治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討

王峰治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討HPLC在治療藥物監(jiān)測中的應用監(jiān)測藥物種類繁多：茶堿、華法令、氯丙嗪、抗癲癇類藥物、鎮(zhèn)靜催眠類藥物、胺碘酮、免疫抑制藥物等等?？杀O(jiān)測濃度范圍：紫外可見光監(jiān)測器，熒光檢測器（高２－３各數(shù)量級），電化學檢測器（10-12g），質譜檢測器（10－１５g)，但具體與藥物本身結構與檢測條件有關主要的缺陷：操作復雜、容易被干擾、治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討建立治療藥物監(jiān)測方法的準備工作了解所要監(jiān)測藥物的基本情況：監(jiān)測范圍、理化性質、監(jiān)測意義查閱文獻結合實際條件。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討方法學問題探討１、為什么要考察標準曲線？２、為什么要考察緊密度？

3、為什么要考察方法回收率？４、為什么要考察絕對回收率？１、用已知的東西去了解未知東西。２、合理的東西是多大概率上的合理

治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討為什么要考察標準曲線—定量分析依據(jù)標準曲線是定量分析的根本依據(jù)１、藥物濃度（或質量）與藥物在檢測器上的產(chǎn)生的信號（通常采用峰面積A）成比例(正比)即C１／C１＝A１／A２或M１／M２＝A１／A２圖示：治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討通常外標法計算CX：CX／C０＝AX/A０結論：所建立的方法充分條件就是測定范圍內(nèi)標準趨向成線性關系治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討標準曲線的幾個問題NCCLSEP6-P，定量分析方法線性的評價：推薦指南（1986）。本文件包含評價儀器或定量分析方法是否滿足制造商線性要求的方法;以及為廠商提供了檢測線性范圍聲明的指南。本文件為設計評估臨床化學儀器精密性能試驗提供了指南；將結果估計的精密度與制造商的精密要求進行比較，以及確定比較是否有效。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討１、相關系數(shù)是評價線性的客觀標準，但應考慮到實際測定的需要，合理采用權重系數(shù)（１／x,1/x2,1/y,1/y2)（回收率）治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討２、標準曲線的范圍確定取決于樣品最低濃度與最高濃度。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討３、研究方法線性一般采用6-10點，并非點越多越好，合理是統(tǒng)計學上的合理。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討４、影響標準曲線的可能因素儀器相應因素（儀器響應線性與方法線性的關系）樣品方法因素色譜條件治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討２、為什么要考察精密度－標準曲線的必要保證治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討精密度考察的幾個問題EP5-A，臨床化學設備精密性能的評價：批準指南（1999）。本文件為設計評估臨床化學儀器精密性能試驗提供了指南；將結果估計的精密度與制造商的精密要求進行比較，以及確定比較是否有效。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討１、精密度表示平行測定結果的互相接近程度,一般用變異系數(shù)(coefficientofvariation,cv)表示。亦即重復測定同一實際樣品或模擬生物樣品的相對標準偏差(ＲＳＤ)。２、ＣＶ可分為日內(nèi)（withinday)CV和日間(daytoday)ＣＶ,批內(nèi)(intraasay)ＣＶ和批間(interassay)。批內(nèi)、批間ＣＶ更具有實際意義.治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討一般要求ＣＶ應小于15%,低濃度水平或復雜方法可放寬到小于20%。精密度僅表示測定的重現(xiàn)性,但精密是保證準確的提前。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討精密度考察設計：３－５點，２樣品２平行治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討3、為什么要考察方法回收率？—標準曲線效能指標治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討方法回收率計算R１＝C１／C1｀R２＝C２／C２｀C：通過標準曲線計算所得濃度C｀：實際加入標準品濃度R：回收率治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討EP10-A定量臨床檢驗方法的初步評價：批準指南（1998）。本指南討論分析方法或儀器性能初步評價的實驗設計和數(shù)據(jù)分析（參見相產(chǎn)出版物GP10-A）治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討相對回收率幾點問題定義：回收率是用來衡量測定方法對生物樣品中待測物的檢測效能的,表示測定結果與真實值的接近程度,亦即測量值的正確性。高、中、低濃度回收率可能不同。相對回收率能直接反映測定結果與真實值的接近程度,應控制在100%左右(95%～105%)。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討絕對回收率—另一個概念模擬生物樣品經(jīng)整個樣品處理過程,而相應標準溶液直接分析,兩者的響應值之比稱為絕對回收率(ａｂｓｏｌｕｔｅｒｅｃｏｖｅｒｙ);治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討絕對回收率計算R＝A１／A2治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討絕對回收率幾個問題絕對回收率與相對回收率關系絕對回收率與相對精密度的關系絕對回收率要求,所得響應值之比稱為相對回收率relativerecovery)。絕對回收率一般應大于70%,過低說明方法中待測物質損失嚴重,過高(>105%)治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討靈敏度（sensitivity）,檢測限(limitofdetection,LOD)ＬＯＤ是指分析方法定性檢測生物樣品中待測物的最低濃度。Ｓ/Ｎ)≥3定量限(Limtofquantification,LOQ)ＬＯＱ是指分析方法能準確精密定量測定生物樣品中待測物的最低濃度。Ｓ/Ｎ≥10治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討專屬性考察EP7-P，臨床化學干擾試驗，推薦指南（1986）。本指南提供了描述干擾物質對試驗結果影響的信息及程序。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討質量控制(ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ,ＱＣ)室內(nèi)質控質量控制(QualityControl,QC)

為達到質量要求所采取的作業(yè)技術和活動。質量控制包括作業(yè)技術和活動，其目的在于監(jiān)視過程，并排除質量環(huán)節(jié)中所有階段中導致不滿意的原因，以取得經(jīng)濟效益。質量控制和質量保證的某些活動是相互聯(lián)系的。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討室間質評室間質量評價（ExternalQualityAssessment,EQA）由非本單位的機構，采用一系列辦法來客觀地評價實驗室的結果，其主要目的是建立實驗室間的可比性。該計劃是多個標本周期性地發(fā)送到實驗室進行分析和/或鑒定，將每一實驗室的結果與同組的其它實驗室的結果或靶值進行比較，并將比較的結果報告給參與的實驗室。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討方法學回顧用已知證明未知合理是統(tǒng)計上的合理治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討標準曲線是根本精密度結果是標準曲線的保障相對回收率是分析方法的效能指標絕對回收率是重要相關因素靈敏度、檢測限、選擇性是性能參數(shù)治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測方法的特點臨床要求快速樣品量少，一般１毫升樣品復雜，不確定干擾較多測定準確度要求高治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測方法的建立的一般過程治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討基本實驗技術5.2.1樣品制備

目的是使樣品與所使用的HPLC方法相兼容，即把分析樣品中的待測組分轉化為適合HPLC直接進樣分析的試液。對于一些較復雜的樣品，樣品制備還包括預分離富集、衍生化等預處理步驟。液相色譜法的精密度和準確度往往取決于樣品制備的質量。

治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討一、樣品的溶解

用于溶解分析樣品的溶劑應與液相色譜流動相互溶，最好選用流動相來溶解或提取被分析樣品的待測組分，這樣可以避免溶劑峰的干擾。

制備好的分析試液應為均相溶液，無不溶物，否則在進行色譜分析之前應進行0.45μm或0.2μm微孔膜過濾。

治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討樣品前處理一過濾和離心對于基體復雜的樣品液，不溶物可以通過過濾或高速離心除去。有時加入合適沉淀劑或改變?nèi)軇勾蠓肿踊|以沉淀方式除去。

治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討液液萃取水樣中的許多待測有機化合物可以通過液液萃取到有機相后進行液相色譜分析。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討固相萃取利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜分離原理，使液體樣品通過一吸附劑小柱，保留其中某些組分，再選用適當?shù)娜軇_洗雜質，然后用少量溶劑迅速洗脫，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討流動相的配制一、配制對于二元溶劑或多元溶劑等度洗脫，液相色譜流動相通常均按溶劑體積比配制。要求溶劑必須互溶。二、過濾

HPLC流動相使用前要用0.45m微孔膜過濾。

三、脫氣

（1）溶于流動相的空氣會影響液相色譜系統(tǒng)的操作性能。如氣泡進入泵腔將使高壓泵流速不穩(wěn)；而流動相通過柱子時其中的氣泡受到壓力而壓縮，流出柱子到檢測器時，會因為壓力降至常壓而將氣泡釋放出來，造成檢測器噪聲增大，基線不穩(wěn)。

治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討流動相配制過濾脫氣治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討接抽氣機微孔膜治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討泵泵泵泵泵泵治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立實例HPLC－UV測定甲氨喋呤血藥濃度治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討1、甲氨喋呤血藥濃度監(jiān)測解決什么問題血藥濃度監(jiān)測能有效反映MTX在體內(nèi)的濃度變化過程，從而為臨床治療與解救提供參考大劑量MTX化療是兒童急性淋巴細胞白血病（ALL）聯(lián)合化療方案的重要組成部分治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討遇到什么問題國內(nèi)有關HPLC測定MTX的方法[1-4]進行試驗時，發(fā)現(xiàn)樣品用蛋白沉淀法，低濃度時MTX受雜峰干擾嚴重，且難以達到臨床所需最低定量濃度，而固相萃取方法則難以滿足寬濃度線性范圍的要求，且分析成本高、周期長。治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討[1]GEYong-qian（葛勇前），LUGuo-chun（陸國椿）。QuantitationofPlasmaMethotrexateContentbyHPLC（HPLC法測定人血漿中甲氨喋呤的濃度）.ChinJPharmAnal（藥物分析雜志），2001，21（6）418～420（inChinese）[2]ZhangHuanian（張華年），WenLingli（文玲莉），ZhangShaowen（張少文），etal.HPLCAssayforMethotrexateUtilizingSolidPhaseExtractionPurificationandSeparationofBiologicalSample（固相萃取高效液相色譜法檢測生物樣本中甲氨喋呤）.ChinJPharmAnal（藥物分析雜志），2000，20（6）：401～40（inChinese）[3]WuChuang（吳闖），YangZhenhong（楊正鴻），LinGuiyiun（林貴遠），etal.DeterminationofmethotrexatelevelinplasmaandcereberospinalfluibyHPLC（反相高效液相色譜法測定血漿和腦脊液中甲氨喋呤濃度），（中國醫(yī)院藥學雜志），1999，19（5）：272-274（inChinese）[4]ZhangBi-kui(張畢奎)，LIHuan-de(李煥德)，ZHANGXiang-sheng(張湘生),etal.Studiesonserumdrugmonitoringandeliminationofhigh-doseMTXchemotherapyinpatientswithboneandsofttissuemalignanttumors(骨及組織腫瘤大劑量甲氨喋呤化療時血藥濃度的動態(tài)監(jiān)測及體內(nèi)消除研究).ChinPharmJ,(中國藥學雜志)2002.4.;37(4):290-293治療藥物監(jiān)測HPLC分析方法建立探討色譜條件選擇色譜柱為ZirchromKromasilC18柱（250×4.6mm，5μm），柱溫40℃，流動相為乙腈：25mmol.