ICS07.100.99

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2074—2021

動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)

DetectionofKlebsiellapneumoniainanimalbedding

2021-01-25發(fā)布2021-02-25實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2074—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)提出并歸口。

本文件起草單位：中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)。

本文件主要起草人：王海艷、郝廣福、趙治國(guó)、靳木子、盛萬(wàn)里、馬彩霞、敖威華、崔強(qiáng)、陳林軍、

延涵、陳宇飛。

I

DB15/T2074—2021

動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)

1范圍

本文件規(guī)定了動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定定性檢測(cè)法。

本文件適用于動(dòng)物墊料中肺炎克雷伯氏菌定性檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則

SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則

SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

動(dòng)物墊料animalbedding

用于吸收動(dòng)物排泄物，使動(dòng)物保持舒適生活環(huán)境的鋪墊物。

注：包括動(dòng)物籠內(nèi)非直接與動(dòng)物機(jī)體接觸的鋪墊物。

4設(shè)備和材料

4.1冰箱：2℃～5℃。

4.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

4.3均質(zhì)器。

4.4漩渦振蕩器。

4.5電子天平：感量0.1g。

4.6全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

4.7飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。

4.8二級(jí)生物安全柜。

4.9光學(xué)顯微鏡。

4.10水浴裝置：36℃±1℃。

4.11pH計(jì)。

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4.12無(wú)菌錐形瓶：容量500mL，250mL。

4.13無(wú)菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

4.14無(wú)菌培養(yǎng)皿：15mm×90mm。

4.15無(wú)菌試管：18mm×180mm。

4.16無(wú)菌棉簽。

4.17無(wú)菌鑷子。

4.18無(wú)菌剪刀。

4.19無(wú)菌勺。

4.20無(wú)菌載玻片。

4.21無(wú)菌接種環(huán)。

5培養(yǎng)基和試劑

肺炎克雷伯氏菌常用培養(yǎng)基與試劑滅菌后保存期限見(jiàn)附錄B。

5.1實(shí)驗(yàn)用水：符合GB/T6682的要求。

5.2SCDLP液體培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.2。

5.3膽硫乳瓊脂（DHL)：見(jiàn)附錄A中A.3。

5.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.4。

5.5革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.5。

5.6動(dòng)力半固體瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.6。

5.7氧化酶試劑：見(jiàn)附錄A中A.7。

5.8無(wú)菌0.85%生理鹽水：見(jiàn)附錄A中A.8。

5.9生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。

5.10飛行時(shí)間質(zhì)譜儀靶板。

5.11肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種ATCC35657，或等效菌株。

6檢驗(yàn)程序

肺炎克雷伯氏菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

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樣品制備

檢樣25g或25cm2樣液+225mLSCDLP增菌

36℃±1℃，18h～24h

劃線接種DHL瓊脂平板

36℃±1℃，18h～24h，厭氧培養(yǎng)

挑取可疑菌落，接種動(dòng)力半固體瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂

36℃±1℃，18h～24h

革蘭氏染色鏡檢/氧化酶試驗(yàn)

確定鑒定

圖1肺炎克雷伯氏菌檢驗(yàn)程序

7操作步驟

7.1取樣

7.1.1取樣原則

應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。取樣過(guò)程遵循無(wú)菌操作程序，防止一切可能的外來(lái)污染。

7.1.2樣品處理

7.1.2.1顆粒狀或粉末樣品

對(duì)送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進(jìn)行隨機(jī)多點(diǎn)取樣至少250g，充分混勻后稱(chēng)取25g顆粒狀或粉末

狀墊料樣品，加入225mLSCDLP，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h進(jìn)行

增菌。

7.1.2.2平面樣品

無(wú)菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmí5cm）放在平面墊料表面，用浸有無(wú)菌稀釋液（無(wú)菌0.85%生理鹽

水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來(lái)回均勻涂抹整個(gè)方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去棉

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DB15/T2074—2021

拭子與手接觸的部分，將棉拭子頭置入裝有25mL無(wú)菌稀釋液（無(wú)菌0.85%生理鹽水）的無(wú)菌錐形瓶中，

根據(jù)樣品面積大小重復(fù)取樣1～4個(gè)規(guī)格板面積，相應(yīng)地將棉拭子頭置入25mL～100mL的無(wú)菌稀釋液（無(wú)

菌0.85%生理鹽水）中，充分振搖制成樣品原液（1mL原液對(duì)應(yīng)的樣品面積為1cm2）。取25mL樣品原

液加入225mLSCDLP，充分振搖或均質(zhì)1min～2min，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h進(jìn)行增菌。

表1不同面積平面類(lèi)墊料樣品取樣量

樣品面積取樣量

規(guī)格板數(shù)

m2cm2

小于0.25（含）251

0.25～0.5（含）502

0.5～0.75（含）753

大于0.751004

7.2分離培養(yǎng)

將增菌液劃線接種DHL瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落形態(tài)。在DHL平板上肺炎

克雷伯氏菌菌落呈淡粉紅色，大而隆起、光滑濕潤(rùn)、粘液狀，相鄰菌落容易融合成膿汁樣，接種針挑取

菌落時(shí)呈絲狀粘連。

7.3鑒定

7.3.1分純培養(yǎng)

挑取5個(gè)（如小于5個(gè)則全選）可疑菌落分別接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

7.3.2革蘭氏染色鏡檢

挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)的可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏染色陰性短桿

菌，單個(gè)、成雙或成短鏈排列，有莢膜。

7.3.3動(dòng)力試驗(yàn)

挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)的可疑菌落穿刺于動(dòng)力半固體瓊脂，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。肺炎

克雷伯氏菌無(wú)動(dòng)力。

7.3.4氧化酶試驗(yàn)

挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)的可疑菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。肺炎克雷伯氏菌氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

7.3.5生化鑒定

挑取純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌生化鑒定，見(jiàn)表2。具體操作依據(jù)肺炎克雷伯氏菌生化鑒定

試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

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表2肺炎克雷伯氏菌生化特性

試驗(yàn)項(xiàng)目肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種肺炎克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞種

尿素酶+d-

靛基質(zhì)---

MR-/+++

VP+--

西蒙氏構(gòu)橡酸鹽+d-

D-酒石酸鹽+/--/+-

丙二酸鹽+-+

ONPG++-

賴(lài)氨酸脫羚酶+d-

分解葡萄糖產(chǎn)氣+d-

乳糖+d-

衛(wèi)矛醇-/+--

注：“+”≥90%陽(yáng)性，“+/-”75%~88%陽(yáng)性，“d”為不定，“-/+”75%~89%陰性，“-”≥90%陰性。

7.3.6輔助鑒定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況，可選用全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等進(jìn)行鑒定，具體操作依據(jù)

設(shè)備操作規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)GB/T33682進(jìn)行。

8結(jié)果與報(bào)告

綜合動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果、氧化酶試驗(yàn)結(jié)果、生化鑒定結(jié)果和輔助鑒定結(jié)果等，報(bào)告25g（cm2）動(dòng)物墊

料樣品中檢出或未檢出肺炎克雷伯氏菌。

9生物安全措施

為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測(cè)致病菌，所有培養(yǎng)物應(yīng)小心處置，應(yīng)按照GB

19489的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

10廢棄物處理和防治污染的措施

檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少30min后再棄置。

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附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基和試劑

A.1培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證

按照SN/T1538.1和SN/T1538.2執(zhí)行，并對(duì)制備好的培養(yǎng)基進(jìn)行性能測(cè)試，如使用等效的脫水合成

培養(yǎng)基，使用前對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)收并按其說(shuō)明書(shū)使用。

A.2SCDLP液體培養(yǎng)基

A.2.1成分

胰蛋白胨17.0g

大豆蛋白胨3.0g

氯化鈉5.0g

磷酸二氫鉀2.5g

葡萄糖2.5g

卵磷脂1.0g

吐溫-807.0g

蒸餾水1000mL

A.2.2制法

將卵磷脂在400mL蒸餾水中加熱溶解，再將其他成分混合加入600mL蒸餾水中，加熱溶解。將上述

兩種溶液混合后，攪拌均勻。調(diào)節(jié)pH至7.2～7.3，分裝，121℃20min高壓滅菌。振蕩使沉于底層的

吐溫-80充分混合，待冷卻至25℃左右使用。

A.3膽硫乳瓊脂（DHL)

A.3.1成分

蛋白胨20.0g

牛肉膏3.0g

乳糖10.0g

蔗糖10.0g

牛膽鹽1.0g

硫代硫酸鈉2.2g

檸檬酸鈉1.0g

檸檬酸鐵餒1.0g

中性紅0.03g或5g/L水溶液6mL

瓊脂18.0g～20.0g

蒸餾水1000mL

A.3.2制法

除中性紅和瓊脂外，將其他成分加入100mL蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約10min,加熱煮沸至完全

溶解，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.1，再將瓊脂加入600mL蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約10min,加熱煮沸至完全

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溶解。將兩種溶液混合后，再加入5g/L中性紅水溶液6mL,攪拌均勻，待冷卻至50℃～55℃，傾注平

皿備用。

A.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂

A.4.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.4.2制法

將各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121℃滅菌15min，待冷卻至50℃～55℃，

傾注平皿備用。

A.5革蘭氏染液

A.5.1結(jié)晶紫染液

A.5.1.1成分

結(jié)晶紫1.0g

95％乙醇20mL

1％草酸銨水溶液80mL

A.5.1.2制法

將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.5.2革蘭氏碘液

A.5.2.1成分

碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水300mL

A.5.2.2制法

將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.5.3沙黃復(fù)染液

A.5.3.1成分

沙黃0.25g

95％乙醇10mL

蒸餾水90mL

A.5.3.2制法

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將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.5.4革蘭氏染色操作步驟

將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，

水洗；滴加95％乙醇脫色，約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加復(fù)染

液，復(fù)染30s～1min，水洗后自然干燥，鏡檢。

A.6動(dòng)力半固體瓊脂

A.6.1成分

胰蛋白胨10.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂5.0g

蒸餾水1000mL

A.6.2制法

將各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.3±0.1,分裝18mm×180mm試管，121℃高壓滅菌

15min,制成半固體高層。

A.7氧化酶試驗(yàn)試劑

A.7.1成分

四甲基對(duì)苯二胺