免疫電泳技術(shù)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第一節(jié)概述免疫電泳技術(shù)實質(zhì)上是直流電場作用下的凝膠擴散試驗。

Grabar和Williams于1953年首先將凝膠擴散置于直流電場中進行，讓電流加速抗原和抗體的擴散，并規(guī)定其運動方向，從而使這種沉淀反應(yīng)時間大縮短，敏感度顯著提高。隨著現(xiàn)代生物學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，免疫電泳技術(shù)有了新的發(fā)展，應(yīng)用范圍日益擴大，不僅用于人與動物血清蛋白、各組織器官抗原成分及抗體的分析，也用于細菌、植物性抗原、酶與激素的檢測。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗一、電泳的原理

帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳?？贵w及大多數(shù)抗原是蛋白質(zhì)，具有許多可解離的酸性和堿性基團如COO—及NH3+等，在一定pH條件下，這種兩性電解質(zhì)解離成為帶正電或負電的質(zhì)點，其泳動方向和泳動速度與本身凈電荷量、顆粒大小、形狀等有關(guān)。所帶凈電荷量越多，顆粒越小，泳動速度越快。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗二、影響因素

1.電場強度是指每厘米的電位降，以V/cm表示。電泳時，可采用恒定電流，變動電壓；也可恒定電壓，變動電流。I=V/R，恒定電壓時，因R不斷下降，所以電流增高，顆粒移動速度和熱效應(yīng)也增大。通常采用電壓在2~10V/cm；當恒定電流時，由于R不斷下降，因此，V也隨之下降，從而蒸發(fā)較少，熱效應(yīng)也小，移動率接近恒定。因此恒定電流要比恒定電壓好。常用電流為2~4mA/cm。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗2.溶液pH值

溶液pH值決定蛋白質(zhì)帶電荷種類和數(shù)量。pH離等電點越遠，離子解離越多，泳動速度越快，反之則越慢。為了使電泳速度恒定，必須采用緩沖溶液。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點較低，一般電泳所采用的緩沖溶液均偏堿性，因而使大部分的分子帶負電荷。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗3.離子強度

溶液的離子強越高，電導(dǎo)率越高，則帶電質(zhì)點泳動速度越慢并有較高的熱效應(yīng)；反之，離子強度低，質(zhì)點泳動快，熱效應(yīng)較小。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗4.電滲

在電場中液體相對于固體的移動稱為電滲。在瓊脂凝膠電泳中，由于瓊脂是帶負電荷的極性基團(如SO42—、COO—)，使瓊脂成為負電的固相，靜電感應(yīng)作用使瓊脂網(wǎng)格附近的水帶正電，因此，液體向負極流動，形成電滲力。帶電質(zhì)點泳動時受電泳力和電滲力的共同作用。如電泳力低于電滲力，則向負極移動。如抗體，在堿性環(huán)境帶負電，應(yīng)向正極移動，但由于其等電點較高，電荷少，抵不過電滲力而泳向負極。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第二節(jié)對流免疫電泳

對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)又稱免疫電滲電泳(immuno-osmophoresis,IEOP)。是在直流電場中進行的免疫雙擴散技術(shù)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)原理在pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白因等電點高，只帶有微弱的負電荷，而且分子又較大，因此電泳力小，小于電滲力，泳向負極；而一般抗原蛋白質(zhì)常帶較強的負電荷，分子較小，電泳力大，大于電滲力，泳向正極，電泳時抗原放負極側(cè)，抗體放正極側(cè)，抗原抗體相對泳動，一定時間后抗原和抗體將在兩孔之間相遇，在比例適當處形成肉眼可見的沉淀線。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.制備1.2%巴比妥瓊脂凝膠板。2.在瓊脂板上成對打孔，孔徑3mm，孔距6mm。3.于陰極側(cè)孔內(nèi)加入待檢血清或陽性對照血清，陽極側(cè)孔內(nèi)加抗血清。4.電泳電泳條件3~4mAcm寬，電泳30min。5.觀察結(jié)果或在室溫放置數(shù)小時后觀察沉淀線，見圖。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

1為陽性2為弱陽性3/4為強陽性

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(三)方法評價對流電泳簡便、快速、敏感度較雙相瓊脂擴散試驗高8~10倍，但分辨力低于雙向瓊脂擴散試驗。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第三節(jié)火箭免疫電泳

火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis,RIE)技術(shù)是把抗原放在含有抗體的凝膠內(nèi)電泳，其沉淀形似火箭，故稱為火箭電泳。也有人稱其為電免疫擴散(electro-immunodiffusion,EID)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)原理將待測抗原在含有適量抗體的瓊脂板中泳動時，在抗原與抗體達到適當比例時形成大的不溶性免疫復(fù)合物而沉淀，此沉淀物不再移動，未與抗體結(jié)合的抗原可穿過此沉淀繼續(xù)向前遷移并形成新的沉淀，隨著抗原的減少，沉淀帶越來越窄，形成火箭峰狀沉淀(見圖)。峰形高低與抗原量成正比。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.制備抗體瓊脂糖凝膠板將已融化的1.2%巴比妥緩沖瓊脂糖冷卻至55℃左右，加入適量抗血清，混勻后立即澆板，置室溫凝固。2.打孔在瓊脂凝膠板一側(cè)打孔，孔徑3mm，孔距2mm。置瓊脂板于電泳槽內(nèi)，搭橋后用微量注射器準確加樣10μl。3.電泳樣品孔放負極側(cè)，電壓8~10V/cm或電流3~5mA/cm，電泳6h。4.觀察沉淀峰電泳完畢后，觀察瓊脂板上沉淀峰，并測量從孔中心到峰尖的高度。5.繪制標準曲線圖以峰高為縱坐標，濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，繪制標準曲線，求出待檢樣品內(nèi)抗原濃度。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(三)方法評價火箭電泳是一種操作簡便、省時、結(jié)果重復(fù)性好的定量檢測方法。其敏感度可測0.3mg/L抗原含量，若低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。如加入少量125I標記的抗原在含抗體的瓊脂板上電泳，形成的不可見火箭峰，經(jīng)洗滌干燥后，用X線膠片感光，經(jīng)顯影和定影，可呈現(xiàn)同位素顯影，這就是放射自顯影技術(shù)，可用于微量抗原含量測定，如測定血清AFP或IgE含量，可測至μg/L水平。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(四)注意事項1.所用瓊脂應(yīng)是無電滲或電滲很小，否則火箭峰形狀不規(guī)則。2.觀察峰形可判斷電泳終點，如電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形，表示抗原未達到終點，應(yīng)繼續(xù)電泳。3.待檢標本數(shù)多時，應(yīng)將瓊脂板置于電泳槽上，搭橋并開啟電源后加樣，否則易出現(xiàn)寬底峰形，影響正確判斷結(jié)果。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第四節(jié)免疫電泳

免疫電泳(immunoelectrophoresis,IEP)是將區(qū)帶電泳和雙相瓊脂擴散相結(jié)合的一種免疫化學(xué)分析技術(shù)。1953年Grabar首先應(yīng)用該方法進行抗原抗體分析。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)原理先將待檢標本在瓊脂凝膠中進行電泳,不同的抗原成分由于所帶電荷、分子量及分子構(gòu)型的差異，在電場作用下的泳動速度不同而被分成不同區(qū)帶。然后與電泳方向平行，挖一小槽，加入含相應(yīng)抗體的免疫血清，與已分離的各抗原成分在瓊脂內(nèi)作雙相免疫擴散，各區(qū)帶在相應(yīng)位置與抗體形成沉淀弧。根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.取潔凈載玻片，澆注融化的瓊脂凝膠，凝固后打孔挖槽。2.用微量加樣器加待檢標本或正常血清對照于孔內(nèi)。3.電泳條件以電壓4~6V/cm或電流2~3mA/cm為宜，電泳1.5~2h。4.電泳完畢后，用毛細滴管在槽內(nèi)加入含相應(yīng)抗原，孵育，使抗原抗體雙相擴散，形成沉淀線。

5.觀察沉淀線的數(shù)目、形狀和位置。經(jīng)漂洗、干燥、染色、脫色等步驟制作染色標本，可長期保存。例如血漿蛋白免疫電泳。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(三)方法評價免疫電泳分辨率高，可分出人血清中20~30種抗原成分，可鑒定混合抗原中各組分。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗由于免疫電泳的影響因素較多，對異常結(jié)果的分析增加了復(fù)雜性。如沉淀弧數(shù)目不總是與混合物中應(yīng)有的成分相符。原因有：①抗原抗體比例不恰當，使一些成分未出現(xiàn)沉淀線；②相鄰兩抗原遷移率非常接近而致沉淀線重疊；③一條沉淀線分離成多條。因此用免疫電泳技術(shù)檢測多種混合物時，至少要用3種不同的濃度，2種或2種以上的抗體(免疫不同動物而得)，而且要及時觀察并記錄沉淀弧出現(xiàn)的情況。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗免疫電泳可用于正常情況、免疫后以及在病理過程中血清蛋白的分析。在許多疾病如骨髓瘤、γ球蛋白缺乏癥、肝病、白血病、彌漫性紅斑狼瘡等，可用該方法觀察某種Ig的超常增加或減少。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第五節(jié)免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)

1979年，Towbin將核酸轉(zhuǎn)印技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究，建立了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印技術(shù)，稱Westernblot。由于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印技術(shù)主要用于研究抗原或抗體，所以稱其為免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)(immuno-blot)。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(一)原理免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)的基本原理是將凝膠電泳與固相免疫測定結(jié)合起來，將經(jīng)電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)精確且近似定量地轉(zhuǎn)移到固相載體上如硝酸纖維素膜(NC膜)，并保持其原有的生物活性，再經(jīng)熒光免疫、酶免疫、放射免疫技術(shù)等進行測定，可得以定位、定性和定量結(jié)果。實質(zhì)上分3步驟即蛋白質(zhì)組分分離、各組分轉(zhuǎn)印及免疫檢測。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(二)操作步驟1.蛋白質(zhì)分離采用聚丙稀酰胺凝膠電泳(polyacryamidegelelectrophoresis,PAGE)進行分離。2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印從凝膠上將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜等固相載體的過程即為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印。3.蛋白質(zhì)的免疫檢測將已轉(zhuǎn)印NC膜封閉，用酶免疫組化技術(shù)、免疫金組化技術(shù)等檢測。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗三)方法評價免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)綜合了PAGE的高分辨力和免疫標記技術(shù)的高度特異性和敏感性。PAGE具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)，使之具有高度的分辨力，在同一固相載體上可作多項成分的分析。隨著這種固相反應(yīng)基質(zhì)商品化，該技術(shù)會越來越廣泛地應(yīng)用到醫(yī)學(xué)檢驗工作中。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗應(yīng)用舉例：用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分