2025年大學(xué)《生物技術(shù)》專(zhuān)業(yè)題庫(kù)——代謝途徑工程與微生物生產(chǎn)考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、名詞解釋?zhuān)款}3分，共15分）1.代謝途徑2.別構(gòu)調(diào)節(jié)3.代謝流4.代謝途徑工程5.發(fā)酵二、填空題（每空1分，共10分）1.代謝途徑通常由一系列______反應(yīng)組成，這些反應(yīng)由特定的______催化。2.糖酵解途徑的終產(chǎn)物是______和______。3.在代謝途徑調(diào)控中，______調(diào)節(jié)通常具有快速、可逆的特點(diǎn)。4.代謝途徑工程的目標(biāo)之一是增加目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑中關(guān)鍵酶的______。5.常見(jiàn)的宿主微生物用于代謝工程改造包括______、______和______。6.代謝流分析（MFA）的核心思想是追蹤進(jìn)入和離開(kāi)網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)的______。7.通過(guò)基因敲除消除代謝途徑中的______是代謝途徑工程常用策略之一。8.固定化酶技術(shù)可以提高酶在______生產(chǎn)中的應(yīng)用效率。9.利用重組微生物生產(chǎn)藥物，通常需要關(guān)注其______和______。10.合成生物學(xué)為代謝途徑工程提供了強(qiáng)大的______工具。三、簡(jiǎn)答題（每題5分，共20分）1.簡(jiǎn)述糖酵解途徑的主要步驟及其關(guān)鍵酶。2.比較酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)和共價(jià)修飾兩種調(diào)節(jié)方式的異同。3.簡(jiǎn)述代謝途徑工程中引入新酶策略的原理及其挑戰(zhàn)。4.簡(jiǎn)述影響微生物發(fā)酵過(guò)程的主要因素。四、論述題（每題10分，共30分）1.詳細(xì)闡述代謝途徑工程中通過(guò)基因過(guò)量表達(dá)提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的基本原理，并舉例說(shuō)明。2.以一種你熟悉的抗生素或氨基酸為例，簡(jiǎn)述其微生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，并說(shuō)明代謝途徑工程在其中可能發(fā)揮的作用。3.結(jié)合當(dāng)前生物制造的需求，論述代謝途徑工程面臨的挑戰(zhàn)以及可能的解決方案。五、設(shè)計(jì)題（15分）假設(shè)你想通過(guò)代謝途徑工程改造大腸桿菌，以使其能夠高效生產(chǎn)赤蘚糖醇（一種五碳糖醇，可由葡萄糖經(jīng)木酮糖激酶途徑生成）。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)基本的改造方案，至少包括以下內(nèi)容：1.需要引入或改造的關(guān)鍵酶及其來(lái)源。2.需要敲除或抑制的基因（如有）。3.預(yù)期對(duì)關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)（如磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑）流量的影響。4.在設(shè)計(jì)過(guò)程中需要考慮的主要限制因素或潛在問(wèn)題。試卷答案一、名詞解釋1.代謝途徑：一系列緊密聯(lián)系、按順序進(jìn)行的酶促反應(yīng)，將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，通常位于細(xì)胞內(nèi)特定的區(qū)域（如細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)膜系統(tǒng)）。2.別構(gòu)調(diào)節(jié)：指代謝途徑中的某個(gè)酶受到其代謝物或別構(gòu)效應(yīng)劑非共價(jià)結(jié)合后，其催化活性發(fā)生可逆變化的現(xiàn)象。3.代謝流：指在單位時(shí)間內(nèi)，通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)中某一節(jié)點(diǎn)或某一代謝途徑的代謝物摩爾數(shù)。4.代謝途徑工程：通過(guò)遺傳改造或酶工程手段，修飾生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)，以改變其代謝能力，旨在獲得具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)品或改善生物體性能的工程技術(shù)。5.發(fā)酵：指微生物（或動(dòng)植物細(xì)胞）在無(wú)氧或低氧條件下，利用特定底物進(jìn)行代謝活動(dòng)的過(guò)程，常用于工業(yè)生產(chǎn)。二、填空題1.連鎖；酶2.丙酮酸；ATP（或能量）3.別構(gòu)4.活性（或水平）5.大腸桿菌；酵母；真菌6.物質(zhì)（或代謝物）7.節(jié)點(diǎn)（或分支點(diǎn)）8.工業(yè)生產(chǎn)（或應(yīng)用）9.安全性；有效性（或質(zhì)量）10.基因（或合成）三、簡(jiǎn)答題1.糖酵解途徑的主要步驟包括：葡萄糖磷酸化（己糖激酶/葡萄糖激酶），葡萄糖-6-磷酸脫氫形成葡萄糖-6-磷酸和NADPH，磷酸葡萄糖異構(gòu)化，果糖-6-磷酸磷酸化，果糖-1,6-二磷酸裂解為二羥丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸，二羥丙酮磷酸異構(gòu)化為甘油醛-3-磷酸，甘油醛-3-磷酸和1,3-二磷酸甘油酸生成NADH和ATP，1,3-二磷酸甘油酸脫水形成3-磷酸甘油酸，3-磷酸甘油酸磷酸化形成2-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸脫水形成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP。關(guān)鍵酶包括己糖激酶/葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶、磷酸丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（涉及氧化脫羧）等。2.相同點(diǎn)：都是通過(guò)分子與酶活性中心（或調(diào)節(jié)位點(diǎn)）相互作用來(lái)改變酶的活性狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)代謝速率。不同點(diǎn)：別構(gòu)調(diào)節(jié)通常是可逆的，通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，效應(yīng)劑與酶的結(jié)合位點(diǎn)不同于催化位點(diǎn)，且多為協(xié)同效應(yīng)（激動(dòng)劑或抑制劑）；共價(jià)修飾通常涉及酶蛋白上特定氨基酸殘基的共價(jià)化學(xué)鍵變化（如磷酸化、乙?；?，由特定的激酶或磷酸酶催化，可以放大信號(hào)，且調(diào)節(jié)通常涉及酶的構(gòu)象變化。3.引入新酶策略的原理是通過(guò)基因工程將編碼所需外源酶的基因?qū)肽繕?biāo)宿主細(xì)胞，使宿主細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌該酶，從而在原有的代謝途徑中引入新的催化步驟或改變現(xiàn)有途徑的流向。挑戰(zhàn)包括：外源酶在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確折疊、定位和穩(wěn)定性問(wèn)題；外源酶與宿主細(xì)胞內(nèi)源性代謝途徑的兼容性；引入新酶可能帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)或與內(nèi)源性酶的競(jìng)爭(zhēng)；新酶作用底物或產(chǎn)物可能存在的毒性或抑制效應(yīng)；需要克服表達(dá)水平的限制等。4.影響微生物發(fā)酵過(guò)程的主要因素包括：培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等）的選擇與配比；發(fā)酵條件控制（溫度、pH、溶氧、通氣量、攪拌速度等）；接種量與菌種純度；發(fā)酵過(guò)程中的代謝調(diào)控；生物反應(yīng)器的類(lèi)型與設(shè)計(jì)；產(chǎn)物反饋抑制；污染控制等。四、論述題1.通過(guò)基因過(guò)量表達(dá)提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的基本原理在于：許多生物合成途徑受到嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平調(diào)控，通過(guò)過(guò)表達(dá)途徑中的關(guān)鍵限速酶基因，可以增加該酶的蛋白質(zhì)水平，從而加速整個(gè)代謝途徑的速率，使得更多的底物流向目標(biāo)產(chǎn)物。此外，過(guò)表達(dá)某些上游酶可以解除下游產(chǎn)物的反饋抑制，進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成速率。例如，在異檸檬酸脫氫酶（IDH）過(guò)量表達(dá)的釀酒酵母中，α-酮戊二酸向琥珀酸和檸檬酸的流向增加，從而提高了檸檬酸產(chǎn)量。需要注意的是，過(guò)量表達(dá)必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化，避免對(duì)細(xì)胞造成代謝負(fù)擔(dān)或引起毒害效應(yīng)。設(shè)計(jì)題部分解析思路：首先明確目標(biāo)產(chǎn)物赤蘚糖醇的合成路線，通常由葡萄糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑生成木酮糖，再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化生成赤蘚糖醇。其次，確定需要引入的關(guān)鍵酶——木酮糖激酶（XK），可能需要從其他微生物（如細(xì)菌）中獲取基因。同時(shí)，為了增加磷酸戊糖途徑的通量，可能需要過(guò)表達(dá)己糖激酶（HK）或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）。最后，為了減少赤蘚糖醇對(duì)代謝途徑的反饋抑制，可能需要考慮敲除或抑制赤蘚糖醇脫氫酶（XR）或甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等下游相關(guān)酶基因。預(yù)期流量影響：引入XK和過(guò)表達(dá)HK/G6PDH會(huì)增加流向木酮糖和赤蘚糖醇的流量。潛在問(wèn)題：XK可能對(duì)宿主不適應(yīng)，表達(dá)水平低或穩(wěn)定性差；赤蘚糖醇可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；高濃度赤蘚糖醇可能反饋抑制XK等。2.以谷氨酸為例，其微生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程通常在大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行。過(guò)程包括：菌種選育或遺傳改造以提高谷氨酸產(chǎn)量；配制含有合適碳源（如葡萄糖）、氮源（如豆餅粉水解液）、無(wú)機(jī)鹽和微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基；在適宜的溫度、pH、溶氧條件下進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成情況；發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)離心或過(guò)濾分離菌體和發(fā)酵液；采用萃取、離子交換、蒸餾等方法純化谷氨酸。代謝途徑工程在其中可能發(fā)揮的作用：通過(guò)基因敲除或抑制谷氨酸脫氫酶（GDH）和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體（KDC）等分支途徑的關(guān)鍵酶，將代謝流更多地導(dǎo)向谷氨酸合成；通過(guò)過(guò)表達(dá)關(guān)鍵合成酶（如GS/AT）或調(diào)控其表達(dá)水平；通過(guò)代謝流分析（MFA）和代謝控制分析（MCA）指導(dǎo)代謝途徑的優(yōu)化；利用合成生物學(xué)構(gòu)建更優(yōu)的代謝網(wǎng)絡(luò)等。3.代謝途徑工程面臨的挑戰(zhàn)主要包括：代謝途徑的復(fù)雜性和非線性，使得預(yù)測(cè)和調(diào)控代謝流非常困難；目標(biāo)產(chǎn)物可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性或抑制反饋；基因型與表型的關(guān)聯(lián)性復(fù)雜，高通量篩選和鑒定高效菌株的工作量大；宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷問(wèn)題，過(guò)度改造可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩甚至死亡；產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)效率低，需要改造轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；成本控制，發(fā)酵過(guò)程的經(jīng)濟(jì)效益需要考慮原料、能耗、下游加工等成本?？赡艿慕鉀Q方案：利用系統(tǒng)生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)方法進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)建模和仿真，指導(dǎo)理性設(shè)計(jì)；開(kāi)發(fā)高效、精準(zhǔn)的基因編輯工具（如CRISPR-Cas9）；構(gòu)建冗余的代謝途徑或引入解毒系統(tǒng)；尋找或改造更適合生產(chǎn)的宿主菌株（如利用古菌或非模式生物）；優(yōu)化發(fā)酵工藝和下游分離純化技術(shù)；關(guān)注綠色生物制造和可持續(xù)發(fā)展。五、設(shè)計(jì)題設(shè)計(jì)一個(gè)改造大腸桿菌以高效生產(chǎn)赤蘚糖醇的方案：1.關(guān)鍵酶引入與改造：引入來(lái)自其他微生物（如釀酒酵母）的木酮糖激酶（XK）基因，并將其置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制下，以在胞質(zhì)中高表達(dá)。XK負(fù)責(zé)將木酮糖磷酸化為赤蘚糖醇-5-磷酸。為了提供木酮糖前體，需要強(qiáng)化磷酸戊糖途徑。這可能需要過(guò)表達(dá)己糖激酶（HK）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）。2.基因敲除或抑制：考慮敲除或抑制赤蘚糖醇脫氫酶（XR）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），以減少赤蘚糖醇對(duì)代謝途徑的反饋抑制，并將更多的代謝流導(dǎo)向赤蘚糖醇合成?？赡苓€需要考慮敲除磷酸二羥丙酮（DHAP）通路的酶，以減少對(duì)糖酵解途徑的競(jìng)爭(zhēng)。3.預(yù)期流量影響：過(guò)量表達(dá)HK和G6PDH會(huì)增加流向磷酸戊糖途徑的流量，從而增加木酮糖的生成量。高表達(dá)的XK將木酮糖轉(zhuǎn)化為赤蘚糖醇-5-磷酸，進(jìn)而生成赤蘚糖醇。敲除下游抑制酶將解除反饋，理論上進(jìn)一步增加赤蘚糖醇的合成通量。整