摘要【目的】本研究旨在明確不同播種密度下小麥株型性狀的差異，為小麥生產(chǎn)中的合理密植提供依據(jù)；同時(shí)了解小麥YABBY基因的表達(dá)差異，探討YABBY基因在小麥生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)理?！痉椒ā?018-2019年以旱地小麥品種晉麥47為試驗(yàn)材料，設(shè)置梯度種植密度試驗(yàn)，測量不同種植密度下小麥株高、節(jié)間構(gòu)成和旗葉角度等性狀；并通過熒光定量PCR方法，檢測不同密度下小麥旗葉中YABBY基因的表達(dá)差異。【結(jié)果】隨著種植密度的增加，小麥株高和節(jié)間長度呈增加趨勢，旗葉角度呈降低趨勢。全基因組水平鑒定出小麥中包含YABBY基因18個(gè)，其中5個(gè)TaYABBY基因在不同播種密度下呈現(xiàn)差異表達(dá)?！窘Y(jié)論】不同種植密度下，小麥可能通過YABBY基因的調(diào)控，引起小麥株型發(fā)生改變。關(guān)鍵詞：小麥；種植密度；株型；YABBY基因目錄TOC\o"1-3"\h\z\u"HYPERLINK\l"_Toc16799732"前言 前言小麥在我國糧食作物中占據(jù)重要地位，其產(chǎn)量高低直接影響到我國糧食安全和社會發(fā)展。不同的種植密度會給小麥創(chuàng)造不一樣的生態(tài)條件，通過影響株高、葉夾角的大小和光能利用等多方面因素直接或間接地對作物植株群體的生長發(fā)育以及產(chǎn)量產(chǎn)生重要影響。小麥的根長、莖葉長、株高、葉夾角等指標(biāo)都對其產(chǎn)量有影響。其中，株高作為小麥生長發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo)，對小麥產(chǎn)量的影響尤為重要。種植密度過大，生物產(chǎn)量增加，株高明顯升高，致使群體抗倒伏性能差，在生育后期易倒伏，進(jìn)而顯著降低產(chǎn)量；群體密度過小，盡管個(gè)體發(fā)育健壯，但基本苗過少導(dǎo)致群體有效穗數(shù)偏低，最終引起生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量下降。葉夾角的大小直接影響作物葉面積指數(shù)，進(jìn)而調(diào)控小麥群體的光合作用，是理想株型和高產(chǎn)育種研究的一個(gè)重要指標(biāo)。王二明等[1]研究證實(shí)小麥葉片張開角度與產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)，冠層展開型品種較緊湊型品種更能實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。多項(xiàng)研究表明，小麥葉片張開角度受種植密度的影響。陳利平等[2]研究表明，隨著播種量的增加，在灌漿期小麥冠層葉片角度逐漸降低，其中以旗葉角度的變化最為明顯。趙會杰[3]的研究結(jié)果與其一致，在一定種植密度范圍內(nèi)，小麥的旗葉、倒二葉、倒三葉的葉片夾角隨種植密度增加呈現(xiàn)降低的趨勢，葉片趨于上舉形態(tài)，并且葉片面積隨之減小。YABBY轉(zhuǎn)錄因子是種子植物特有的一類小基因家族，其在側(cè)生器官形態(tài)建成，調(diào)控植物極性建立過程中發(fā)揮重要作用。YABBY家族成員中，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域保守性極強(qiáng)，稱作YABBY結(jié)構(gòu)域（N端的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)域），其他區(qū)域幾乎不具有序列同源性。擬南芥(Arabidopsisthaliana)包括6個(gè)YABBY成員：CRABSCLAW(CRC)、FILAMENTOUSFLOWER(FIL)、YABBY3(YAB3)、INNERNOOUTER(INO)、YABBY2(YAB2)和YABBY5(YAB5)[4-6]。以上成員均表現(xiàn)為在葉和花器官中極性表達(dá)，并決定側(cè)生器官遠(yuǎn)軸面的細(xì)胞命運(yùn)。CRC和INO在花器官表達(dá)，其中CRC基因調(diào)控心皮和蜜腺的發(fā)育，INO在胚珠的發(fā)育中發(fā)揮作用。而FIL、YAB3、YAB2和YAB5表現(xiàn)為在植株地上部分的營養(yǎng)器官中特異性表達(dá)，并在葉片發(fā)育中發(fā)生功能冗余現(xiàn)象。水稻(Oryzasativa)中存在8個(gè)YABBY基因。其中OsYAB1具有與其它OsYABBY基因不同的表達(dá)模式，其參與調(diào)控特定的細(xì)胞類型如厚壁組織細(xì)胞的分化，不參與側(cè)生器官的極性建立。此外，OsYAB1還參與了GA生物合成的反饋調(diào)節(jié)。披葉基因DROOPINGLEAF(DL)調(diào)控水稻心皮的分化和葉片中脈的發(fā)育。在擬南芥中過表達(dá)OsYABBY4基因，證明其可能參與調(diào)控維管組織的發(fā)育，但與極性建立無關(guān)。OsYAB3受WOX3抑制，兩者共同調(diào)控水稻葉片發(fā)育。TOB1(OsYABBY5)參與調(diào)控水稻小穗中分生組織的分化[7-9]。玉米參考基因組中已鑒定出13個(gè)YABBY基因[10,11]。Juarez等[12]研究發(fā)現(xiàn)，玉米YABBY基因參與調(diào)控葉片與莖稈角度。在全基因組水平上研究小麥YABBY基因尚未有報(bào)道，通過調(diào)查不同種植密度下小麥的株型，并對YABBY基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析，探明種植密度對小麥株型的影響，并探討YABBY基因在小麥生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)理，對于小麥高產(chǎn)育種中培育緊湊株型以增強(qiáng)高密度種植耐性、并提高群體光合效率具有重要意義。論文主體1.材料與方法1.1試驗(yàn)地概況試驗(yàn)于2018年10月-2019年5月在山西省臨汾市小麥研究所韓村試驗(yàn)田(36°06′24″N,111°30′55″E，海拔457.0m)進(jìn)行。試驗(yàn)田位于黃淮麥區(qū)北片，年均氣溫13.1℃，年降水量430~550mm。試驗(yàn)地為中壤石灰性褐土，地力均勻。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.1材料種植與調(diào)查供試品種為山西省生產(chǎn)上種植面積較大的品種‘晉麥47’。田間試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置三個(gè)種植密度，分別為基本苗：250萬株/hm2（D1，稀植），300萬株/hm2（D2，中植），450萬株/hm2（D3，密植），各處理均于2018年10月3日采用人工播種，行距25cm，小區(qū)面積45m2(5m×9m)，三次重復(fù)。播種前統(tǒng)一施氮（N150kg/hm2）磷（P2O5，70kg/hm2）鉀（K2O，120kg/hm2）肥。試驗(yàn)地四周設(shè)置保護(hù)行，灌水及其他田間管理措施與大田管理一致。于成熟期，在各小區(qū)隨機(jī)選取10株長勢一致的小麥植株，測量主莖高度、每一節(jié)間長度及旗葉夾角。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)檢驗(yàn)，采用Microsoftoffice軟件作圖。1.2.2TaYABBY基因的生物信息學(xué)分析利用數(shù)據(jù)庫及生物軟件對TaYABBY進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能分析和預(yù)測，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用本地Blast功能對小麥全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域搜索以及pfam確認(rèn)該蛋白所屬蛋白家族；利用ExPASy在線生物軟件分析小麥YABBY蛋白的分子量、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)。利用CELLO在線軟件(.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。運(yùn)用ClustalW和MEGA6.0等軟件進(jìn)行多序列的多重比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.3qRT-PCR分析分別于各小區(qū)選取新鮮、無病蟲害的葉片，立即液氮速凍，超低溫冰箱冷凍保存。TRIzol法（Invitrogen，美國）提取總RNA，PrimeScriptRT-PCRKit(TAKARA，日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。稀釋10倍后的cDNA參照Sang等[13]的方法，對小麥YABBY家族基因進(jìn)行qRT-PCR分析[11]。2結(jié)果與分析2.1種植密度對小麥株型的影響種植密度對小麥株高和旗葉夾角均有影響(表1)。在條播條件下，隨種植密度的增加，小麥株高、穗下節(jié)和倒二節(jié)長度均呈現(xiàn)增加趨勢，倒三節(jié)長度變化不大。D2和D3密度的株高分別比D1增加5.40%和11.04%；穗下節(jié)長度，D2和D3密度的株高分別比D1增加1.80%和11.82%；倒二節(jié)長度，D2和D3密度的株高分別比D1增加13.70%和10.89%。隨著種植密度增加，旗葉夾角呈現(xiàn)降低趨勢。D2和D3密度的葉夾角較D1密度分別降低14.28%和27.26%。方差分析顯示，對于株高、穗下節(jié)和倒二節(jié)3個(gè)性狀，D3密植均與D1稀植和D2中植存在顯著差異，D1和D2條件下無顯著差異。三個(gè)密度下的旗葉夾角均存在顯著差異。表1種植密度對晉麥47株型的影響Table1EffectofplantingdensitiesonphysicalcharacteristicsofwheatJinmai47種植密度Density株高Height(cm)穗下節(jié)Internodebelowthespike(cm)倒二節(jié)thesecondinternode(cm)倒三節(jié)thethirdinternode(cm)旗葉夾角Flagleafangle(°)D183.3±0.2b27.9±0.3b19.7±0.5b12.8±0.9a58.45±1.8aD287.8±0.8b28.4±1.0b20.2±0.8b13.0±1.1a46.78±1.9bD392.5±1.1a31.2±0.8a22.4±0.7a14.6±0.7a40.00±3.3c數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列不同字母的值在5%水平上差異顯著Dataaremeans±SE.ValuesfollowedbydifferentlettersinthesamecolumnaresignificantlydifferentatP＜0.05.2.2小麥YABBY家族基因生物信息學(xué)分析利用本地Blast在小麥基因組中鑒定出了7個(gè)YABBY基因，按照其在水稻中同源基因的順序進(jìn)行編號。每一個(gè)基因存在1-3個(gè)拷貝，分布在A、B、D染色體組中。根據(jù)基因的編號和其在染色體上的位置對每一個(gè)基因拷貝進(jìn)行命名，如TaYAB1_4AS（表2）。通過ExPASy工具分析發(fā)現(xiàn)，小麥YABBY蛋白大小從185個(gè)氨基酸到297個(gè)氨基酸不等，差異較小。分子量為20981Da~31444Da之間，等電點(diǎn)介于6.74到9.30之間。預(yù)測的GRAVY值均為負(fù)值，說明小麥YABBY蛋白均為親水蛋白。表2小麥YABBY家族成員鑒定及蛋白質(zhì)理化分析Table2Theidentificationandproteinphysic-chemicalanalysisofthewheatYABBYgenefamily基因名稱Genename基因組登錄號GeneaccessionNo.大小Length(aa)理論等電點(diǎn)Isoelectricpoint分子量Molecularweight亞細(xì)胞定位Subcellularlocation疏水性指數(shù)GRAVY基因組位置Chromosomelocation水稻同源基因RicehomologousgeneTaYAB1_4ASTraesCS4A02G058800.12028.9822,546細(xì)胞核-0.526chr4A:51137760..51142248OsDLTaYAB1_4BLTraesCS4B02G245900.12008.9822,335細(xì)胞核-0.545chr4B:509033072..509037528OsDLTaYAB1_4DLTraesCS4D02G245300.12028.9822,560細(xì)胞核/胞外-0.524chr4D:412713683..412717920OsDLTaYAB2_5ALTraesCS5A02G371500.11869.3021,052細(xì)胞核/胞外-0.510chr5A:570321614..570331718OsYAB1/2TaYAB2_5BLTraesCS5B02G373600.11859.3020,981細(xì)胞核/胞外-0.523chr5B:551331490..551338856OsYAB1/2TaYAB2_5DLTraesCS5D02G380900.21869.3021,040細(xì)胞核-0.538chr5D:451128219..451137154OsYAB1/2TaYAB3_1ALTraesCS1A02G176300.12978.6231,404細(xì)胞核-0.349chr1A:314620483..314624358OsYAB3TaYAB3_1BLTraesCS1B02G203800.12978.6231,444細(xì)胞核-0.353chr1B:367839427..367843332OsYAB3TaYAB3_1DLTraesCS1D02G162600.12958.6231,280細(xì)胞核-0.328chr1D:233307158..233311289OsYAB3TaYAB4_6ALTraesCS6A02G237700.12508.1326,684細(xì)胞核-0.196chr6A:446900609..446903597OsYAB4TaYAB4_6BLTraesCS6B02G266200.12658.4328,315細(xì)胞核-0.082chr6B:478752450..478755692OsYAB4TaYAB5_2ALTraesCS2A02G386200.12628.1428,473細(xì)胞核-0.423chr2A:631967177..631969484OsYAB5TaYAB5_2BLTraesCS2B02G403100.12806.7430,116細(xì)胞核-0.248chr2B:571531403..571533593OsYAB5TaYAB5_2DLTraesCS2D02G382700.12706.7429,087細(xì)胞核-0.314chr2D:486955433..486957936OsYAB5TaYAB6_5ASTraesCS5A02G025900.12078.9722,916細(xì)胞核-0.537chr5A:20992825..20998791OsYAB6TaYAB6_5BSTraesCS5B02G025100.12079.1322,663細(xì)胞核-0.514chr5B:24008309..24014574OsYAB6TaYAB6_5DSTraesCS5D02G033700.22069.2822,603細(xì)胞核-0.491chr5D:32297891..32303526OsYAB6TaYAB7_2DSTraesCS2D02G205100.12438.4926,380細(xì)胞核/胞外-0.285chr2D:157017464..157019463OsYAB7為了研究小麥YABBY基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了來自4個(gè)物種的共45個(gè)YABBY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并結(jié)合前人對擬南芥、水稻和玉米YABBY基因的進(jìn)化分析結(jié)果，本研究中將小麥YABBY家族18個(gè)成員分成4個(gè)亞家族，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。其中第Ⅱ亞家族含有17個(gè)成員，第Ⅲ亞家族成員最少，為8個(gè)。小麥YABBY家族成員在四個(gè)亞家族中均有存在，且與水稻YABBY基因相似性較高。第Ⅰ亞家族中包含了擬南芥AtCRC與水稻、玉米披葉基因DL，前人根據(jù)擬南芥CRC和水稻DL基因的保守結(jié)構(gòu)域同源克隆得到的TaCRC基因在本研究中對應(yīng)TaYAB1_4DL。第Ⅱ亞家族包括了小麥YABBY家族6個(gè)成員，已克隆的TaYAB2對應(yīng)TaYAB2_5BL，與水稻OsYABBY2同源性最高。第Ⅲ亞家族中，前人根據(jù)擬南芥FIL、YAB2和YAB3基因同源克隆得到的TaFIL基因，對應(yīng)本研究的TaYAB3_5BL。第Ⅳ亞家族中包含5個(gè)小麥YABBY成員，2個(gè)水稻基因和3個(gè)玉米基因，沒有擬南芥YABBY家族成員存在，預(yù)示此亞家族可能為單子葉植物進(jìn)化過程中的特有分支。圖1.擬南芥(At)、水稻(Os)、玉米(Zm)和小麥(Ta)YABBY進(jìn)化樹分析Figure1PhylogenetictreeofYABBYproteinsofA.thaliana(At),O.sativa(Os),Zeamays(Zm)andT.aestivum(Ta).2.3不同種植密度下小麥YABBY基因表達(dá)分析不同種植密度下，對小麥葉片中YABBY基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)TaYABBY基因在不同密度下呈現(xiàn)差異性表達(dá)（圖2）。其中TaYAB1_4AS和TaYAB7_2DS在中植密度(D2)下的表達(dá)量最高，隨著種植密度的增加，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。TaYAB4_6AL和TaYAB6_5BS在稀植密度(D2)下的表達(dá)量最高，隨著種植密度的增加，表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。而TaYAB1_4DL隨著種植密度的增加，表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，在密植(D3)下的表達(dá)量最高。結(jié)果表明，多個(gè)YABBY基因參與到對小麥種植密度的適應(yīng)性調(diào)控，且不同YABBY基因可能具有不同的調(diào)控模式。圖2.小麥葉片YABBY基因在不同種植密度下的表達(dá)量Fig.2AnalysisofexpressionlevelsofYABBYgenesinthewheatflagleavesunderdifferentplantingdensities3討論3.1種植密度對小麥株高和旗葉夾角的影響株型對小麥產(chǎn)量和抗病性有重要影響，合理株型可以在群體一定的條件下最大程度的實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)目標(biāo)。明確種植密度(播種量)對小麥株型的效應(yīng)，分析小麥種植因素和株型塑造之間的關(guān)系，有助于形成適宜的冠層結(jié)構(gòu)，從而開發(fā)出合理、高效的株型調(diào)控模式。小麥株高和旗葉夾角是小麥理想株型育種的重要選擇指標(biāo)，種植密度是影響小麥株高和旗葉夾角的重要因素。莖稈長度影響小麥的抗倒伏能力，節(jié)間構(gòu)成與葉片的空間排布密切相關(guān)，合適的旗葉夾角能充分提高小麥的光捕獲能力，是構(gòu)建高光效株型結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[14]。本研究在條播情況下，測定分析了小麥品種晉麥47在不同種植密度下小麥莖稈形態(tài)特征和旗葉角度的變化。結(jié)果表明，晉麥47的株高隨播種密度增加表現(xiàn)為增高趨勢，而旗葉夾角呈降低趨勢，這與前人結(jié)果基本一致[15]。邵慶勤等[16]研究表明，小麥種植密度由基本苗300萬/hm2增加到450萬/hm2，小麥株高、基部莖節(jié)長度分別增加1.77%和6.11%，導(dǎo)致了倒伏率和倒伏程度上升。本研究中，隨著種植密度增大，晉麥47的旗葉夾角由58°減小到了40°左右，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著種植密度增大，晉麥47自我調(diào)節(jié)的能力增強(qiáng)。在生產(chǎn)上，小麥具有自我調(diào)節(jié)的能力，但種植密度過大或過小時(shí)，不能使小麥的自我調(diào)節(jié)能力得以充分發(fā)揮，最終無法形成較合理的群體結(jié)構(gòu)，造成成穗數(shù)過多或過少，達(dá)不到高產(chǎn)目的。3.2YABBY基因在不同種植密度下對小麥株型的調(diào)控已有研究表明YABBY基因在小麥株型調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用生物信息學(xué)方法分析小麥YABBY基因，從小麥中鑒定出18個(gè)YABBY家族成員。研究表明，YABBY基因能夠調(diào)控植株葉片近軸/遠(yuǎn)軸的極化現(xiàn)象，在水稻和玉米中披葉基因DROOPINGLEAF1(DL1)能夠促進(jìn)葉中脈形成，轉(zhuǎn)基因促進(jìn)表達(dá)后的水稻，葉片較野生型更加直立。目前小麥中已經(jīng)克隆了兩個(gè)YABBY成員TaYAB1和TaCRC，兩者均參與小麥極性建立過程。在擬南芥中異位表達(dá)TaYAB1基因發(fā)現(xiàn)，該基因能夠影響擬南芥葉片近軸/遠(yuǎn)軸極性的建立。本研究中，在不同密植條件下，有5個(gè)TaYABBY基因表現(xiàn)出差異性表達(dá)，表明這些基因可能在種植密度發(fā)生變化時(shí)，調(diào)控小麥株型變化以適應(yīng)種植密度的改變。其中TaYAB1_4AS和TaYAB7_2DS的表達(dá)模式及其相似，且在進(jìn)化樹分析中二者均為第Ⅰ亞家族成員，證明二者可能由共同祖基因進(jìn)化而來。為后續(xù)株型調(diào)控相關(guān)基因克隆或株型突變體的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。3.結(jié)論晉麥47在山西省種植較普遍，且相對較耐密。本試驗(yàn)研究了種植密度對植株高度、節(jié)間構(gòu)成和旗葉夾角的影響，結(jié)果顯示，隨種植密度的增加，晉麥47的耐密性主要表現(xiàn)在：隨著植株種植密度的增加，植株高度和基部節(jié)間長度增加幅度較小，該結(jié)構(gòu)更有利于植株抗倒和密植高產(chǎn)；植株種植密度增大，旗葉夾角減小幅度較大，此類型植株更加耐密。利用qRT-PCR技術(shù)對小麥不同種植密度下YABBY家族基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，小麥YABBY家族成員調(diào)控小麥的生長發(fā)育，對不同種植密度下小麥YABBY基因的表達(dá)分析，將會為不同栽培模式下株型的分子調(diào)控機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。

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