9綴合，隨后用氰基硼氫鈉還原Schiff堿。30抗血清的制備為了產(chǎn)生多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合，并且將混合物將化合物5(4g,0.022mo1)溶于甲醇(100m1)中，并向攪拌的該溶液中5基硼氫鈉(1.41g,0.022溫?cái)嚢柽^夜。在真空中除去溶劑，加入水(50m1)后加入1NHC1(50m1),將混合物用二乙醚(100m1)洗滌。水相用2NNaOH堿化至pH12-13,并用乙酸乙酯(3×100m1)萃取。用硫酸鈉干燥結(jié)合的有機(jī)萃取物，過濾，除去溶劑，得到較得到的粗產(chǎn)物不經(jīng)過進(jìn)一步純化可直接應(yīng)用。FT-IR(薄膜，純的(neat)):3172,2779.3,2715.4,1246.7和15實(shí)施例3制備[乙基N-(3`一羧基丙基)]-3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿6將粗品化合物1(2.4g)轉(zhuǎn)入無水乙腈中。加入乙基4-溴代丁酸酯(2.426g,0.12mol)后加入碘化鉀(200mg),并且將得到的混合物回流4-5小時(shí)。冷卻后，將溶液過濾，并在真空中除去溶劑。20通過硅膠(5%甲醇的氯仿溶液)色譜進(jìn)行粗產(chǎn)物的純化，得到1.356g淡FT-IR(薄膜，純的):2645.15,1728.45,1490.6,1253.0和1036.7cm?1(圖25實(shí)施例4制備N-(3`-羧基丙基)-3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿-半抗將酯6(1.356g)轉(zhuǎn)入四氫呋喃(10ml)和水(10m1)中，加入氫氧化鉀完成。處理，并將不溶的有機(jī)物質(zhì)濾除。在真空中除去溶劑，將殘留物在乙腈中02139960.3說明書第9/15頁注射入宿主動(dòng)物體內(nèi)，如兔、羊、鼠、天竺鼠或馬。進(jìn)一步注射(加強(qiáng))并取血清試樣評(píng)價(jià)抗體滴度。但達(dá)到最佳滴度時(shí)，隨后將宿主動(dòng)物放血得到適當(dāng)體積的特異性的抗血清。要求的抗體純化水平視計(jì)劃的應(yīng)用而定。對(duì)于許多目的，根本不需要純化，但是，在其它情況下，例如抗體固定在固本發(fā)明特異性抗體作為試劑在免疫試驗(yàn)中用于測定或檢測生物流體中10使用VoyagerSTR生物分光度測量方法研究站激光解析質(zhì)譜與延遲萃取(delayede試樣在0.1%的三氟乙酸(TFA)水溶液中稀釋制成1mg/m1的試樣溶液。使用芥子酸基質(zhì)(matrix)和牛血清白蛋白(F1uka)作為外標(biāo)分析等分試樣(1μ1)。附圖3顯示了BSA載體物質(zhì)的分析結(jié)果。能夠看到表示出的主信號(hào)顯15示了該試樣平均質(zhì)子質(zhì)量m/z66,115。在m/z33,038和132,558觀察到的信號(hào)與觀察到的主要組分的雙電體(doublechargedform)和二聚體形式一致。進(jìn)一步觀察到的信號(hào)包括在m/z13,505的。除非另有說明，下面實(shí)施例中的百分比視為(體積/體積)百分比。實(shí)施例1(3,4-亞甲基二氧基)苯基丙酮5的制備將3,4-亞甲基二氧基)苯乙酸(化合物4)(15g,0.0832mo1)溶于乙酸酐(73.5m1)和吡啶(33.75m1)中，并將混合物回流16小時(shí)。冷卻后，在真空25中(溫度盡可能低)除去溶劑，殘留物用無水乙醇(58.5m1)吸收，加入濃鹽酸(5.63m1),將混合物回流2小時(shí)。加入水(150m1)并用二氯甲烷(3×150m1)萃取。用硫酸鈉干燥結(jié)合的有機(jī)萃取物，過濾并除去溶劑。殘留物用柱色譜(硅膠，10%-20%乙酸乙酯的己烷溶液)純化后得到11.25g橙色油狀(3,4-亞甲基二氧基)苯基丙酮(化合30物5)(收率77%)。FT-IR(薄膜，純的):1711.67cm1(圖5)重結(jié)晶得到0.529g白色泡沫狀的半抗原7。FT-IR(薄膜，純的):3405.63,15m.p(乙腈):37-40℃5實(shí)施例5制備N-(4-丁基苯二酰亞氨基)-3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃將粗品MDMA1(2.35g)轉(zhuǎn)入無水乙醇(鄰苯二甲酰亞胺(3.14g,0.0128m1)并將得到的混合物回流4-5小時(shí)。在室10溫下冷卻后，將溶液在真空中除去溶劑，將殘留物用10%的甲醇氯仿溶液進(jìn)行硅膠色譜分析，得到2.013g淺棕色油狀的化合物8。FT-IR(薄膜，純的):2633.0,1709.2,1398,1252和1039.1cm1(圖15實(shí)施例6制備N-(4’一氨基丁基)-3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃堿二鹽酸鹽——半抗原9將實(shí)施例5制備的化合物8(2.013g,0.005mo1)轉(zhuǎn)入無水甲醇(50m1)中并加入水合肼(0.246g)。將混合物回流2小時(shí)，之后再加入0.138g水合肼，并繼續(xù)回流2小時(shí)。隨后在室溫下冷卻反應(yīng)混合物，并在真空中除去20溶劑留下棕色油狀物。濾除沉淀，將濾液用6NNaOH堿化至pH12-13,并用二氯甲烷(4×50m1)萃取。將結(jié)合的有機(jī)萃取物用硫酸鈉干燥，過濾并除去溶劑，得到灰棕色油狀的游離堿。25將油狀物用2N氯化氫二乙醚溶液(20m1)處理并攪拌1-2小時(shí)。收集沉淀，用冷的二乙醚洗滌沉淀并干燥得到0.877g灰白色固體的N-(4-氨基丁FT-IR(薄膜，純的):3377.66,2792.44,1489.3和1038.97cm?1(圖10)實(shí)施例7制備N-(3`-乙?；虼?-3,4-亞甲基二氧基脫氧麻黃02139960.3堿——半抗原10將粗品MDMA1(2.98g,0.0154mo1)轉(zhuǎn)入無水乙醇(50m1)中，加入碘丙基硫代乙酸酯(5.65g,0.023m1)并將得到的混合物回流16小時(shí)。在室溫下冷卻后，將溶液在真空中除去乙醇。用色譜(硅膠，10%的甲醇氯仿溶液)純5化得到深色粗品混合物，得到2.2g明黃色油狀的N-(乙酰基硫代丙FT-IR(薄膜，純的):2931.1,2675.7,1689.2,1038.7和735.8cm1(圖10實(shí)施例8半抗原7與BSA的綴合：免疫原7向半抗原7(100mg,0.36mmo1)在1ml的無水DMF中形成的溶液中加入N-羥基琥珀酰胺(49.7mg,0.43mmol)和N,N-雙環(huán)己基碳二酰亞胺15在10m10.05M磷酸鹽緩沖液(pH8.5)中。然后將混合物在室溫下攪拌過夜。將溶液用蒸餾水透析20小時(shí)(更換3次)并冷凍干燥。均質(zhì)子質(zhì)量m/z68,118。在m/z34,006和136,475觀察到的信號(hào)分別與主要207.2摩爾的半抗原綴合(conjugate)。實(shí)施例9半抗原7與HRP的綴合將10mgEDC鹽酸鹽溶于800μ1水中，并立即將其加入到2mg半抗原725水中形成的溶液中。立即加入N-巰基-琥珀酰亞胺(5mg)并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜培養(yǎng)。通過用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.2,PBS)預(yù)平衡的串聯(lián)的2PD-10柱(PharmaciaBiotech)脫鹽除去過量的衍生物。然后將半抗原-HRP綴合物用10LPBS在4℃透析過夜。30實(shí)施例10半抗原9與HRP的綴合的溶液中。將所得到的溶液在室溫下在暗處攪拌2沖液(pH4.5)在4℃在暗處透析過夜。半抗原9(2mg)溶于200ì1DMF的溶4℃在暗處透析過夜。10溶液滴加到在避光冷卻到0℃條件下的HRP(1g)在0.1M硼酸鹽緩沖液穩(wěn)定在8并且將溶液在暗處在0℃攪拌1小時(shí)。將溶液中和至pH7并且在415實(shí)施例12半抗原10與溴代乙酰基甘氨酸修飾的HRP的綴合將10mg半抗原10溶于0.5m10.12M碳酸鉀(80%甲醇/20%水)溶液中。個(gè)PD-10柱(PharmaciaBiotech)純化，用PBS(pH7.2)洗脫，并且用℃透析過夜。實(shí)施例13對(duì)抗實(shí)施例8的免疫原-免疫原7產(chǎn)生的抗體的制備25將中的乳劑。在每只動(dòng)物的肋腹處的含有1mg/m1免疫原在50%(v/v)Freund'sIncomp02139960.3說明書第14/15頁用相對(duì)免疫原7(實(shí)施例8)產(chǎn)生的抗血清的IgG片段包覆增強(qiáng)結(jié)合的965孔聚苯乙烯微量滴定板的各孔，在10mMTris,pH8.5(125μ1/孔)中稀釋。使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISAchequerboard技術(shù)測定適當(dāng)抗體包覆的稀釋液。將板在37℃培養(yǎng)2小時(shí)，用含有Tween20(TBST)的Tris緩沖鹽水洗滌4次并輕擊干燥(tapdry)。在TBST中制備0、1、10、50、100、250、500和1000mg/ml10測試劑)-半抗原7-HRP(實(shí)施例9)和半抗原10-HRP(實(shí)施例12)在pH7.2,含當(dāng)?shù)目字?圖2)。將板在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。過量的未結(jié)合的綴合物通過用TBST洗滌6次共10分鐘除去。室溫下在暗處培養(yǎng)15-20分鐘。通過在每個(gè)孔中加入125μl0.2M的H?SO?終止反應(yīng)。然后使用微量滴定板讀數(shù)器在450nm處測定吸光度。每次測定產(chǎn)生的數(shù)據(jù)在下面的表1中給出。表1:使用免疫原7(實(shí)施例8)和綴合物7(半抗原7-HRP)(實(shí)施例9)20以及綴合物10(半抗原10-HRP)(實(shí)施例12)產(chǎn)生的抗血清作為檢測試劑，應(yīng)用競爭性微量滴定板測定MDMA產(chǎn)生的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度ng/ml綴合物7綴合物10015信號(hào)置換。表2:MDMA競爭性ELISA的交叉反應(yīng)性反應(yīng)物免疫原7的抗血清半抗原7-HRP1d-苯異丙胺(+)-脫氧麻黃堿(+)-麻黃堿(-)-麻黃堿(+)一假麻黃堿(-)一假麻黃堿21-苯異丙胺制備半抗原7、9和10的化學(xué)反應(yīng)000O4000O0O0O8000OOON、半抗原9第1/11頁。5NHCH?6N