2025年大學(xué)《生物信息學(xué)》專業(yè)題庫——生物信息學(xué)方法在植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的應(yīng)用考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡述RNA測序（RNA-Seq）技術(shù)的基本原理及其在研究植物轉(zhuǎn)錄組方面的主要優(yōu)勢。列舉至少三種用于評(píng)估RNA-Seq原始數(shù)據(jù)質(zhì)量的常用指標(biāo)，并說明其中任意一種指標(biāo)的意義。二、在進(jìn)行植物轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析時(shí)，為什么需要考慮批次效應(yīng)？請(qǐng)簡述至少兩種檢測和校正批次效應(yīng)的方法及其原理。三、比較基于參考基因組比對(duì)和denovo組裝進(jìn)行植物轉(zhuǎn)錄組分析的原理、適用場景及優(yōu)缺點(diǎn)。在什么情況下，選擇denovo組裝可能更為合適？四、植物可變剪接是轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的重要來源。請(qǐng)簡述使用軟件（如Cufflinks或StringTie）進(jìn)行可變剪接分析的基本流程。在一個(gè)典型的植物轉(zhuǎn)錄組研究中，可變剪接分析結(jié)果可能揭示哪些生物學(xué)意義？五、你獲得了一組來自干旱處理與正常水分處理下某植物材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，差異表達(dá)分析結(jié)果顯示多個(gè)與水分脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因被顯著上調(diào)。請(qǐng)簡述你將如何利用功能注釋和富集分析工具（如GO或KEGG）來深入解讀這些差異表達(dá)基因的潛在功能，并闡述分析結(jié)果的生物學(xué)含義。六、在植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，火山圖和熱圖是常用的可視化手段。請(qǐng)分別說明這兩種圖通常用于展示哪些信息？簡述制作差異表達(dá)分析火山圖時(shí)，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)通常代表什么？影響火山圖上基因點(diǎn)分布的關(guān)鍵因素有哪些？七、描述一種常用的植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程，該流程應(yīng)至少包含數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異表達(dá)分析、功能注釋三個(gè)主要步驟，并簡述每個(gè)步驟的核心目標(biāo)和常用方法。八、簡述長讀長測序技術(shù)（如PacBioIso-Seq）在植物轉(zhuǎn)錄組研究，特別是可變剪接和全長轉(zhuǎn)錄本鑒定方面，相比短讀長測序技術(shù)（如IlluminaRNA-Seq）具有的優(yōu)勢。如果你需要全面研究某植物物種的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)變異，你會(huì)考慮使用哪種測序策略？并說明理由。試卷答案一、RNA測序（RNA-Seq）通過高通量測序技術(shù)測定生物樣本中所有或大部分RNA分子的序列，從而揭示轉(zhuǎn)錄組的組成和變化。其優(yōu)勢包括：能夠全面、定量地分析轉(zhuǎn)錄組；可以發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪接事件；對(duì)基因組結(jié)構(gòu)變異（如缺失、重復(fù)）敏感；無需預(yù)先知道基因組序列。評(píng)估RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量的常用指標(biāo)包括：測序深度（如RIN值，反映數(shù)據(jù)質(zhì)量）；核苷酸質(zhì)量分布（如Q30百分比，反映測序準(zhǔn)確度）；腺嘌呤脫氨酶（ADA）含量（反映RNA完整性）；reads長度分布和GC含量分布。例如，RIN（ReadQualityScoreNormalization）值是衡量RNA樣本質(zhì)量的一個(gè)綜合指標(biāo)，范圍從1到10，值越高表示RNA質(zhì)量越好，即使在低通量測序條件下也能獲得可靠的數(shù)據(jù)。二、批次效應(yīng)是指由于實(shí)驗(yàn)操作、試劑批次、儀器差異等原因，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)組之間產(chǎn)生的系統(tǒng)性偏差，從而干擾差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。檢測和校正批次效應(yīng)的方法有多種。一種方法是使用已知的“批次效應(yīng)標(biāo)記”（batcheffectmarker），如已知在不同批次中表達(dá)量有差異的基因，通過回歸分析將其作為協(xié)變量進(jìn)行校正。另一種方法是利用統(tǒng)計(jì)模型，如DESeq2中的`--normFactors`參數(shù)，該參數(shù)會(huì)自動(dòng)估計(jì)并校正批次效應(yīng)。此外，一些多維尺度分析（如PCA）或聚類分析可以幫助可視化批次效應(yīng)的存在。這些方法的原理都是識(shí)別并量化數(shù)據(jù)中的非生物學(xué)變異來源（即批次效應(yīng)），然后在后續(xù)的分析中將其剔除或調(diào)整，使得差異表達(dá)分析的結(jié)果更接近真實(shí)的生物學(xué)差異。三、基于參考基因組比對(duì)的分析原理是將RNA-Seqreads與已知的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，從而確定每個(gè)read的來源位置和轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)是分析速度快，能充分利用參考基因組信息，可以直接檢測到已知基因的表達(dá)量和結(jié)構(gòu)變異（如可變剪接）。缺點(diǎn)是分析結(jié)果的準(zhǔn)確性高度依賴于參考基因組的完整性和準(zhǔn)確性，如果參考基因組存在缺失或錯(cuò)誤，可能會(huì)導(dǎo)致部分真實(shí)轉(zhuǎn)錄本無法被檢測或錯(cuò)誤定位。denovo組裝則是直接利用測序reads自身的信息，通過算法重新構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本或基因組序列。優(yōu)點(diǎn)是無需依賴高質(zhì)量的參考基因組，特別適用于基因組未知、新物種或存在大量結(jié)構(gòu)變異（如重復(fù)序列、大型倒位）的物種，可以發(fā)現(xiàn)大量未知轉(zhuǎn)錄本。缺點(diǎn)是計(jì)算量通常較大，分析速度較慢，且組裝結(jié)果可能存在錯(cuò)誤，需要額外的驗(yàn)證步驟。選擇denovo組裝更為合適的情況包括：研究的新物種或基因組信息缺乏；已知參考基因組質(zhì)量較差或版本過舊；預(yù)期存在大量基因組結(jié)構(gòu)變異或新型轉(zhuǎn)錄本。四、使用軟件（如Cufflinks或StringTie）進(jìn)行可變剪接分析的基本流程通常包括：1）接收已對(duì)齊或組裝的reads數(shù)據(jù)；2）識(shí)別潛在的可變剪接事件，如外顯子跳躍、相互剪接、嵌合體等；3）構(gòu)建候選的轉(zhuǎn)錄本isoform結(jié)構(gòu)模型；4）利用統(tǒng)計(jì)方法（如基于模型的方法或頻率統(tǒng)計(jì)）評(píng)估每個(gè)候選isoform的置信度或豐度；5）輸出最終確定的可變剪接事件和各轉(zhuǎn)錄本isoform的豐度估計(jì)。在一個(gè)典型的植物轉(zhuǎn)錄組研究中，可變剪接分析結(jié)果可以揭示：不同條件下（如脅迫、發(fā)育階段）特定基因的isoform選擇是否存在差異，從而影響蛋白質(zhì)功能；是否存在新的、物種特異性的可變剪接事件；可變剪接事件是否與基因表達(dá)水平或細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)，為理解植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供重要線索。五、為了深入解讀差異表達(dá)分析結(jié)果中上調(diào)的與水分脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因，可以利用功能注釋和富集分析工具。首先，篩選出差異表達(dá)倍數(shù)大于某個(gè)閾值且統(tǒng)計(jì)顯著性（如FDR）小于某個(gè)閾值（如0.05）的基因集。然后，使用GO（GeneOntology）富集分析工具，將這個(gè)基因集輸入進(jìn)行分析。GO富集分析會(huì)評(píng)估該基因集在生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）三個(gè)方面的富集程度，即是否存在顯著偏離隨機(jī)預(yù)期的基因富集現(xiàn)象。例如，如果發(fā)現(xiàn)該基因集顯著富集在“氧化還原進(jìn)程”、“轉(zhuǎn)錄調(diào)控”和“細(xì)胞壁修飾”等GO術(shù)語下，這表明這些上調(diào)基因可能共同參與了植物的氧化應(yīng)激反應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控和逆境適應(yīng)性防御機(jī)制。類似地，使用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，可以查看這些基因是否顯著富集在已知的通路中，如“MAPK信號(hào)通路”、“激素信號(hào)通路”或“滲透調(diào)節(jié)通路”。通過結(jié)合GO和KEGG分析結(jié)果，可以更系統(tǒng)地推斷這些上調(diào)基因在植物水分脅迫響應(yīng)中的協(xié)同作用和潛在機(jī)制，例如它們可能共同構(gòu)成了一個(gè)脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)或參與了特定的生理生化過程。六、火山圖和熱圖是常用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可視化手段?；鹕綀D通常用于展示差異表達(dá)分析的結(jié)果，它將基因按照表達(dá)差異的大?。ㄍǔＳ肍oldChange表示）繪制在橫坐標(biāo)上，將基因的統(tǒng)計(jì)顯著性（通常用-FDR或-pvalue表示）繪制在縱坐標(biāo)上，形成一個(gè)散點(diǎn)圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，通過火山圖可以直觀地識(shí)別出哪些基因在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著上調(diào)或下調(diào)，以及表達(dá)變化的幅度。熱圖則常用于展示多個(gè)樣本或多個(gè)基因在不同條件下的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)通常經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理和聚類分析。行代表基因，列代表樣本，顏色深淺或數(shù)值大小代表表達(dá)量的高低。熱圖的主要作用是揭示基因表達(dá)的模式，如哪些基因在特定樣本中高表達(dá)，不同樣本間或不同基因間的表達(dá)模式相似性或差異性，以及通過聚類揭示樣本或基因的分類關(guān)系。制作差異表達(dá)分析火山圖時(shí)，橫坐標(biāo)通常代表基因的log2(FoldChange)，縱坐標(biāo)通常代表基因的-log10(FDR)或-log10(p-value)。影響火山圖上基因點(diǎn)分布的關(guān)鍵因素包括：基因本身的生物學(xué)特性（如管家基因、組織特異性表達(dá)基因），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和處理?xiàng)l件（如處理強(qiáng)度、時(shí)間點(diǎn)），樣本間生物學(xué)和操作差異（如批次效應(yīng)），以及測序深度和質(zhì)量。七、一種常用的植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程如下：1）數(shù)據(jù)預(yù)處理：對(duì)原始測序reads進(jìn)行質(zhì)量控制（如使用FastQC檢查質(zhì)量，使用Trimmomatic或Cutadapt去除adapter和低質(zhì)量reads），然后根據(jù)物種是否已知選擇合適的分析方法：若參考基因組可用，則使用比對(duì)工具（如HISAT2或STAR）將reads比對(duì)到參考基因組；若參考基因組未知或質(zhì)量不佳，則使用denovo組裝工具（如Trinity或SPAdes）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝。2）差異表達(dá)分析：對(duì)比對(duì)或組裝后的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。若為比對(duì)數(shù)據(jù)，常用DESeq2或edgeR；若為組裝數(shù)據(jù)，常用DEGseq或結(jié)合RSEM/edgeR/DESeq2。分析不同處理組或條件下的基因表達(dá)差異，獲得顯著差異表達(dá)基因列表。3）功能注釋與富集分析：對(duì)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，例如通過BLAST將基因序列比對(duì)到已知基因數(shù)據(jù)庫（如NCBInr），或使用基因本體（GO）注釋。然后，利用GO富集分析（如DAVID或KOBAS）和/或KEGG通路富集分析，評(píng)估差異表達(dá)基因在特定生物學(xué)過程、細(xì)胞組分或代謝通路中的富集情況，揭示差異表達(dá)的基因所參與的潛在生物學(xué)功能。八、長讀長測序技術(shù)（如PacBioIso-Seq）相比短讀長測序技術(shù)（如IlluminaRNA-Seq）具有的優(yōu)勢在于能夠生成更長的讀長（通常幾十kb到幾kb，而Illumina為幾百bp）。這些長讀長使得Iso-Seq數(shù)據(jù)能夠：1）直接、無歧義地組裝出更接近真實(shí)長度和結(jié)構(gòu)的長轉(zhuǎn)錄本，包括完整的5'和3'端序列，以及復(fù)雜的可變剪接事件（如嵌合體、相互剪接）；2）更準(zhǔn)確地檢測和量化全長轉(zhuǎn)錄本（FullLengthLongNon-codingRNA,lncRNA）和假基因；3）在組裝基因組時(shí)提供更連續(xù)的序列信息，有助于填補(bǔ)基因組缺口。如果你需要全面研究某植物物種的轉(zhuǎn)錄組結(jié)