動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)定###一、概述

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在研究動(dòng)物的行為與其神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系，通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法揭示行為產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制。為確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、倫理性和規(guī)范性，需遵循以下實(shí)驗(yàn)規(guī)定。本規(guī)定適用于所有涉及動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)操作，包括但不限于電生理記錄、神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)、行為觀察等實(shí)驗(yàn)。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

1.**物種選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型，常見(jiàn)物種包括小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等。選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮物種的神經(jīng)生物學(xué)特性、行為學(xué)基礎(chǔ)及倫理可行性。

2.**年齡與性別**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)處于健康、發(fā)育成熟的階段，具體年齡和性別需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。例如，小鼠實(shí)驗(yàn)通常選用4-8周齡的成年個(gè)體。

3.**遺傳背景**：若需特定遺傳背景的動(dòng)物，應(yīng)使用純合子或雜合子系，并記錄其譜系信息。

####（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.**設(shè)備準(zhǔn)備**：

-電生理記錄系統(tǒng)（如多通道放大器、信號(hào)采集卡）；

-行為學(xué)測(cè)試箱（如開(kāi)箱測(cè)試箱、曠場(chǎng)箱）；

-神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)裝置（如注射器、微量泵）；

-數(shù)據(jù)分析軟件（如MATLAB、Python）。

2.**試劑配制**：

-神經(jīng)遞質(zhì)類似物、拮抗劑需精確配制，并標(biāo)注配制日期、濃度及儲(chǔ)存條件。

-試劑需使用高純度原料，避免雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

####（一）動(dòng)物麻醉與固定

1.**麻醉方法**：采用吸入性麻醉（如異氟烷）或注射性麻醉（如戊巴比妥），麻醉劑量需根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整。例如，小鼠異氟烷濃度通常為1.5%-2.5%。

2.**固定方式**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的固定裝置，確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持穩(wěn)定，避免二次傷害。固定前需涂抹凡士林保護(hù)皮膚。

####（二）神經(jīng)電生理記錄

1.**電極植入**：

-使用單支或多支玻璃微電極，植入腦區(qū)需參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜定位。

-電極阻抗需在1-5MΩ范圍內(nèi)，以減少信號(hào)噪聲。

2.**記錄步驟**：

-(1)清潔手術(shù)區(qū)域，消毒后進(jìn)行切開(kāi)；

-(2)電極緩慢植入目標(biāo)腦區(qū)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)；

-(3)記錄數(shù)據(jù)時(shí)需同步記錄行為指標(biāo)，如運(yùn)動(dòng)頻率、眨眼次數(shù)等。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)

1.**給藥途徑**：

-靜脈注射、腦室內(nèi)注射或腹腔注射，給藥劑量需預(yù)先驗(yàn)證安全性。

-例如，大鼠腦室內(nèi)注射通常使用5μLsterilesaline或藥物溶液。

2.**效應(yīng)評(píng)估**：

-干預(yù)前后需進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，如步幅分析、探索行為評(píng)分等。

-數(shù)據(jù)需采用配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

###四、數(shù)據(jù)記錄與處理

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄

1.**電生理數(shù)據(jù)**：實(shí)時(shí)保存神經(jīng)信號(hào)，記錄采樣頻率、濾波范圍等參數(shù)。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**：使用視頻記錄系統(tǒng)同步記錄，標(biāo)注時(shí)間戳及事件類型。

####（二）數(shù)據(jù)分析

1.**數(shù)據(jù)預(yù)處理**：去除偽跡信號(hào)，如肌肉運(yùn)動(dòng)干擾、電極漂移等。

2.**統(tǒng)計(jì)分析**：采用重復(fù)測(cè)量方差分析（RepeatedMeasuresANOVA）或相關(guān)分析，評(píng)估干預(yù)效應(yīng)。

###五、實(shí)驗(yàn)倫理與安全

####（一）倫理審查

1.所有實(shí)驗(yàn)需通過(guò)機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)（IACUC）審查，確保符合3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.實(shí)驗(yàn)方案需明確動(dòng)物數(shù)量、處理方法及疼痛緩解措施。

####（二）安全操作

1.實(shí)驗(yàn)人員需佩戴防護(hù)設(shè)備，如手套、護(hù)目鏡等。

2.化學(xué)試劑需分類儲(chǔ)存，避免泄漏。

###六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死

1.采用安樂(lè)死方法（如過(guò)量麻醉）需符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，避免動(dòng)物痛苦。

2.安樂(lè)死過(guò)程需記錄時(shí)間及操作人員。

####（二）廢棄物處理

1.組織樣本需固定于4%多聚甲醛，標(biāo)記后儲(chǔ)存。

2.化學(xué)廢棄物需按規(guī)范分類處理，避免環(huán)境污染。

###七、總結(jié)

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄及倫理安全要求，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。所有實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)，熟悉相關(guān)操作流程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范（續(xù)）

####（二）神經(jīng)電生理記錄（續(xù)）

1.**電極植入**（續(xù)）：

-**電極類型選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇不同類型的電極，如：

-**玻璃微電極**：適用于單細(xì)胞或小群體神經(jīng)元放電記錄，具有高空間分辨率。制作方法包括拉制玻璃毛細(xì)管，使用微電極拉制器（如SutterInstrumentsP-97）控制拉制參數(shù)（如玻璃管直徑、拉制溫度、拉制速度），最終形成尖端直徑1-5μm的電極，阻抗在1-5MΩ范圍內(nèi)。

-**微電極陣列**：適用于多單位放電或局部場(chǎng)電位（LFP）記錄，常用型號(hào)如MultichannelSystems(MCS)的MA1000系列，包含32-256個(gè)通道，適用于大規(guī)模神經(jīng)元活動(dòng)研究。

-**柔性電極**：適用于植入腦深部或進(jìn)行慢性記錄，材料如鉑銥合金或碳纖維，表面鍍銀以增強(qiáng)信號(hào)。

-**腦區(qū)定位**：

-參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜（如《ratbraininstereotaxiccoordinates》）確定坐標(biāo)，常用腦區(qū)包括海馬體（用于學(xué)習(xí)記憶研究）、杏仁核（用于情緒研究）、伏隔核（用于獎(jiǎng)賞研究）。定位工具需使用立體定位儀（StereotaxicFrame，如DavidKopfInstruments），確保坐標(biāo)精度在0.1mm以內(nèi)。

-定位前需在動(dòng)物頭部固定金屬柱，用于固定立體定位儀，柱位置需根據(jù)動(dòng)物顱骨結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免損傷血管或腦組織。

-**手術(shù)操作**：

-(1)**術(shù)前準(zhǔn)備**：動(dòng)物術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水，使用脫毛劑去除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，75%乙醇消毒。

-(2)**顱骨開(kāi)窗**：使用牙科鉆在目標(biāo)腦區(qū)顱骨上鉆直徑1-2mm的孔，避免損傷硬腦膜。開(kāi)窗后用生理鹽水棉片覆蓋，防止腦組織干燥。

-(3)**電極植入**：緩慢推進(jìn)電極，速率不超過(guò)0.5mm/min，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)，確認(rèn)電極位于目標(biāo)區(qū)域。植入深度需參考腦圖譜，并記錄實(shí)際坐標(biāo)。

-(4)**封固**：用牙科水泥將電極固定柱與顱骨連接，確保長(zhǎng)期穩(wěn)定。表面覆蓋透明硅膠膜，防止感染并保護(hù)電極。

2.**記錄步驟**（續(xù)）：

-**信號(hào)采集**：

-(1)**濾波設(shè)置**：根據(jù)信號(hào)類型選擇濾波范圍，如單細(xì)胞放電記錄常用0.1-3kHz，LFP記錄常用1-100Hz。

-(2)**采樣率**：不低于信號(hào)帶寬的5倍，如記錄1kHz信號(hào)需設(shè)置采樣率≥5kHz。

-(3)**參照電極**：使用銀氯化物電極放置在枕葉或參考電極夾，減少噪聲干擾。

-**行為同步記錄**：

-(1)**視頻系統(tǒng)**：使用高清攝像頭（如SonyA7S）固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，分辨率≥1080p，幀率≥30fps。

-(2)**事件標(biāo)記**：在視頻記錄軟件（如EthoVisionXT）中設(shè)置事件標(biāo)記（如探索、回避、攻擊），自動(dòng)統(tǒng)計(jì)行為頻率。

-(3)**時(shí)間同步**：確保神經(jīng)信號(hào)記錄器與視頻系統(tǒng)時(shí)間戳同步，誤差控制在±1ms以內(nèi)。

-**信號(hào)處理**：

-(1)**偽跡去除**：使用數(shù)字濾波器（如帶通濾波、陷波濾波）去除50/60Hz工頻干擾及肌肉運(yùn)動(dòng)偽跡。

-(2)**單元分選**：若記錄多單位信號(hào)，使用波幅閾值、波形模板匹配等方法分選單個(gè)神經(jīng)元信號(hào)（如Plexon'sOfflineSorter）。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)（續(xù)）

1.**給藥途徑**（續(xù)）：

-**腦室內(nèi)注射**：

-(1)**坐標(biāo)定位**：參照腦圖譜設(shè)定注射坐標(biāo)（如前囟0.8mm,L:1.5mm,V:3.0mm,A:-2.5mm），確保注射針頭進(jìn)入腦室系統(tǒng)。

-(2)**注射參數(shù)**：注射速率0.5-2μL/min，總劑量≤10μL，注射后停留1-2min防止反流。常用工具為微注射泵（如RadelSystemsModel702）。

-(3)**對(duì)照組設(shè)置**：設(shè)立假注射組（注射等體積生理鹽水），排除溶劑效應(yīng)。

-**紋狀體微透析**：

-(1)**探針植入**：使用立體定位儀將微透析探針（內(nèi)徑20-50μm）植入目標(biāo)區(qū)域（如伏隔核），用組織膠固定。

-(2)**灌流系統(tǒng)**：連接體外灌流泵（如CMA/110），以1-5μL/min流速灌流人工腦脊液（ACSF，含NaCl150mM,KCl3mM,CaCl?1.3mM,MgSO?1.2mM,glucose10mM,HEPES10mM,pH7.4）。

-(3)**樣本收集**：收集流出液，使用電導(dǎo)率儀監(jiān)測(cè)流速，計(jì)算回收率（通常80%-90%）。

-**經(jīng)皮給藥**：

-(1)**透皮技術(shù)**：使用電穿孔（如GenePulserXcell，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度200-500V/cm,脈寬1-2ms,頻率1Hz）或離子導(dǎo)入（如NeuroPore，電壓5-15V）增強(qiáng)藥物透皮吸收。

-(2)**藥物濃度**：皮內(nèi)注射或透皮給藥的藥物濃度需高于腦內(nèi)自由濃度，常用劑量范圍（mg/kg）：皮質(zhì)醇0.1-1.0,多巴胺類似物0.01-0.1。

2.**效應(yīng)評(píng)估**（續(xù)）：

-**短期效應(yīng)**：

-(1)**電生理**：觀察給藥后神經(jīng)元放電頻率、同步性變化，如多巴胺能藥物是否增加獎(jiǎng)賞相關(guān)腦區(qū)（伏隔核）的神經(jīng)元活動(dòng)。

-(2)**行為學(xué)**：記錄給藥后即時(shí)行為變化，如利血平（血清素能抑制劑）是否減少自主探索行為。

-**長(zhǎng)期效應(yīng)**：

-(1)**慢性記錄**：對(duì)于慢性植入的電極，定期更換電極接口，記錄藥物干預(yù)后的神經(jīng)活動(dòng)適應(yīng)性變化。

-(2)**組織學(xué)驗(yàn)證**：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)注射部位進(jìn)行CresylViolet染色，確認(rèn)注射坐標(biāo)及神經(jīng)損傷情況（損傷面積<5%）。

####（四）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.**實(shí)驗(yàn)范式選擇**：

-**開(kāi)箱實(shí)驗(yàn)**：評(píng)估焦慮行為，記錄動(dòng)物進(jìn)入箱中央次數(shù)、探索時(shí)間等指標(biāo)。

-**社交互動(dòng)測(cè)試**：評(píng)估社交能力，測(cè)量動(dòng)物與陌生鼠的接觸時(shí)間、攻擊行為頻率。

-**條件性位置偏好**：評(píng)估獎(jiǎng)賞學(xué)習(xí)，訓(xùn)練動(dòng)物在特定位置獲得獎(jiǎng)勵(lì)，記錄偏好程度。

2.**標(biāo)準(zhǔn)化流程**：

-(1)**環(huán)境控制**：實(shí)驗(yàn)在12:12小時(shí)光照循環(huán)、22±2°C、50±10%濕度環(huán)境下進(jìn)行。

-(2)**測(cè)試順序**：避免單次測(cè)試對(duì)后續(xù)測(cè)試產(chǎn)生干擾，通常采用拉丁方設(shè)計(jì)。

-(3)**數(shù)據(jù)采集**：使用行為學(xué)分析軟件（如NoldusEthoVision）自動(dòng)記錄，減少主觀誤差。

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###五、數(shù)據(jù)記錄與處理（續(xù)）

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄（續(xù)）

1.**電生理數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**同步記錄**：神經(jīng)信號(hào)需與肌電圖（EMG）、眼動(dòng)（EOG）同步記錄，用于排除運(yùn)動(dòng)偽跡。

-**注釋標(biāo)記**：在數(shù)據(jù)文件中標(biāo)記關(guān)鍵事件（如刺激、給藥、行為事件），方便后續(xù)分析。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**空間分析**：使用網(wǎng)格系統(tǒng)（如20x20cm網(wǎng)格）分析動(dòng)物位置分布，計(jì)算中心停留時(shí)間百分比。

-**時(shí)間序列分析**：對(duì)行為頻率進(jìn)行傅里葉變換，分析行為節(jié)律性（如睡眠-覺(jué)醒周期）。

####（二）數(shù)據(jù)分析（續(xù)）

1.**統(tǒng)計(jì)方法**：

-**重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)**：比較干預(yù)前后的變化，如使用重復(fù)測(cè)量ANOVA（如藥物干預(yù)前后的神經(jīng)元放電頻率）。

-**多變量分析**：使用主成分分析（PCA）或典型相關(guān)分析（CCA）處理多通道神經(jīng)數(shù)據(jù)或多維行為數(shù)據(jù)。

2.**數(shù)據(jù)可視化**：

-**神經(jīng)信號(hào)**：繪制單位放電率熱圖、場(chǎng)電位功率譜圖。

-**行為學(xué)**：使用箱線圖比較組間差異，散點(diǎn)圖分析行為參數(shù)相關(guān)性。

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###七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理（續(xù)）

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死（續(xù)）

1.**安樂(lè)死方法**：

-**過(guò)量麻醉**：緩慢注射異氟烷（1.5%-2.5%）至呼吸停止，確認(rèn)腦干反射消失。

-**其他方法**：使用過(guò)量巴比妥鈉（IP150mg/kg）或CO?窒息（需確保無(wú)痛苦）。

2.**尸體處理**：

-(1)**器官收集**：完整分離腦、肝、脾等器官，標(biāo)記后固定于4%多聚甲醛。

-(2)**數(shù)據(jù)歸檔**：整理實(shí)驗(yàn)記錄本，包括動(dòng)物編號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期、操作人員、原始數(shù)據(jù)文件路徑。

####（二）廢棄物處理（續(xù)）

1.**生物廢棄物**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體及組織樣本需放入生物安全桶，按生物危害等級(jí)（如BSL-2）處理。

2.**化學(xué)廢棄物**：廢棄培養(yǎng)基、試劑需分類儲(chǔ)存，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿單獨(dú)處理，有機(jī)溶劑集中焚燒。

3.**設(shè)備消毒**：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、器械使用后立即用70%乙醇消毒，定期用紫外線燈照射30分鐘。

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###八、質(zhì)量控制與校準(zhǔn)

####（一）設(shè)備校準(zhǔn)

1.**神經(jīng)記錄系統(tǒng)**：每月校準(zhǔn)放大器增益（±5%誤差），檢查接地電阻（<1MΩ）。

2.**行為學(xué)設(shè)備**：每周校準(zhǔn)攝像頭焦距，檢查運(yùn)動(dòng)傳感器靈敏度（±10%誤差）。

3.**給藥設(shè)備**：每日檢查注射泵流速（±2%誤差），校準(zhǔn)微量移液器（±1%誤差）。

####（二）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.**陽(yáng)性對(duì)照**：每次實(shí)驗(yàn)包含已知效應(yīng)的藥物（如阿撲嗎啡增加旋轉(zhuǎn)行為），驗(yàn)證系統(tǒng)功能。

2.**隨機(jī)化**：動(dòng)物分配、實(shí)驗(yàn)順序采用隨機(jī)化設(shè)計(jì)，避免偏倚。

3.**盲法操作**：數(shù)據(jù)分析時(shí)隱去實(shí)驗(yàn)組別信息，由第三方進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

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###九、應(yīng)急預(yù)案

####（一）設(shè)備故障

1.**神經(jīng)記錄中斷**：備用電極及記錄系統(tǒng)，記錄本中標(biāo)注故障時(shí)間及原因。

2.**行為學(xué)設(shè)備異常**：立即切換備用攝像頭或傳感器，記錄異常期間行為數(shù)據(jù)。

####（二）動(dòng)物意外

1.**麻醉過(guò)量**：立即停止給藥，使用人工呼吸輔助呼吸，聯(lián)系獸醫(yī)處理。

2.**手術(shù)感染**：觀察體溫（>39.5°C）、精神狀態(tài)，及時(shí)使用抗生素（如慶大霉素1mg/kg,IP,q24h）。

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###十、持續(xù)改進(jìn)

1.**定期培訓(xùn)**：每季度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，內(nèi)容涵蓋新設(shè)備操作、數(shù)據(jù)分析方法。

2.**文獻(xiàn)調(diào)研**：每月閱讀領(lǐng)域內(nèi)最新綜述，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案（如改進(jìn)電極制作工藝、優(yōu)化給藥劑量）。

3.**數(shù)據(jù)共享**：將標(biāo)準(zhǔn)化操作流程上傳至實(shí)驗(yàn)室共享平臺(tái)，鼓勵(lì)組內(nèi)成員反饋改進(jìn)建議。

###一、概述

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在研究動(dòng)物的行為與其神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系，通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法揭示行為產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制。為確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、倫理性和規(guī)范性，需遵循以下實(shí)驗(yàn)規(guī)定。本規(guī)定適用于所有涉及動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)操作，包括但不限于電生理記錄、神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)、行為觀察等實(shí)驗(yàn)。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

1.**物種選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型，常見(jiàn)物種包括小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等。選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮物種的神經(jīng)生物學(xué)特性、行為學(xué)基礎(chǔ)及倫理可行性。

2.**年齡與性別**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)處于健康、發(fā)育成熟的階段，具體年齡和性別需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。例如，小鼠實(shí)驗(yàn)通常選用4-8周齡的成年個(gè)體。

3.**遺傳背景**：若需特定遺傳背景的動(dòng)物，應(yīng)使用純合子或雜合子系，并記錄其譜系信息。

####（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.**設(shè)備準(zhǔn)備**：

-電生理記錄系統(tǒng)（如多通道放大器、信號(hào)采集卡）；

-行為學(xué)測(cè)試箱（如開(kāi)箱測(cè)試箱、曠場(chǎng)箱）；

-神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)裝置（如注射器、微量泵）；

-數(shù)據(jù)分析軟件（如MATLAB、Python）。

2.**試劑配制**：

-神經(jīng)遞質(zhì)類似物、拮抗劑需精確配制，并標(biāo)注配制日期、濃度及儲(chǔ)存條件。

-試劑需使用高純度原料，避免雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

####（一）動(dòng)物麻醉與固定

1.**麻醉方法**：采用吸入性麻醉（如異氟烷）或注射性麻醉（如戊巴比妥），麻醉劑量需根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整。例如，小鼠異氟烷濃度通常為1.5%-2.5%。

2.**固定方式**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的固定裝置，確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持穩(wěn)定，避免二次傷害。固定前需涂抹凡士林保護(hù)皮膚。

####（二）神經(jīng)電生理記錄

1.**電極植入**：

-使用單支或多支玻璃微電極，植入腦區(qū)需參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜定位。

-電極阻抗需在1-5MΩ范圍內(nèi)，以減少信號(hào)噪聲。

2.**記錄步驟**：

-(1)清潔手術(shù)區(qū)域，消毒后進(jìn)行切開(kāi)；

-(2)電極緩慢植入目標(biāo)腦區(qū)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)；

-(3)記錄數(shù)據(jù)時(shí)需同步記錄行為指標(biāo)，如運(yùn)動(dòng)頻率、眨眼次數(shù)等。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)

1.**給藥途徑**：

-靜脈注射、腦室內(nèi)注射或腹腔注射，給藥劑量需預(yù)先驗(yàn)證安全性。

-例如，大鼠腦室內(nèi)注射通常使用5μLsterilesaline或藥物溶液。

2.**效應(yīng)評(píng)估**：

-干預(yù)前后需進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，如步幅分析、探索行為評(píng)分等。

-數(shù)據(jù)需采用配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

###四、數(shù)據(jù)記錄與處理

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄

1.**電生理數(shù)據(jù)**：實(shí)時(shí)保存神經(jīng)信號(hào)，記錄采樣頻率、濾波范圍等參數(shù)。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**：使用視頻記錄系統(tǒng)同步記錄，標(biāo)注時(shí)間戳及事件類型。

####（二）數(shù)據(jù)分析

1.**數(shù)據(jù)預(yù)處理**：去除偽跡信號(hào)，如肌肉運(yùn)動(dòng)干擾、電極漂移等。

2.**統(tǒng)計(jì)分析**：采用重復(fù)測(cè)量方差分析（RepeatedMeasuresANOVA）或相關(guān)分析，評(píng)估干預(yù)效應(yīng)。

###五、實(shí)驗(yàn)倫理與安全

####（一）倫理審查

1.所有實(shí)驗(yàn)需通過(guò)機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)（IACUC）審查，確保符合3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.實(shí)驗(yàn)方案需明確動(dòng)物數(shù)量、處理方法及疼痛緩解措施。

####（二）安全操作

1.實(shí)驗(yàn)人員需佩戴防護(hù)設(shè)備，如手套、護(hù)目鏡等。

2.化學(xué)試劑需分類儲(chǔ)存，避免泄漏。

###六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死

1.采用安樂(lè)死方法（如過(guò)量麻醉）需符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，避免動(dòng)物痛苦。

2.安樂(lè)死過(guò)程需記錄時(shí)間及操作人員。

####（二）廢棄物處理

1.組織樣本需固定于4%多聚甲醛，標(biāo)記后儲(chǔ)存。

2.化學(xué)廢棄物需按規(guī)范分類處理，避免環(huán)境污染。

###七、總結(jié)

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄及倫理安全要求，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。所有實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)，熟悉相關(guān)操作流程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范（續(xù)）

####（二）神經(jīng)電生理記錄（續(xù)）

1.**電極植入**（續(xù)）：

-**電極類型選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇不同類型的電極，如：

-**玻璃微電極**：適用于單細(xì)胞或小群體神經(jīng)元放電記錄，具有高空間分辨率。制作方法包括拉制玻璃毛細(xì)管，使用微電極拉制器（如SutterInstrumentsP-97）控制拉制參數(shù)（如玻璃管直徑、拉制溫度、拉制速度），最終形成尖端直徑1-5μm的電極，阻抗在1-5MΩ范圍內(nèi)。

-**微電極陣列**：適用于多單位放電或局部場(chǎng)電位（LFP）記錄，常用型號(hào)如MultichannelSystems(MCS)的MA1000系列，包含32-256個(gè)通道，適用于大規(guī)模神經(jīng)元活動(dòng)研究。

-**柔性電極**：適用于植入腦深部或進(jìn)行慢性記錄，材料如鉑銥合金或碳纖維，表面鍍銀以增強(qiáng)信號(hào)。

-**腦區(qū)定位**：

-參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜（如《ratbraininstereotaxiccoordinates》）確定坐標(biāo)，常用腦區(qū)包括海馬體（用于學(xué)習(xí)記憶研究）、杏仁核（用于情緒研究）、伏隔核（用于獎(jiǎng)賞研究）。定位工具需使用立體定位儀（StereotaxicFrame，如DavidKopfInstruments），確保坐標(biāo)精度在0.1mm以內(nèi)。

-定位前需在動(dòng)物頭部固定金屬柱，用于固定立體定位儀，柱位置需根據(jù)動(dòng)物顱骨結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免損傷血管或腦組織。

-**手術(shù)操作**：

-(1)**術(shù)前準(zhǔn)備**：動(dòng)物術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水，使用脫毛劑去除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，75%乙醇消毒。

-(2)**顱骨開(kāi)窗**：使用牙科鉆在目標(biāo)腦區(qū)顱骨上鉆直徑1-2mm的孔，避免損傷硬腦膜。開(kāi)窗后用生理鹽水棉片覆蓋，防止腦組織干燥。

-(3)**電極植入**：緩慢推進(jìn)電極，速率不超過(guò)0.5mm/min，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)，確認(rèn)電極位于目標(biāo)區(qū)域。植入深度需參考腦圖譜，并記錄實(shí)際坐標(biāo)。

-(4)**封固**：用牙科水泥將電極固定柱與顱骨連接，確保長(zhǎng)期穩(wěn)定。表面覆蓋透明硅膠膜，防止感染并保護(hù)電極。

2.**記錄步驟**（續(xù)）：

-**信號(hào)采集**：

-(1)**濾波設(shè)置**：根據(jù)信號(hào)類型選擇濾波范圍，如單細(xì)胞放電記錄常用0.1-3kHz，LFP記錄常用1-100Hz。

-(2)**采樣率**：不低于信號(hào)帶寬的5倍，如記錄1kHz信號(hào)需設(shè)置采樣率≥5kHz。

-(3)**參照電極**：使用銀氯化物電極放置在枕葉或參考電極夾，減少噪聲干擾。

-**行為同步記錄**：

-(1)**視頻系統(tǒng)**：使用高清攝像頭（如SonyA7S）固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，分辨率≥1080p，幀率≥30fps。

-(2)**事件標(biāo)記**：在視頻記錄軟件（如EthoVisionXT）中設(shè)置事件標(biāo)記（如探索、回避、攻擊），自動(dòng)統(tǒng)計(jì)行為頻率。

-(3)**時(shí)間同步**：確保神經(jīng)信號(hào)記錄器與視頻系統(tǒng)時(shí)間戳同步，誤差控制在±1ms以內(nèi)。

-**信號(hào)處理**：

-(1)**偽跡去除**：使用數(shù)字濾波器（如帶通濾波、陷波濾波）去除50/60Hz工頻干擾及肌肉運(yùn)動(dòng)偽跡。

-(2)**單元分選**：若記錄多單位信號(hào)，使用波幅閾值、波形模板匹配等方法分選單個(gè)神經(jīng)元信號(hào)（如Plexon'sOfflineSorter）。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)（續(xù)）

1.**給藥途徑**（續(xù)）：

-**腦室內(nèi)注射**：

-(1)**坐標(biāo)定位**：參照腦圖譜設(shè)定注射坐標(biāo)（如前囟0.8mm,L:1.5mm,V:3.0mm,A:-2.5mm），確保注射針頭進(jìn)入腦室系統(tǒng)。

-(2)**注射參數(shù)**：注射速率0.5-2μL/min，總劑量≤10μL，注射后停留1-2min防止反流。常用工具為微注射泵（如RadelSystemsModel702）。

-(3)**對(duì)照組設(shè)置**：設(shè)立假注射組（注射等體積生理鹽水），排除溶劑效應(yīng)。

-**紋狀體微透析**：

-(1)**探針植入**：使用立體定位儀將微透析探針（內(nèi)徑20-50μm）植入目標(biāo)區(qū)域（如伏隔核），用組織膠固定。

-(2)**灌流系統(tǒng)**：連接體外灌流泵（如CMA/110），以1-5μL/min流速灌流人工腦脊液（ACSF，含NaCl150mM,KCl3mM,CaCl?1.3mM,MgSO?1.2mM,glucose10mM,HEPES10mM,pH7.4）。

-(3)**樣本收集**：收集流出液，使用電導(dǎo)率儀監(jiān)測(cè)流速，計(jì)算回收率（通常80%-90%）。

-**經(jīng)皮給藥**：

-(1)**透皮技術(shù)**：使用電穿孔（如GenePulserXcell，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度200-500V/cm,脈寬1-2ms,頻率1Hz）或離子導(dǎo)入（如NeuroPore，電壓5-15V）增強(qiáng)藥物透皮吸收。

-(2)**藥物濃度**：皮內(nèi)注射或透皮給藥的藥物濃度需高于腦內(nèi)自由濃度，常用劑量范圍（mg/kg）：皮質(zhì)醇0.1-1.0,多巴胺類似物0.01-0.1。

2.**效應(yīng)評(píng)估**（續(xù)）：

-**短期效應(yīng)**：

-(1)**電生理**：觀察給藥后神經(jīng)元放電頻率、同步性變化，如多巴胺能藥物是否增加獎(jiǎng)賞相關(guān)腦區(qū)（伏隔核）的神經(jīng)元活動(dòng)。

-(2)**行為學(xué)**：記錄給藥后即時(shí)行為變化，如利血平（血清素能抑制劑）是否減少自主探索行為。

-**長(zhǎng)期效應(yīng)**：

-(1)**慢性記錄**：對(duì)于慢性植入的電極，定期更換電極接口，記錄藥物干預(yù)后的神經(jīng)活動(dòng)適應(yīng)性變化。

-(2)**組織學(xué)驗(yàn)證**：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)注射部位進(jìn)行CresylViolet染色，確認(rèn)注射坐標(biāo)及神經(jīng)損傷情況（損傷面積<5%）。

####（四）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.**實(shí)驗(yàn)范式選擇**：

-**開(kāi)箱實(shí)驗(yàn)**：評(píng)估焦慮行為，記錄動(dòng)物進(jìn)入箱中央次數(shù)、探索時(shí)間等指標(biāo)。

-**社交互動(dòng)測(cè)試**：評(píng)估社交能力，測(cè)量動(dòng)物與陌生鼠的接觸時(shí)間、攻擊行為頻率。

-**條件性位置偏好**：評(píng)估獎(jiǎng)賞學(xué)習(xí)，訓(xùn)練動(dòng)物在特定位置獲得獎(jiǎng)勵(lì)，記錄偏好程度。

2.**標(biāo)準(zhǔn)化流程**：

-(1)**環(huán)境控制**：實(shí)驗(yàn)在12:12小時(shí)光照循環(huán)、22±2°C、50±10%濕度環(huán)境下進(jìn)行。

-(2)**測(cè)試順序**：避免單次測(cè)試對(duì)后續(xù)測(cè)試產(chǎn)生干擾，通常采用拉丁方設(shè)計(jì)。

-(3)**數(shù)據(jù)采集**：使用行為學(xué)分析軟件（如NoldusEthoVision）自動(dòng)記錄，減少主觀誤差。

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###五、數(shù)據(jù)記錄與處理（續(xù)）

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄（續(xù)）

1.**電生理數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**同步記錄**：神經(jīng)信號(hào)需與肌電圖（EMG）、眼動(dòng)（EOG）同步記錄，用于排除運(yùn)動(dòng)偽跡。

-**注釋標(biāo)記**：在數(shù)據(jù)文件中標(biāo)記關(guān)鍵事件（如刺激、給藥、行為事件），方便后續(xù)分析。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**空間分析**：使用網(wǎng)格系統(tǒng)（如20x20cm網(wǎng)格）分析動(dòng)物位置分布，計(jì)算中心停留時(shí)間百分比。

-**時(shí)間序列分析**：對(duì)行為頻率進(jìn)行傅里葉變換，分析行為節(jié)律性（如睡眠-覺(jué)醒周期）。

####（二）數(shù)據(jù)分析（續(xù)）

1.**統(tǒng)計(jì)方法**：

-**重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)**：比較干預(yù)前后的變化，如使用重復(fù)測(cè)量ANOVA（如藥物干預(yù)前后的神經(jīng)元放電頻率）。

-**多變量分析**：使用主成分分析（PCA）或典型相關(guān)分析（CCA）處理多通道神經(jīng)數(shù)據(jù)或多維行為數(shù)據(jù)。

2.**數(shù)據(jù)可視化**：

-**神經(jīng)信號(hào)**：繪制單位放電率熱圖、場(chǎng)電位功率譜圖。

-**行為學(xué)**：使用箱線圖比較組間差異，散點(diǎn)圖分析行為參數(shù)相關(guān)性。

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###七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理（續(xù)）

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死（續(xù)）

1.**安樂(lè)死方法**：

-**過(guò)量麻醉**：緩慢注射異氟烷（1.5%-2.5%）至呼吸停止，確認(rèn)腦干反射消失。

-**其他方法**：使用過(guò)量巴比妥鈉（IP150mg/kg）或CO?窒息（需確保無(wú)痛苦）。

2.**尸體處理**：

-(1)**器官收集**：完整分離腦、肝、脾等器官，標(biāo)記后固定于4%多聚甲醛。

-(2)**數(shù)據(jù)歸檔**：整理實(shí)驗(yàn)記錄本，包括動(dòng)物編號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期、操作人員、原始數(shù)據(jù)文件路徑。

####（二）廢棄物處理（續(xù)）

1.**生物廢棄物**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體及組織樣本需放入生物安全桶，按生物危害等級(jí)（如BSL-2）處理。

2.**化學(xué)廢棄物**：廢棄培養(yǎng)基、試劑需分類儲(chǔ)存，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿單獨(dú)處理，有機(jī)溶劑集中焚燒。

3.**設(shè)備消毒**：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、器械使用后立即用70%乙醇消毒，定期用紫外線燈照射30分鐘。

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###八、質(zhì)量控制與校準(zhǔn)

####（一）設(shè)備校準(zhǔn)

1.**神經(jīng)記錄系統(tǒng)**：每月校準(zhǔn)放大器增益（±5%誤差），檢查接地電阻（<1MΩ）。

2.**行為學(xué)設(shè)備**：每周校準(zhǔn)攝像頭焦距，檢查運(yùn)動(dòng)傳感器靈敏度（±10%誤差）。

3.**給藥設(shè)備**：每日檢查注射泵流速（±2%誤差），校準(zhǔn)微量移液器（±1%誤差）。

####（二）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.**陽(yáng)性對(duì)照**：每次實(shí)驗(yàn)包含已知效應(yīng)的藥物（如阿撲嗎啡增加旋轉(zhuǎn)行為），驗(yàn)證系統(tǒng)功能。

2.**隨機(jī)化**：動(dòng)物分配、實(shí)驗(yàn)順序采用隨機(jī)化設(shè)計(jì)，避免偏倚。

3.**盲法操作**：數(shù)據(jù)分析時(shí)隱去實(shí)驗(yàn)組別信息，由第三方進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

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###九、應(yīng)急預(yù)案

####（一）設(shè)備故障

1.**神經(jīng)記錄中斷**：備用電極及記錄系統(tǒng)，記錄本中標(biāo)注故障時(shí)間及原因。

2.**行為學(xué)設(shè)備異常**：立即切換備用攝像頭或傳感器，記錄異常期間行為數(shù)據(jù)。

####（二）動(dòng)物意外

1.**麻醉過(guò)量**：立即停止給藥，使用人工呼吸輔助呼吸，聯(lián)系獸醫(yī)處理。

2.**手術(shù)感染**：觀察體溫（>39.5°C）、精神狀態(tài)，及時(shí)使用抗生素（如慶大霉素1mg/kg,IP,q24h）。

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###十、持續(xù)改進(jìn)

1.**定期培訓(xùn)**：每季度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，內(nèi)容涵蓋新設(shè)備操作、數(shù)據(jù)分析方法。

2.**文獻(xiàn)調(diào)研**：每月閱讀領(lǐng)域內(nèi)最新綜述，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案（如改進(jìn)電極制作工藝、優(yōu)化給藥劑量）。

3.**數(shù)據(jù)共享**：將標(biāo)準(zhǔn)化操作流程上傳至實(shí)驗(yàn)室共享平臺(tái)，鼓勵(lì)組內(nèi)成員反饋改進(jìn)建議。

###一、概述

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在研究動(dòng)物的行為與其神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系，通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法揭示行為產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制。為確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、倫理性和規(guī)范性，需遵循以下實(shí)驗(yàn)規(guī)定。本規(guī)定適用于所有涉及動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)操作，包括但不限于電生理記錄、神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)、行為觀察等實(shí)驗(yàn)。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

1.**物種選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型，常見(jiàn)物種包括小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等。選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮物種的神經(jīng)生物學(xué)特性、行為學(xué)基礎(chǔ)及倫理可行性。

2.**年齡與性別**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)處于健康、發(fā)育成熟的階段，具體年齡和性別需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。例如，小鼠實(shí)驗(yàn)通常選用4-8周齡的成年個(gè)體。

3.**遺傳背景**：若需特定遺傳背景的動(dòng)物，應(yīng)使用純合子或雜合子系，并記錄其譜系信息。

####（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.**設(shè)備準(zhǔn)備**：

-電生理記錄系統(tǒng)（如多通道放大器、信號(hào)采集卡）；

-行為學(xué)測(cè)試箱（如開(kāi)箱測(cè)試箱、曠場(chǎng)箱）；

-神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)裝置（如注射器、微量泵）；

-數(shù)據(jù)分析軟件（如MATLAB、Python）。

2.**試劑配制**：

-神經(jīng)遞質(zhì)類似物、拮抗劑需精確配制，并標(biāo)注配制日期、濃度及儲(chǔ)存條件。

-試劑需使用高純度原料，避免雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

####（一）動(dòng)物麻醉與固定

1.**麻醉方法**：采用吸入性麻醉（如異氟烷）或注射性麻醉（如戊巴比妥），麻醉劑量需根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整。例如，小鼠異氟烷濃度通常為1.5%-2.5%。

2.**固定方式**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的固定裝置，確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持穩(wěn)定，避免二次傷害。固定前需涂抹凡士林保護(hù)皮膚。

####（二）神經(jīng)電生理記錄

1.**電極植入**：

-使用單支或多支玻璃微電極，植入腦區(qū)需參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜定位。

-電極阻抗需在1-5MΩ范圍內(nèi)，以減少信號(hào)噪聲。

2.**記錄步驟**：

-(1)清潔手術(shù)區(qū)域，消毒后進(jìn)行切開(kāi)；

-(2)電極緩慢植入目標(biāo)腦區(qū)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)；

-(3)記錄數(shù)據(jù)時(shí)需同步記錄行為指標(biāo)，如運(yùn)動(dòng)頻率、眨眼次數(shù)等。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)

1.**給藥途徑**：

-靜脈注射、腦室內(nèi)注射或腹腔注射，給藥劑量需預(yù)先驗(yàn)證安全性。

-例如，大鼠腦室內(nèi)注射通常使用5μLsterilesaline或藥物溶液。

2.**效應(yīng)評(píng)估**：

-干預(yù)前后需進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，如步幅分析、探索行為評(píng)分等。

-數(shù)據(jù)需采用配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

###四、數(shù)據(jù)記錄與處理

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄

1.**電生理數(shù)據(jù)**：實(shí)時(shí)保存神經(jīng)信號(hào)，記錄采樣頻率、濾波范圍等參數(shù)。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**：使用視頻記錄系統(tǒng)同步記錄，標(biāo)注時(shí)間戳及事件類型。

####（二）數(shù)據(jù)分析

1.**數(shù)據(jù)預(yù)處理**：去除偽跡信號(hào)，如肌肉運(yùn)動(dòng)干擾、電極漂移等。

2.**統(tǒng)計(jì)分析**：采用重復(fù)測(cè)量方差分析（RepeatedMeasuresANOVA）或相關(guān)分析，評(píng)估干預(yù)效應(yīng)。

###五、實(shí)驗(yàn)倫理與安全

####（一）倫理審查

1.所有實(shí)驗(yàn)需通過(guò)機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)（IACUC）審查，確保符合3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.實(shí)驗(yàn)方案需明確動(dòng)物數(shù)量、處理方法及疼痛緩解措施。

####（二）安全操作

1.實(shí)驗(yàn)人員需佩戴防護(hù)設(shè)備，如手套、護(hù)目鏡等。

2.化學(xué)試劑需分類儲(chǔ)存，避免泄漏。

###六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死

1.采用安樂(lè)死方法（如過(guò)量麻醉）需符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，避免動(dòng)物痛苦。

2.安樂(lè)死過(guò)程需記錄時(shí)間及操作人員。

####（二）廢棄物處理

1.組織樣本需固定于4%多聚甲醛，標(biāo)記后儲(chǔ)存。

2.化學(xué)廢棄物需按規(guī)范分類處理，避免環(huán)境污染。

###七、總結(jié)

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄及倫理安全要求，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。所有實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)，熟悉相關(guān)操作流程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范（續(xù)）

####（二）神經(jīng)電生理記錄（續(xù)）

1.**電極植入**（續(xù)）：

-**電極類型選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇不同類型的電極，如：

-**玻璃微電極**：適用于單細(xì)胞或小群體神經(jīng)元放電記錄，具有高空間分辨率。制作方法包括拉制玻璃毛細(xì)管，使用微電極拉制器（如SutterInstrumentsP-97）控制拉制參數(shù)（如玻璃管直徑、拉制溫度、拉制速度），最終形成尖端直徑1-5μm的電極，阻抗在1-5MΩ范圍內(nèi)。

-**微電極陣列**：適用于多單位放電或局部場(chǎng)電位（LFP）記錄，常用型號(hào)如MultichannelSystems(MCS)的MA1000系列，包含32-256個(gè)通道，適用于大規(guī)模神經(jīng)元活動(dòng)研究。

-**柔性電極**：適用于植入腦深部或進(jìn)行慢性記錄，材料如鉑銥合金或碳纖維，表面鍍銀以增強(qiáng)信號(hào)。

-**腦區(qū)定位**：

-參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜（如《ratbraininstereotaxiccoordinates》）確定坐標(biāo)，常用腦區(qū)包括海馬體（用于學(xué)習(xí)記憶研究）、杏仁核（用于情緒研究）、伏隔核（用于獎(jiǎng)賞研究）。定位工具需使用立體定位儀（StereotaxicFrame，如DavidKopfInstruments），確保坐標(biāo)精度在0.1mm以內(nèi)。

-定位前需在動(dòng)物頭部固定金屬柱，用于固定立體定位儀，柱位置需根據(jù)動(dòng)物顱骨結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免損傷血管或腦組織。

-**手術(shù)操作**：

-(1)**術(shù)前準(zhǔn)備**：動(dòng)物術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水，使用脫毛劑去除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，75%乙醇消毒。

-(2)**顱骨開(kāi)窗**：使用牙科鉆在目標(biāo)腦區(qū)顱骨上鉆直徑1-2mm的孔，避免損傷硬腦膜。開(kāi)窗后用生理鹽水棉片覆蓋，防止腦組織干燥。

-(3)**電極植入**：緩慢推進(jìn)電極，速率不超過(guò)0.5mm/min，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)，確認(rèn)電極位于目標(biāo)區(qū)域。植入深度需參考腦圖譜，并記錄實(shí)際坐標(biāo)。

-(4)**封固**：用牙科水泥將電極固定柱與顱骨連接，確保長(zhǎng)期穩(wěn)定。表面覆蓋透明硅膠膜，防止感染并保護(hù)電極。

2.**記錄步驟**（續(xù)）：

-**信號(hào)采集**：

-(1)**濾波設(shè)置**：根據(jù)信號(hào)類型選擇濾波范圍，如單細(xì)胞放電記錄常用0.1-3kHz，LFP記錄常用1-100Hz。

-(2)**采樣率**：不低于信號(hào)帶寬的5倍，如記錄1kHz信號(hào)需設(shè)置采樣率≥5kHz。

-(3)**參照電極**：使用銀氯化物電極放置在枕葉或參考電極夾，減少噪聲干擾。

-**行為同步記錄**：

-(1)**視頻系統(tǒng)**：使用高清攝像頭（如SonyA7S）固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，分辨率≥1080p，幀率≥30fps。

-(2)**事件標(biāo)記**：在視頻記錄軟件（如EthoVisionXT）中設(shè)置事件標(biāo)記（如探索、回避、攻擊），自動(dòng)統(tǒng)計(jì)行為頻率。

-(3)**時(shí)間同步**：確保神經(jīng)信號(hào)記錄器與視頻系統(tǒng)時(shí)間戳同步，誤差控制在±1ms以內(nèi)。

-**信號(hào)處理**：

-(1)**偽跡去除**：使用數(shù)字濾波器（如帶通濾波、陷波濾波）去除50/60Hz工頻干擾及肌肉運(yùn)動(dòng)偽跡。

-(2)**單元分選**：若記錄多單位信號(hào)，使用波幅閾值、波形模板匹配等方法分選單個(gè)神經(jīng)元信號(hào)（如Plexon'sOfflineSorter）。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)（續(xù)）

1.**給藥途徑**（續(xù)）：

-**腦室內(nèi)注射**：

-(1)**坐標(biāo)定位**：參照腦圖譜設(shè)定注射坐標(biāo)（如前囟0.8mm,L:1.5mm,V:3.0mm,A:-2.5mm），確保注射針頭進(jìn)入腦室系統(tǒng)。

-(2)**注射參數(shù)**：注射速率0.5-2μL/min，總劑量≤10μL，注射后停留1-2min防止反流。常用工具為微注射泵（如RadelSystemsModel702）。

-(3)**對(duì)照組設(shè)置**：設(shè)立假注射組（注射等體積生理鹽水），排除溶劑效應(yīng)。

-**紋狀體微透析**：

-(1)**探針植入**：使用立體定位儀將微透析探針（內(nèi)徑20-50μm）植入目標(biāo)區(qū)域（如伏隔核），用組織膠固定。

-(2)**灌流系統(tǒng)**：連接體外灌流泵（如CMA/110），以1-5μL/min流速灌流人工腦脊液（ACSF，含NaCl150mM,KCl3mM,CaCl?1.3mM,MgSO?1.2mM,glucose10mM,HEPES10mM,pH7.4）。

-(3)**樣本收集**：收集流出液，使用電導(dǎo)率儀監(jiān)測(cè)流速，計(jì)算回收率（通常80%-90%）。

-**經(jīng)皮給藥**：

-(1)**透皮技術(shù)**：使用電穿孔（如GenePulserXcell，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度200-500V/cm,脈寬1-2ms,頻率1Hz）或離子導(dǎo)入（如NeuroPore，電壓5-15V）增強(qiáng)藥物透皮吸收。

-(2)**藥物濃度**：皮內(nèi)注射或透皮給藥的藥物濃度需高于腦內(nèi)自由濃度，常用劑量范圍（mg/kg）：皮質(zhì)醇0.1-1.0,多巴胺類似物0.01-0.1。

2.**效應(yīng)評(píng)估**（續(xù)）：

-**短期效應(yīng)**：

-(1)**電生理**：觀察給藥后神經(jīng)元放電頻率、同步性變化，如多巴胺能藥物是否增加獎(jiǎng)賞相關(guān)腦區(qū)（伏隔核）的神經(jīng)元活動(dòng)。

-(2)**行為學(xué)**：記錄給藥后即時(shí)行為變化，如利血平（血清素能抑制劑）是否減少自主探索行為。

-**長(zhǎng)期效應(yīng)**：

-(1)**慢性記錄**：對(duì)于慢性植入的電極，定期更換電極接口，記錄藥物干預(yù)后的神經(jīng)活動(dòng)適應(yīng)性變化。

-(2)**組織學(xué)驗(yàn)證**：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)注射部位進(jìn)行CresylViolet染色，確認(rèn)注射坐標(biāo)及神經(jīng)損傷情況（損傷面積<5%）。

####（四）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.**實(shí)驗(yàn)范式選擇**：

-**開(kāi)箱實(shí)驗(yàn)**：評(píng)估焦慮行為，記錄動(dòng)物進(jìn)入箱中央次數(shù)、探索時(shí)間等指標(biāo)。

-**社交互動(dòng)測(cè)試**：評(píng)估社交能力，測(cè)量動(dòng)物與陌生鼠的接觸時(shí)間、攻擊行為頻率。

-**條件性位置偏好**：評(píng)估獎(jiǎng)賞學(xué)習(xí)，訓(xùn)練動(dòng)物在特定位置獲得獎(jiǎng)勵(lì)，記錄偏好程度。

2.**標(biāo)準(zhǔn)化流程**：

-(1)**環(huán)境控制**：實(shí)驗(yàn)在12:12小時(shí)光照循環(huán)、22±2°C、50±10%濕度環(huán)境下進(jìn)行。

-(2)**測(cè)試順序**：避免單次測(cè)試對(duì)后續(xù)測(cè)試產(chǎn)生干擾，通常采用拉丁方設(shè)計(jì)。

-(3)**數(shù)據(jù)采集**：使用行為學(xué)分析軟件（如NoldusEthoVision）自動(dòng)記錄，減少主觀誤差。

---

###五、數(shù)據(jù)記錄與處理（續(xù)）

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄（續(xù)）

1.**電生理數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**同步記錄**：神經(jīng)信號(hào)需與肌電圖（EMG）、眼動(dòng)（EOG）同步記錄，用于排除運(yùn)動(dòng)偽跡。

-**注釋標(biāo)記**：在數(shù)據(jù)文件中標(biāo)記關(guān)鍵事件（如刺激、給藥、行為事件），方便后續(xù)分析。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**空間分析**：使用網(wǎng)格系統(tǒng)（如20x20cm網(wǎng)格）分析動(dòng)物位置分布，計(jì)算中心停留時(shí)間百分比。

-**時(shí)間序列分析**：對(duì)行為頻率進(jìn)行傅里葉變換，分析行為節(jié)律性（如睡眠-覺(jué)醒周期）。

####（二）數(shù)據(jù)分析（續(xù)）

1.**統(tǒng)計(jì)方法**：

-**重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)**：比較干預(yù)前后的變化，如使用重復(fù)測(cè)量ANOVA（如藥物干預(yù)前后的神經(jīng)元放電頻率）。

-**多變量分析**：使用主成分分析（PCA）或典型相關(guān)分析（CCA）處理多通道神經(jīng)數(shù)據(jù)或多維行為數(shù)據(jù)。

2.**數(shù)據(jù)可視化**：

-**神經(jīng)信號(hào)**：繪制單位放電率熱圖、場(chǎng)電位功率譜圖。

-**行為學(xué)**：使用箱線圖比較組間差異，散點(diǎn)圖分析行為參數(shù)相關(guān)性。

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###七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理（續(xù)）

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死（續(xù)）

1.**安樂(lè)死方法**：

-**過(guò)量麻醉**：緩慢注射異氟烷（1.5%-2.5%）至呼吸停止，確認(rèn)腦干反射消失。

-**其他方法**：使用過(guò)量巴比妥鈉（IP150mg/kg）或CO?窒息（需確保無(wú)痛苦）。

2.**尸體處理**：

-(1)**器官收集**：完整分離腦、肝、脾等器官，標(biāo)記后固定于4%多聚甲醛。

-(2)**數(shù)據(jù)歸檔**：整理實(shí)驗(yàn)記錄本，包括動(dòng)物編號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期、操作人員、原始數(shù)據(jù)文件路徑。

####（二）廢棄物處理（續(xù)）

1.**生物廢棄物**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體及組織樣本需放入生物安全桶，按生物危害等級(jí)（如BSL-2）處理。

2.**化學(xué)廢棄物**：廢棄培養(yǎng)基、試劑需分類儲(chǔ)存，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿單獨(dú)處理，有機(jī)溶劑集中焚燒。

3.**設(shè)備消毒**：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、器械使用后立即用70%乙醇消毒，定期用紫外線燈照射30分鐘。

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###八、質(zhì)量控制與校準(zhǔn)

####（一）設(shè)備校準(zhǔn)

1.**神經(jīng)記錄系統(tǒng)**：每月校準(zhǔn)放大器增益（±5%誤差），檢查接地電阻（<1MΩ）。

2.**行為學(xué)設(shè)備**：每周校準(zhǔn)攝像頭焦距，檢查運(yùn)動(dòng)傳感器靈敏度（±10%誤差）。

3.**給藥設(shè)備**：每日檢查注射泵流速（±2%誤差），校準(zhǔn)微量移液器（±1%誤差）。

####（二）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.**陽(yáng)性對(duì)照**：每次實(shí)驗(yàn)包含已知效應(yīng)的藥物（如阿撲嗎啡增加旋轉(zhuǎn)行為），驗(yàn)證系統(tǒng)功能。

2.**隨機(jī)化**：動(dòng)物分配、實(shí)驗(yàn)順序采用隨機(jī)化設(shè)計(jì)，避免偏倚。

3.**盲法操作**：數(shù)據(jù)分析時(shí)隱去實(shí)驗(yàn)組別信息，由第三方進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

---

###九、應(yīng)急預(yù)案

####（一）設(shè)備故障

1.**神經(jīng)記錄中斷**：備用電極及記錄系統(tǒng)，記錄本中標(biāo)注故障時(shí)間及原因。

2.**行為學(xué)設(shè)備異常**：立即切換備用攝像頭或傳感器，記錄異常期間行為數(shù)據(jù)。

####（二）動(dòng)物意外

1.**麻醉過(guò)量**：立即停止給藥，使用人工呼吸輔助呼吸，聯(lián)系獸醫(yī)處理。

2.**手術(shù)感染**：觀察體溫（>39.5°C）、精神狀態(tài)，及時(shí)使用抗生素（如慶大霉素1mg/kg,IP,q24h）。

---

###十、持續(xù)改進(jìn)

1.**定期培訓(xùn)**：每季度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，內(nèi)容涵蓋新設(shè)備操作、數(shù)據(jù)分析方法。

2.**文獻(xiàn)調(diào)研**：每月閱讀領(lǐng)域內(nèi)最新綜述，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案（如改進(jìn)電極制作工藝、優(yōu)化給藥劑量）。

3.**數(shù)據(jù)共享**：將標(biāo)準(zhǔn)化操作流程上傳至實(shí)驗(yàn)室共享平臺(tái)，鼓勵(lì)組內(nèi)成員反饋改進(jìn)建議。

###一、概述

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在研究動(dòng)物的行為與其神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系，通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法揭示行為產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制。為確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、倫理性和規(guī)范性，需遵循以下實(shí)驗(yàn)規(guī)定。本規(guī)定適用于所有涉及動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)操作，包括但不限于電生理記錄、神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)、行為觀察等實(shí)驗(yàn)。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

1.**物種選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型，常見(jiàn)物種包括小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等。選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮物種的神經(jīng)生物學(xué)特性、行為學(xué)基礎(chǔ)及倫理可行性。

2.**年齡與性別**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)處于健康、發(fā)育成熟的階段，具體年齡和性別需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。例如，小鼠實(shí)驗(yàn)通常選用4-8周齡的成年個(gè)體。

3.**遺傳背景**：若需特定遺傳背景的動(dòng)物，應(yīng)使用純合子或雜合子系，并記錄其譜系信息。

####（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.**設(shè)備準(zhǔn)備**：

-電生理記錄系統(tǒng)（如多通道放大器、信號(hào)采集卡）；

-行為學(xué)測(cè)試箱（如開(kāi)箱測(cè)試箱、曠場(chǎng)箱）；

-神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)裝置（如注射器、微量泵）；

-數(shù)據(jù)分析軟件（如MATLAB、Python）。

2.**試劑配制**：

-神經(jīng)遞質(zhì)類似物、拮抗劑需精確配制，并標(biāo)注配制日期、濃度及儲(chǔ)存條件。

-試劑需使用高純度原料，避免雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

####（一）動(dòng)物麻醉與固定

1.**麻醉方法**：采用吸入性麻醉（如異氟烷）或注射性麻醉（如戊巴比妥），麻醉劑量需根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整。例如，小鼠異氟烷濃度通常為1.5%-2.5%。

2.**固定方式**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的固定裝置，確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持穩(wěn)定，避免二次傷害。固定前需涂抹凡士林保護(hù)皮膚。

####（二）神經(jīng)電生理記錄

1.**電極植入**：

-使用單支或多支玻璃微電極，植入腦區(qū)需參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜定位。

-電極阻抗需在1-5MΩ范圍內(nèi)，以減少信號(hào)噪聲。

2.**記錄步驟**：

-(1)清潔手術(shù)區(qū)域，消毒后進(jìn)行切開(kāi)；

-(2)電極緩慢植入目標(biāo)腦區(qū)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)；

-(3)記錄數(shù)據(jù)時(shí)需同步記錄行為指標(biāo)，如運(yùn)動(dòng)頻率、眨眼次數(shù)等。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)

1.**給藥途徑**：

-靜脈注射、腦室內(nèi)注射或腹腔注射，給藥劑量需預(yù)先驗(yàn)證安全性。

-例如，大鼠腦室內(nèi)注射通常使用5μLsterilesaline或藥物溶液。

2.**效應(yīng)評(píng)估**：

-干預(yù)前后需進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，如步幅分析、探索行為評(píng)分等。

-數(shù)據(jù)需采用配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

###四、數(shù)據(jù)記錄與處理

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄

1.**電生理數(shù)據(jù)**：實(shí)時(shí)保存神經(jīng)信號(hào)，記錄采樣頻率、濾波范圍等參數(shù)。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**：使用視頻記錄系統(tǒng)同步記錄，標(biāo)注時(shí)間戳及事件類型。

####（二）數(shù)據(jù)分析

1.**數(shù)據(jù)預(yù)處理**：去除偽跡信號(hào)，如肌肉運(yùn)動(dòng)干擾、電極漂移等。

2.**統(tǒng)計(jì)分析**：采用重復(fù)測(cè)量方差分析（RepeatedMeasuresANOVA）或相關(guān)分析，評(píng)估干預(yù)效應(yīng)。

###五、實(shí)驗(yàn)倫理與安全

####（一）倫理審查

1.所有實(shí)驗(yàn)需通過(guò)機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)（IACUC）審查，確保符合3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.實(shí)驗(yàn)方案需明確動(dòng)物數(shù)量、處理方法及疼痛緩解措施。

####（二）安全操作

1.實(shí)驗(yàn)人員需佩戴防護(hù)設(shè)備，如手套、護(hù)目鏡等。

2.化學(xué)試劑需分類儲(chǔ)存，避免泄漏。

###六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死

1.采用安樂(lè)死方法（如過(guò)量麻醉）需符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，避免動(dòng)物痛苦。

2.安樂(lè)死過(guò)程需記錄時(shí)間及操作人員。

####（二）廢棄物處理

1.組織樣本需固定于4%多聚甲醛，標(biāo)記后儲(chǔ)存。

2.化學(xué)廢棄物需按規(guī)范分類處理，避免環(huán)境污染。

###七、總結(jié)

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄及倫理安全要求，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。所有實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)，熟悉相關(guān)操作流程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范（續(xù)）

####（二）神經(jīng)電生理記錄（續(xù)）

1.**電極植入**（續(xù)）：

-**電極類型選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇不同類型的電極，如：

-**玻璃微電極**：適用于單細(xì)胞或小群體神經(jīng)元放電記錄，具有高空間分辨率。制作方法包括拉制玻璃毛細(xì)管，使用微電極拉制器（如SutterInstrumentsP-97）控制拉制參數(shù)（如玻璃管直徑、拉制溫度、拉制速度），最終形成尖端直徑1-5μm的電極，阻抗在1-5MΩ范圍內(nèi)。

-**微電極陣列**：適用于多單位放電或局部場(chǎng)電位（LFP）記錄，常用型號(hào)如MultichannelSystems(MCS)的MA1000系列，包含32-256個(gè)通道，適用于大規(guī)模神經(jīng)元活動(dòng)研究。

-**柔性電極**：適用于植入腦深部或進(jìn)行慢性記錄，材料如鉑銥合金或碳纖維，表面鍍銀以增強(qiáng)信號(hào)。

-**腦區(qū)定位**：

-參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜（如《ratbraininstereotaxiccoordinates》）確定坐標(biāo)，常用腦區(qū)包括海馬體（用于學(xué)習(xí)記憶研究）、杏仁核（用于情緒研究）、伏隔核（用于獎(jiǎng)賞研究）。定位工具需使用立體定位儀（StereotaxicFrame，如DavidKopfInstruments），確保坐標(biāo)精度在0.1mm以內(nèi)。

-定位前需在動(dòng)物頭部固定金屬柱，用于固定立體定位儀，柱位置需根據(jù)動(dòng)物顱骨結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免損傷血管或腦組織。

-**手術(shù)操作**：

-(1)**術(shù)前準(zhǔn)備**：動(dòng)物術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水，使用脫毛劑去除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，75%乙醇消毒。

-(2)**顱骨開(kāi)窗**：使用牙科鉆在目標(biāo)腦區(qū)顱骨上鉆直徑1-2mm的孔，避免損傷硬腦膜。開(kāi)窗后用生理鹽水棉片覆蓋，防止腦組織干燥。

-(3)**電極植入**：緩慢推進(jìn)電極，速率不超過(guò)0.5mm/min，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)，確認(rèn)電極位于目標(biāo)區(qū)域。植入深度需參考腦圖譜，并記錄實(shí)際坐標(biāo)。

-(4)**封固**：用牙科水泥將電極固定柱與顱骨連接，確保長(zhǎng)期穩(wěn)定。表面覆蓋透明硅膠膜，防止感染并保護(hù)電極。

2.**記錄步驟**（續(xù)）：

-**信號(hào)采集**：

-(1)**濾波設(shè)置**：根據(jù)信號(hào)類型選擇濾波范圍，如單細(xì)胞放電記錄常用0.1-3kHz，LFP記錄常用1-100Hz。

-(2)**采樣率**：不低于信號(hào)帶寬的5倍，如記錄1kHz信號(hào)需設(shè)置采樣率≥5kHz。

-(3)**參照電極**：使用銀氯化物電極放置在枕葉或參考電極夾，減少噪聲干擾。

-**行為同步記錄**：

-(1)**視頻系統(tǒng)**：使用高清攝像頭（如SonyA7S）固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，分辨率≥1080p，幀率≥30fps。

-(2)**事件標(biāo)記**：在視頻記錄軟件（如EthoVisionXT）中設(shè)置事件標(biāo)記（如探索、回避、攻擊），自動(dòng)統(tǒng)計(jì)行為頻率。

-(3)**時(shí)間同步**：確保神經(jīng)信號(hào)記錄器與視頻系統(tǒng)時(shí)間戳同步，誤差控制在±1ms以內(nèi)。

-**信號(hào)處理**：

-(1)**偽跡去除**：使用數(shù)字濾波器（如帶通濾波、陷波濾波）去除50/60Hz工頻干擾及肌肉運(yùn)動(dòng)偽跡。

-(2)**單元分選**：若記錄多單位信號(hào)，使用波幅閾值、波形模板匹配等方法分選單個(gè)神經(jīng)元信號(hào)（如Plexon'sOfflineSorter）。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)（續(xù)）

1.**給藥途徑**（續(xù)）：

-**腦室內(nèi)注射**：

-(1)**坐標(biāo)定位**：參照腦圖譜設(shè)定注射坐標(biāo)（如前囟0.8mm,L:1.5mm,V:3.0mm,A:-2.5mm），確保注射針頭進(jìn)入腦室系統(tǒng)。

-(2)**注射參數(shù)**：注射速率0.5-2μL/min，總劑量≤10μL，注射后停留1-2min防止反流。常用工具為微注射泵（如RadelSystemsModel702）。

-(3)**對(duì)照組設(shè)置**：設(shè)立假注射組（注射等體積生理鹽水），排除溶劑效應(yīng)。

-**紋狀體微透析**：

-(1)**探針植入**：使用立體定位儀將微透析探針（內(nèi)徑20-50μm）植入目標(biāo)區(qū)域（如伏隔核），用組織膠固定。

-(2)**灌流系統(tǒng)**：連接體外灌流泵（如CMA/110），以1-5μL/min流速灌流人工腦脊液（ACSF，含NaCl150mM,KCl3mM,CaCl?1.3mM,MgSO?1.2mM,glucose10mM,HEPES10mM,pH7.4）。

-(3)**樣本收集**：收集流出液，使用電導(dǎo)率儀監(jiān)測(cè)流速，計(jì)算回收率（通常80%-90%）。

-**經(jīng)皮給藥**：

-(1)**透皮技術(shù)**：使用電穿孔（如GenePulserXcell，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度200-500V/cm,脈寬1-2ms,頻率1Hz）或離子導(dǎo)入（如NeuroPore，電壓5-15V）增強(qiáng)藥物透皮吸收。

-(2)**藥物濃度**：皮內(nèi)注射或透皮給藥的藥物濃度需高于腦內(nèi)自由濃度，常用劑量范圍（mg/kg）：皮質(zhì)醇0.1-1.0,多巴胺類似物0.01-0.1。

2.**效應(yīng)評(píng)估**（續(xù)）：

-**短期效應(yīng)**：

-(1)**電生理**：觀察給藥后神經(jīng)元放電頻率、同步性變化，如多巴胺能藥物是否增加獎(jiǎng)賞相關(guān)腦區(qū)（伏隔核）的神經(jīng)元活動(dòng)。

-(2)**行為學(xué)**：記錄給藥后即時(shí)行為變化，如利血平（血清素能抑制劑）是否減少自主探索行為。

-**長(zhǎng)期效應(yīng)**：

-(1)**慢性記錄**：對(duì)于慢性植入的電極，定期更換電極接口，記錄藥物干預(yù)后的神經(jīng)活動(dòng)適應(yīng)性變化。

-(2)**組織學(xué)驗(yàn)證**：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)注射部位進(jìn)行CresylViolet染色，確認(rèn)注射坐標(biāo)及神經(jīng)損傷情況（損傷面積<5%）。

####（四）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.**實(shí)驗(yàn)范式選擇**：

-**開(kāi)箱實(shí)驗(yàn)**：評(píng)估焦慮行為，記錄動(dòng)物進(jìn)入箱中央次數(shù)、探索時(shí)間等指標(biāo)。

-**社交互動(dòng)測(cè)試**：評(píng)估社交能力，測(cè)量動(dòng)物與陌生鼠的接觸時(shí)間、攻擊行為頻率。

-**條件性位置偏好**：評(píng)估獎(jiǎng)賞學(xué)習(xí)，訓(xùn)練動(dòng)物在特定位置獲得獎(jiǎng)勵(lì)，記錄偏好程度。

2.**標(biāo)準(zhǔn)化流程**：

-(1)**環(huán)境控制**：實(shí)驗(yàn)在12:12小時(shí)光照循環(huán)、22±2°C、50±10%濕度環(huán)境下進(jìn)行。

-(2)**測(cè)試順序**：避免單次測(cè)試對(duì)后續(xù)測(cè)試產(chǎn)生干擾，通常采用拉丁方設(shè)計(jì)。

-(3)**數(shù)據(jù)采集**：使用行為學(xué)分析軟件（如NoldusEthoVision）自動(dòng)記錄，減少主觀誤差。

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###五、數(shù)據(jù)記錄與處理（續(xù)）

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄（續(xù)）

1.**電生理數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**同步記錄**：神經(jīng)信號(hào)需與肌電圖（EMG）、眼動(dòng)（EOG）同步記錄，用于排除運(yùn)動(dòng)偽跡。

-**注釋標(biāo)記**：在數(shù)據(jù)文件中標(biāo)記關(guān)鍵事件（如刺激、給藥、行為事件），方便后續(xù)分析。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**（續(xù)）：

-**空間分析**：使用網(wǎng)格系統(tǒng)（如20x20cm網(wǎng)格）分析動(dòng)物位置分布，計(jì)算中心停留時(shí)間百分比。

-**時(shí)間序列分析**：對(duì)行為頻率進(jìn)行傅里葉變換，分析行為節(jié)律性（如睡眠-覺(jué)醒周期）。

####（二）數(shù)據(jù)分析（續(xù)）

1.**統(tǒng)計(jì)方法**：

-**重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)**：比較干預(yù)前后的變化，如使用重復(fù)測(cè)量ANOVA（如藥物干預(yù)前后的神經(jīng)元放電頻率）。

-**多變量分析**：使用主成分分析（PCA）或典型相關(guān)分析（CCA）處理多通道神經(jīng)數(shù)據(jù)或多維行為數(shù)據(jù)。

2.**數(shù)據(jù)可視化**：

-**神經(jīng)信號(hào)**：繪制單位放電率熱圖、場(chǎng)電位功率譜圖。

-**行為學(xué)**：使用箱線圖比較組間差異，散點(diǎn)圖分析行為參數(shù)相關(guān)性。

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###七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理（續(xù)）

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死（續(xù)）

1.**安樂(lè)死方法**：

-**過(guò)量麻醉**：緩慢注射異氟烷（1.5%-2.5%）至呼吸停止，確認(rèn)腦干反射消失。

-**其他方法**：使用過(guò)量巴比妥鈉（IP150mg/kg）或CO?窒息（需確保無(wú)痛苦）。

2.**尸體處理**：

-(1)**器官收集**：完整分離腦、肝、脾等器官，標(biāo)記后固定于4%多聚甲醛。

-(2)**數(shù)據(jù)歸檔**：整理實(shí)驗(yàn)記錄本，包括動(dòng)物編號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期、操作人員、原始數(shù)據(jù)文件路徑。

####（二）廢棄物處理（續(xù)）

1.**生物廢棄物**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體及組織樣本需放入生物安全桶，按生物危害等級(jí)（如BSL-2）處理。

2.**化學(xué)廢棄物**：廢棄培養(yǎng)基、試劑需分類儲(chǔ)存，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿單獨(dú)處理，有機(jī)溶劑集中焚燒。

3.**設(shè)備消毒**：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、器械使用后立即用70%乙醇消毒，定期用紫外線燈照射30分鐘。

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###八、質(zhì)量控制與校準(zhǔn)

####（一）設(shè)備校準(zhǔn)

1.**神經(jīng)記錄系統(tǒng)**：每月校準(zhǔn)放大器增益（±5%誤差），檢查接地電阻（<1MΩ）。

2.**行為學(xué)設(shè)備**：每周校準(zhǔn)攝像頭焦距，檢查運(yùn)動(dòng)傳感器靈敏度（±10%誤差）。

3.**給藥設(shè)備**：每日檢查注射泵流速（±2%誤差），校準(zhǔn)微量移液器（±1%誤差）。

####（二）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.**陽(yáng)性對(duì)照**：每次實(shí)驗(yàn)包含已知效應(yīng)的藥物（如阿撲嗎啡增加旋轉(zhuǎn)行為），驗(yàn)證系統(tǒng)功能。

2.**隨機(jī)化**：動(dòng)物分配、實(shí)驗(yàn)順序采用隨機(jī)化設(shè)計(jì)，避免偏倚。

3.**盲法操作**：數(shù)據(jù)分析時(shí)隱去實(shí)驗(yàn)組別信息，由第三方進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

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###九、應(yīng)急預(yù)案

####（一）設(shè)備故障

1.**神經(jīng)記錄中斷**：備用電極及記錄系統(tǒng)，記錄本中標(biāo)注故障時(shí)間及原因。

2.**行為學(xué)設(shè)備異常**：立即切換備用攝像頭或傳感器，記錄異常期間行為數(shù)據(jù)。

####（二）動(dòng)物意外

1.**麻醉過(guò)量**：立即停止給藥，使用人工呼吸輔助呼吸，聯(lián)系獸醫(yī)處理。

2.**手術(shù)感染**：觀察體溫（>39.5°C）、精神狀態(tài)，及時(shí)使用抗生素（如慶大霉素1mg/kg,IP,q24h）。

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###十、持續(xù)改進(jìn)

1.**定期培訓(xùn)**：每季度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，內(nèi)容涵蓋新設(shè)備操作、數(shù)據(jù)分析方法。

2.**文獻(xiàn)調(diào)研**：每月閱讀領(lǐng)域內(nèi)最新綜述，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案（如改進(jìn)電極制作工藝、優(yōu)化給藥劑量）。

3.**數(shù)據(jù)共享**：將標(biāo)準(zhǔn)化操作流程上傳至實(shí)驗(yàn)室共享平臺(tái)，鼓勵(lì)組內(nèi)成員反饋改進(jìn)建議。

###一、概述

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在研究動(dòng)物的行為與其神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系，通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法揭示行為產(chǎn)生的神經(jīng)機(jī)制。為確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、倫理性和規(guī)范性，需遵循以下實(shí)驗(yàn)規(guī)定。本規(guī)定適用于所有涉及動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)操作，包括但不限于電生理記錄、神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)、行為觀察等實(shí)驗(yàn)。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

####（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

1.**物種選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的動(dòng)物模型，常見(jiàn)物種包括小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等。選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮物種的神經(jīng)生物學(xué)特性、行為學(xué)基礎(chǔ)及倫理可行性。

2.**年齡與性別**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)處于健康、發(fā)育成熟的階段，具體年齡和性別需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。例如，小鼠實(shí)驗(yàn)通常選用4-8周齡的成年個(gè)體。

3.**遺傳背景**：若需特定遺傳背景的動(dòng)物，應(yīng)使用純合子或雜合子系，并記錄其譜系信息。

####（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

1.**設(shè)備準(zhǔn)備**：

-電生理記錄系統(tǒng)（如多通道放大器、信號(hào)采集卡）；

-行為學(xué)測(cè)試箱（如開(kāi)箱測(cè)試箱、曠場(chǎng)箱）；

-神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)裝置（如注射器、微量泵）；

-數(shù)據(jù)分析軟件（如MATLAB、Python）。

2.**試劑配制**：

-神經(jīng)遞質(zhì)類似物、拮抗劑需精確配制，并標(biāo)注配制日期、濃度及儲(chǔ)存條件。

-試劑需使用高純度原料，避免雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

####（一）動(dòng)物麻醉與固定

1.**麻醉方法**：采用吸入性麻醉（如異氟烷）或注射性麻醉（如戊巴比妥），麻醉劑量需根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整。例如，小鼠異氟烷濃度通常為1.5%-2.5%。

2.**固定方式**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的固定裝置，確保動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持穩(wěn)定，避免二次傷害。固定前需涂抹凡士林保護(hù)皮膚。

####（二）神經(jīng)電生理記錄

1.**電極植入**：

-使用單支或多支玻璃微電極，植入腦區(qū)需參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜定位。

-電極阻抗需在1-5MΩ范圍內(nèi)，以減少信號(hào)噪聲。

2.**記錄步驟**：

-(1)清潔手術(shù)區(qū)域，消毒后進(jìn)行切開(kāi)；

-(2)電極緩慢植入目標(biāo)腦區(qū)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)；

-(3)記錄數(shù)據(jù)時(shí)需同步記錄行為指標(biāo)，如運(yùn)動(dòng)頻率、眨眼次數(shù)等。

####（三）神經(jīng)藥理學(xué)干預(yù)

1.**給藥途徑**：

-靜脈注射、腦室內(nèi)注射或腹腔注射，給藥劑量需預(yù)先驗(yàn)證安全性。

-例如，大鼠腦室內(nèi)注射通常使用5μLsterilesaline或藥物溶液。

2.**效應(yīng)評(píng)估**：

-干預(yù)前后需進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，如步幅分析、探索行為評(píng)分等。

-數(shù)據(jù)需采用配對(duì)或非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

###四、數(shù)據(jù)記錄與處理

####（一）原始數(shù)據(jù)記錄

1.**電生理數(shù)據(jù)**：實(shí)時(shí)保存神經(jīng)信號(hào)，記錄采樣頻率、濾波范圍等參數(shù)。

2.**行為學(xué)數(shù)據(jù)**：使用視頻記錄系統(tǒng)同步記錄，標(biāo)注時(shí)間戳及事件類型。

####（二）數(shù)據(jù)分析

1.**數(shù)據(jù)預(yù)處理**：去除偽跡信號(hào)，如肌肉運(yùn)動(dòng)干擾、電極漂移等。

2.**統(tǒng)計(jì)分析**：采用重復(fù)測(cè)量方差分析（RepeatedMeasuresANOVA）或相關(guān)分析，評(píng)估干預(yù)效應(yīng)。

###五、實(shí)驗(yàn)倫理與安全

####（一）倫理審查

1.所有實(shí)驗(yàn)需通過(guò)機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)（IACUC）審查，確保符合3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.實(shí)驗(yàn)方案需明確動(dòng)物數(shù)量、處理方法及疼痛緩解措施。

####（二）安全操作

1.實(shí)驗(yàn)人員需佩戴防護(hù)設(shè)備，如手套、護(hù)目鏡等。

2.化學(xué)試劑需分類儲(chǔ)存，避免泄漏。

###六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束與廢棄物處理

####（一）動(dòng)物安樂(lè)死

1.采用安樂(lè)死方法（如過(guò)量麻醉）需符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，避免動(dòng)物痛苦。

2.安樂(lè)死過(guò)程需記錄時(shí)間及操作人員。

####（二）廢棄物處理

1.組織樣本需固定于4%多聚甲醛，標(biāo)記后儲(chǔ)存。

2.化學(xué)廢棄物需按規(guī)范分類處理，避免環(huán)境污染。

###七、總結(jié)

動(dòng)物行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄及倫理安全要求，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。所有實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)接受專業(yè)培訓(xùn)，熟悉相關(guān)操作流程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展。

###三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范（續(xù)）

####（二）神經(jīng)電生理記錄（續(xù)）

1.**電極植入**（續(xù)）：

-**電極類型選擇**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇不同類型的電極，如：

-**玻璃微電極**：適用于單細(xì)胞或小群體神經(jīng)元放電記錄，具有高空間分辨率。制作方法包括拉制玻璃毛細(xì)管，使用微電極拉制器（如SutterInstrumentsP-97）控制拉制參數(shù)（如玻璃管直徑、拉制溫度、拉制速度），最終形成尖端直徑1-5μm的電極，阻抗在1-5MΩ范圍內(nèi)。

-**微電極陣列**：適用于多單位放電或局部場(chǎng)電位（LFP）記錄，常用型號(hào)如MultichannelSystems(MCS)的MA1000系列，包含32-256個(gè)通道，適用于大規(guī)模神經(jīng)元活動(dòng)研究。

-**柔性電極**：適用于植入腦深部或進(jìn)行慢性記錄，材料如鉑銥合金或碳纖維，表面鍍銀以增強(qiáng)信號(hào)。

-**腦區(qū)定位**：

-參照標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜（如《ratbraininstereotaxiccoordinates》）確定坐標(biāo)，常用腦區(qū)包括海馬體（用于學(xué)習(xí)記憶研究）、杏仁核（用于情緒研究）、伏隔核（用于獎(jiǎng)賞研究）。定位工具需使用立體定位儀（StereotaxicFrame，如DavidKopfInstruments），確保坐標(biāo)精度在0.1mm以內(nèi)。

-定位前需在動(dòng)物頭部固定金屬柱，用于固定立體定位儀，柱位置需根據(jù)動(dòng)物顱骨結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免損傷血管或腦組織。

-**手術(shù)操作**：

-(1)**術(shù)前準(zhǔn)備**：動(dòng)物術(shù)前12小時(shí)禁食，自由飲水，使用脫毛劑去除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，75%乙醇消毒。

-(2)**顱骨開(kāi)窗**：使用牙科鉆在目標(biāo)腦區(qū)顱骨上鉆直徑1-2mm的孔，避免損傷硬腦膜。開(kāi)窗后用生理鹽水棉片覆蓋，防止腦組織干燥。

-(3)**電極植入**：緩慢推進(jìn)電極，速率不超過(guò)0.5mm/min，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)信號(hào)，確認(rèn)電極位于目標(biāo)區(qū)域。植入深度需參考腦圖譜，并記錄實(shí)際坐標(biāo)。

-(4)**封固**：用牙科水泥將電極固定柱與顱骨連接，確保長(zhǎng)期穩(wěn)定。表面覆蓋透明硅膠膜，防止感染并保護(hù)電極。

2.**記錄步驟**（續(xù)）：

-**信號(hào)采集**：

-(1)**濾波設(shè)置**：根據(jù)信號(hào)類型選擇濾波范圍，如單細(xì)胞放電記錄常用0.1-3kHz，LFP記錄常用1-100Hz。

-(2)**采樣率**：不低于信號(hào)帶寬的5倍，如記錄1kHz信號(hào)需設(shè)置采樣率≥5kHz。

-(3)**參照電極**：使用銀氯化物電極放置在枕葉或參考電極夾，