2025年大學《生物技術》專業(yè)題庫——核糖核酸干擾技術在基因沉默中的應用考試時間：______分鐘總分：______分姓名：______一、選擇題（本大題共20小題，每小題2分，共40分。在每小題列出的四個選項中，只有一項是最符合題目要求的，請將正確選項字母填在題后的括號內。）1.發(fā)現(xiàn)Potentia現(xiàn)象的植物是？A.煙草B.擬南芥C.黃瓜D.豌豆2.RNA干擾技術中，首先被識別并切割成小干擾RNA（siRNA）的前體是？A.mRNAB.tRNAC.雙鏈RNA（dsRNA）D.單鏈RNA（ssRNA）3.在RNA干擾通路中，具有切割活性的核酸內切酶是？A.DicerB.ArgonauteC.RNaseHD.RISC4.siRNA在進入RISC復合物前，其雙鏈結構需要被解開，解開后的單鏈siRNA被稱為？A.siRNAB.miRNAC.antisenseRNAD.guideRNA(gRNA)5.RISC復合物中的gRNA負責什么功能？A.切割siRNAB.加工dsRNAC.引導RISC識別靶mRNAD.降解mRNA6.如果一個siRNA序列與多個非目標mRNA存在部分互補，這種現(xiàn)象稱為？A.基因功能獲得B.基因功能喪失C.脫靶效應D.靶向特異性7.RNA干擾的“基因功能喪失”表型通常是通過什么機制實現(xiàn)的？A.促進目標基因的轉錄B.穩(wěn)定目標mRNAC.降解目標mRNAD.抑制目標蛋白翻譯8.下列哪種方法不屬于siRNA的體外合成方法？A.化學合成B.體外轉錄C.逆轉錄D.基因編輯9.為了提高siRNA在植物細胞中的轉染效率，常使用？A.電穿孔B.病毒載體C.脂質體D.磷脂復合物10.RNA干擾技術最早被應用于哪個領域的研究？A.基因治療B.轉基因作物開發(fā)C.基因功能分析D.抗病毒藥物設計11.在設計siRNA時，通常要求其靶位點mRNA的Tm值與siRNA自身Tm值相近，原因是什么？A.提高siRNA的穩(wěn)定性B.防止siRNA降解C.增強siRNA與RISC的結合效率D.降低脫靶效應12.下列哪種RNA分子通常來源于基因內含子區(qū)域，并在轉錄后加工形成，參與基因沉默？A.siRNAB.miRNAC.piRNAD.lncRNA13.RNA干擾通路在真核生物中具有重要的防御功能，它可以防御哪些病原體？A.病毒B.真菌C.細菌D.以上都是14.下列哪種技術是利用RNA干擾原理，通過化學修飾的ASO（反義寡核苷酸）來特異性地抑制基因表達？A.RNAiB.CRISPR/Cas9C.ASOD.ZFN15.RNA干擾技術應用于基因治療時面臨的主要挑戰(zhàn)之一是？A.效率低B.特異性差C.免疫原性D.以上都是16.Argonaute蛋白家族是RNA干擾通路中的核心組分，在真核生物中存在多種成員，它們的主要功能是？A.切割RNAB.結合siRNA或miRNA，形成RISCC.轉錄RNAD.翻譯RNA17.miRNA與siRNA的主要區(qū)別之一在于它們的來源和序列特點，miRNA通常來源于？A.外源雙鏈RNAB.基因內含子或基因間區(qū)轉錄本C.人工合成D.病毒基因組18.RNA干擾技術的發(fā)現(xiàn)對生命科學領域產(chǎn)生了深遠影響，其核心貢獻在于？A.提供了一種強大的基因功能研究工具B.開發(fā)出全新的抗病毒藥物C.實現(xiàn)了基因的永久性編輯D.解開了染色體重排的奧秘19.在利用RNAi進行基因功能研究時，為了確保觀察到的表型確實是目標基因所導致的，需要排除？A.siRNA的脫靶效應B.載體的影響C.實驗操作的誤差D.以上都是20.近年來的研究將RNA干擾技術與其他技術結合，例如將gRNA設計融入CRISPR/Cas系統(tǒng)，目的是為了？A.提高基因編輯的特異性B.增強RNA干擾的效率C.擴展基因編輯的靶向范圍D.以上都是二、填空題（本大題共5小題，每空1分，共10分。請將答案填在題中橫線上。）21.RNA干擾的分子機制核心是______介導的、序列特異性的______降解。22.Dicer是RNA干擾通路中的關鍵酶，它能夠識別并切割______，產(chǎn)生雙鏈RNA（dsRNA）。23.為了有效地沉默特定基因，設計的siRNA需要滿足兩個基本條件：一是與靶mRNA具有高度的______，二是能夠被RISC識別和利用。24.除了在細胞水平上引起基因沉默，RNA干擾在高等植物中還可以通過______的方式傳遞給后代。25.鑒于RNA干擾技術的______和______特點，它在基礎研究、疾病治療和農(nóng)業(yè)應用等方面具有巨大的潛力。三、簡答題（本大題共3小題，每小題10分，共30分。請按題目要求作答。）26.簡述RNA干擾技術的基本流程，包括關鍵組分及其功能。27.列舉并簡述至少三種用于將siRNA遞送到細胞內的方法，并比較其優(yōu)缺點。28.RNA干擾技術在基因治療應用中存在哪些主要局限性？請至少提出兩種可能的解決方案。四、論述題（本大題共1小題，20分。請按題目要求作答。）29.論述miRNA與siRNA在生物體內介導基因沉默的過程中，它們在來源、結構、作用機制以及對靶標的選擇性等方面的主要異同點。并舉例說明miRNA在生物體內的重要功能。試卷答案---1.D解析：Potentia現(xiàn)象最初是在研究豌豆（豌豆）中葉綠體基因與核基因相互作用時發(fā)現(xiàn)的，表現(xiàn)為葉綠體基因的表達受到抑制。2.C解析：RNA干擾現(xiàn)象的本質是雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的同源mRNA的降解。Dicer首先識別并切割dsRNA前體。3.C解析：雖然Argonaute蛋白是RISC的核心組分并負責結合siRNA/miRNA，但具有核酸內切酶活性的通常是Argonaute蛋白與siRNA/miRNA形成的RISC復合物，或者在某些情況下指RNaseH。但在切割dsRNA前體時，Dicer有切割活性。在RISC切割靶mRNA時，RNaseH樣酶（如人類hRNaseH1）參與降解mRNA。若指切割dsRNA的Dicer，則A正確。但通常問切割mRNA的酶時指RNaseH。此題可能存在歧義，若理解為RISC中負責切割的組分，則指Argonaute。若理解為最初切割dsRNA的酶，則指Dicer。更嚴謹?shù)拇鸢笐獏^(qū)分，但根據(jù)常見考法，若指切割mRNA，RNaseH更相關。但Dicer是主要切割dsRNA的。重新審題，問“切割活性的核酸內切酶”，Dicer切割dsRNA，RNaseH切割mRNA。RISC整體識別切割，但具體酶活性常歸因于RNaseH或Argonaute-RNaseH復合物。此題選項不嚴謹。假設問切割mRNA的，RNaseH是答案。假設問切割dsRNA的，Dicer是答案。題目可能指RISC復合物中的酶活性，或最初加工的酶。常見理解是RNaseH負責mRNA降解。故選CRNaseH。需注意題目可能不嚴謹。**修正思路：題目問“切割活性的核酸內切酶”。在RNAi通路中，切割dsRNA的是Dicer。切割靶mRNA的是RISC復合物中的組分，主要是RNaseH樣酶（如eIF2C1/eIF2C2）。Argonaute是核心蛋白，結合siRNA/miRNA并參與切割，但切割功能常歸因于其結合的RNA或RNaseH。題目可能指切割mRNA的酶。***再修正思路：題目可能指最初切割dsRNA的酶，即Dicer。也可能指切割mRNA的酶，即RISC中的RNaseH。選項C是RNaseH。選項A是Dicer。若必須選一個，RNaseH是靶mRNA降解的關鍵酶。假設題目意在問RISC中起切割mRNA作用的酶。***最終選擇CRNaseH，并承認題目選項可能存在混淆。*4.D解析：siRNA進入RISC復合物后，其雙鏈結構被解旋，只有一條鏈被保留下來，這條具有引導作用的單鏈siRNA被稱為guideRNA（gRNA）。5.C解析：gRNA（guideRNA）是進入RISC復合物后解旋的單鏈siRNA，其作用是像“導航儀”一樣，引導RISC復合物找到并識別與之序列互補的靶mRNA。6.C解析：脫靶效應（off-targeteffects）是指siRNA除了與設計的目標mRNA互補外，還與其他具有部分序列同源性的非目標mRNA發(fā)生結合和切割，導致非預期的基因沉默現(xiàn)象。7.C解析：RNA干擾的基因功能喪失（geneknockdown）表型主要是通過RISC復合物識別并切割目標mRNA，導致目標mRNA的降解，從而減少或消除目標蛋白的翻譯。8.C解析：體外合成（化學合成）和體外轉錄是實驗室常用的siRNA制備方法。逆轉錄是將RNA逆轉錄為DNA的過程，不屬于siRNA合成?；蚓庉嬍侵钢苯有薷幕蚪MDNA序列的技術。9.C解析：脂質體或脂質納米顆粒因其良好的生物相容性和轉染能力，常被用作將siRNA遞送到植物細胞（以及動物細胞）的方法。電穿孔和病毒載體也是有效方法，但脂質體在植物中應用廣泛且易于操作。10.C解析：RNA干擾技術最早是被用來研究基因功能的工具。Fire等人在1998年利用RNA干擾成功沉默了線蟲的基因，開啟了功能基因組學研究的新時代。11.C解析：siRNA與靶mRNA需要形成穩(wěn)定的局部雙鏈結構才能被RISC有效識別和切割。如果兩者Tm值差異過大，會導致局部解鏈溫度不匹配，影響結合效率。匹配的Tm值有助于形成穩(wěn)定的雙鏈體，提高切割效率。12.B解析：miRNA來源于基因組中特定的非編碼區(qū)（如內含子、基因間區(qū)），在轉錄后通過Drosha和Dicer加工產(chǎn)生。它們通常不來源于外源dsRNA，也不像siRNA那樣直接切割靶mRNA，而是通過不完全互補配對誘導靶mRNA翻譯抑制或降解。13.D解析：RNA干擾通路是真核生物抵抗外來核酸（病毒RNA、轉座子RNA）入侵的重要防御機制，可以識別并降解這些外來dsRNA。14.C解析：ASO（反義寡核苷酸）技術是利用人工合成的、與靶mRNA互補的寡核苷酸（可以是DNA或修飾過的RNA），通過類似RNA干擾的機制（通常是RNaseH依賴性）來降解靶mRNA，從而抑制基因表達。這與內源性的RNAi機制相似，但ASO是外源提供的。15.D解析：RNA干擾技術應用于基因治療時面臨多重挑戰(zhàn)：遞送效率（如何將siRNA有效送達目標細胞和組織）、特異性（如何避免脫靶效應）、以及可能引起的免疫原性或脫靶毒性等。16.B解析：Argonaute蛋白是RISC（RNA誘導沉默復合物）的核心組分，它們結合siRNA或miRNA，并提供必要的結構平臺和酶活性（或招募酶活性）來執(zhí)行基因沉默功能。17.B解析：miRNA通常來源于基因的內含子區(qū)域或基因間隔區(qū)域，通過轉錄和后續(xù)的Dicer加工產(chǎn)生，其長度通常比siRNA短。而siRNA通常來源于外源或內源的雙鏈RNA（dsRNA）。18.A解析：RNA干擾技術的核心貢獻在于提供了一種強大而精確的、通過序列特異性降解mRNA來研究基因功能的方法，極大地推動了功能基因組學的發(fā)展。19.D解析：在利用RNAi進行基因功能研究時，觀察到的基因沉默表型可能是由目標基因本身引起的，也可能是由非特異性靶向（脫靶）或其他實驗因素（載體、操作）引起的。為了確證因果關系，必須排除這些潛在的干擾因素。20.D解析：將gRNA設計融入CRISPR/Cas系統(tǒng)，可以將RNA干擾的序列特異性引導機制與DNA編輯的強大切割能力相結合，從而擴展基因編輯的靶向范圍（可以編輯非編碼區(qū)），提高編輯效率，并可能通過ASO機制實現(xiàn)更精確的基因抑制，實現(xiàn)功能獲得或喪失研究。21.RNA；mRNA解析：RNA干擾的核心機制是利用小干擾RNA（siRNA）作為引導分子，在RISC復合物中識別并切割（降解）互補的mRNA。22.雙鏈RNA（dsRNA）解析：Dicer（一種核酸內切酶）是RNA干擾通路的關鍵酶，它識別細胞中存在的雙鏈RNA（dsRNA），無論是外源的（如病毒RNA）還是內源的（如基因重復序列產(chǎn)生的dsRNA），并將其切割成小分子量的siRNA（通常約21-23nt）。23.特異性（或序列同源性）解析：設計的siRNA要想有效地沉默目標基因，首先必須與靶mRNA的特定序列具有高度的互補性和特異性，這樣才能被RISC識別并結合，進而導致靶mRNA的降解。其次，siRNA自身的兩條鏈也需要有合適的Tm值等性質，以便穩(wěn)定地結合形成發(fā)夾結構，并被RISC有效利用。24.表觀遺傳解析：在某些植物（如擬南芥）中，RNA干擾的基因沉默效應可以通過表觀遺傳遺傳（epigeneticinheritance）的方式傳遞給后代，這種現(xiàn)象被稱為共轉錄基因沉默（co-transcriptionalgenesilencing,CTS）或RNA介導的表觀遺傳沉默（RNA-directedDNAmethylation,RdDM），涉及DNA甲基化和組蛋白修飾的遺傳。25.特異性；高效性解析：RNA干擾技術具有高度的序列特異性，即只針對與其序列互補的mRNA起作用，這使其成為研究基因功能的有力工具。同時，RNA干擾通常具有高效性，即使是少量的siRNA也能引起顯著的基因沉默表型。26.簡述RNA干擾技術的基本流程，包括關鍵組分及其功能。解析：1.dsRNA的生成：在細胞內，由于基因重復序列、病毒感染或人工導入等原因產(chǎn)生雙鏈RNA（dsRNA）。或者，通過人工合成siRNA。2.Dicer切割：核酸內切酶Dicer識別并切割dsRNA，生成約21-23nt、具有發(fā)夾結構的小干擾RNA（siRNA）。Dicer同時去除發(fā)夾結構中的磷酸二酯鍵，形成兩條互補的siRNA鏈。3.RISC復合物的組裝：其中一條鏈（通常稱為passengerstrand，或非引導鏈）被降解，另一條鏈（guidestrand，或引導鏈）與Dicer相關蛋白（如R2D2、PACT）以及核心Argonaute蛋白結合，形成RNA誘導沉默復合物（RISC）。4.靶mRNA的識別：gRNA（來自guidestrand）通過堿基互補配對，引導RISC復合物識別細胞質中的靶mRNA。5.靶mRNA的切割/抑制：RISC復合物中的Argonaute蛋白和（或）RNaseH樣酶（如人類hRNaseH1）負責切割靶mRNA。切割后，mRNA被降解，導致目標基因的轉錄后沉默（功能喪失）。在某些情況下，也可能通過抑制核糖體與mRNA的結合來抑制翻譯。關鍵組分：*dsRNA：RNA干擾的起始分子。*Dicer：核酸內切酶，切割dsRNA生成siRNA。*siRNA：小干擾RNA，攜帶靶標信息，是RISC的引導分子。*RISC：RNA誘導沉默復合物，執(zhí)行基因沉默功能。*Argonaute蛋白：RISC的核心組分，結合siRNA/gRNA，并提供切割活性或招募切割酶。*gRNA：guideRNA，siRNA解旋后的一條鏈，引導RISC識別靶mRNA。*RNaseH：核酸酶，切割靶mRNA的RNA鏈。*靶mRNA：被識別和切割（或抑制）的互補RNA分子。27.列舉并簡述至少三種用于將siRNA遞送到細胞內的方法，并比較其優(yōu)缺點。解析：1.脂質體/脂質納米顆粒（Lipids/Liposomes）：*簡述：利用人工合成的或天然修飾的脂質分子形成脂質體，包裹siRNA，通過融合或內吞作用進入細胞。*優(yōu)點：生物相容性好，制備相對簡單，可對脂質進行功能化修飾以提高穩(wěn)定性、靶向性或細胞通透性，適用于多種細胞類型，包括難以轉染的原代細胞。*缺點：轉染效率可能受脂質配方、siRNA濃度、細胞類型等多種因素影響，存在潛在的細胞毒性或免疫原性問題，遞送效率有時不夠高。2.電穿孔（Electroporation）：*簡述：在細胞外施加短暫的強電脈沖，使細胞膜上形成暫時性的納米級孔洞，siRNA通過這些孔洞進入細胞內部，電脈沖停止后孔洞關閉。*優(yōu)點：轉染效率高，尤其適用于難轉染的細胞和組織的原位轉染，操作相對快速，可同時遞送多種分子。*缺點：存在一定的細胞毒性，可能導致細胞死亡或功能損傷，對操作條件（電壓、時間、頻率）敏感，重復使用可能導致效率下降。3.病毒載體（ViralVectors）：*簡述：利用經(jīng)過改造的病毒載體（如腺病毒、慢病毒、逆轉錄相關病毒等），將編碼siRNA的表達盒或直接將siRNA序列包裝到病毒顆粒中，通過感染將siRNA遞送入細胞。*優(yōu)點：轉染效率極高，能有效地將siRNA遞送到分化的細胞甚至組織器官中，慢病毒等載體可實現(xiàn)長期表達。*缺點：存在免疫原性風險，可能引發(fā)免疫反應；病毒載體本身存在潛在的安全性風險；制備過程復雜，成本較高；可能存在插入突變的風險（尤其是使用逆轉錄病毒時）；宿主范圍有限。4.（可選補充）核酸酶保護載體/納米顆粒（NucleaseProtectionVectors/Nanoparticles）：*簡述：將siRNA包裹在能夠抵抗細胞內核酸酶降解的載體（如質粒DNA、環(huán)狀RNA等）內部，或利用特殊設計的納米材料（如殼聚糖、脫氧核糖核苷酸聚合物等）進行保護性遞送。*優(yōu)點：可以保護siRNA免受降解，提高遞送效率和穩(wěn)定性。*缺點：載體本身可能引入額外的免疫原性或毒性；遞送系統(tǒng)可能較為復雜。比較：各種方法各有優(yōu)劣，選擇哪種方法取決于具體的應用場景（體外研究vs體內治療、細胞類型、遞送部位、成本要求、安全性考量等）。例如，體外短期功能研究可能更傾向于使用脂質體；難轉染細胞可能需要電穿孔；體內治療則需要考慮病毒載體的高效遞送和安全性問題。28.RNA干擾技術在基因治療應用中存在哪些主要局限性？請至少提出兩種可能的解決方案。解析：RNA干擾技術在基因治療中的應用面臨的主要局限性包括：1.遞送效率與靶向性有限：將siRNA有效且特異性地遞送到體內的特定器官、組織和細胞類型（尤其是難治性器官如大腦、骨髓）仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。非特異性遞送可能導致脫靶效應，而靶向遞送效率低則限制了治療效果。*解決方案：*開發(fā)更先進、更高效的遞送系統(tǒng)，如改進的脂質納米顆粒（LNPs）、聚合物納米粒、外泌體、基因編輯相關遞送載體（如改造的AAV、Cas9蛋白/核酸酶復合物）等，以提高siRNA的細胞內攝取效率和跨膜能力，并增強其組織靶向性（通過配體修飾、活性物質共遞送等）。*精確調控遞送策略，如利用腫瘤相關血管的滲透性窗口、開發(fā)組織特異性啟動子驅動的siRNA表達系統(tǒng)等。2.脫靶效應：siRNA可能與其靶基因以外的其他基因序列存在部分同源性，導致切割非目標mRNA，引發(fā)副作用。此外，siRNA本身或其遞送載體也可能引起免疫反應。*解決方案：*優(yōu)化siRNA設計：采用生物信息學算法，精心設計siRNA序列，選擇具有高特異性、低脫靶風險的靶位點，并測試其脫靶效應。例如，選擇在基因組中獨特的靶位點，避免與已知基因有低度同源。*開發(fā)脫靶效應降低技術：如使用雙重或三重siRNA設計（靶向同一基因的不同位點或相關基因），以增強特異性并減少脫靶；發(fā)展能實時監(jiān)測或篩選脫靶效應的體內分析方法；利用化學修飾（如2'-O-甲基化）提高siRNA的序列特異性和穩(wěn)定性，降低免疫原性。3.siRNA的穩(wěn)定性問題：在血液中，siRNA易被血漿中的核酸酶（如核糖核酸酶A/RNAseA）降解，導致半衰期短，限制了單次給藥的療效和減少了給藥次數(shù)。*解決方案：對siRNA進行化學修飾，如在核糖的2'-位置引入甲基（2'-O-methyl）、乙?；?'-O-acetyl）或其他保護基團，可以顯著提高其抵抗核酸酶降解的能力，延長其在體內的循環(huán)時間。4.免疫原性：長鏈核酸（如siRNA）作為外源分子可能被人體的免疫系統(tǒng)識別，引發(fā)炎癥反應或產(chǎn)生抗siRNA抗體，后者可能降低siRNA的療效并可能引起過敏反應。*解決方案：對siRNA進行化學修飾（如2'-O-甲基化、磷?；龋┛梢越档推涿庖咴浴Ｍ瑫r，優(yōu)化遞送載體（如使用惰性材料、降低載體免疫原性）也很重要。進行充分的預臨床免疫原性評估。除了上述幾點，還可能包括siRNA成本較高、難以同時沉默多個靶點、長期遞送和維持療效的挑戰(zhàn)等。解決方案也涉及工藝優(yōu)化、成本控制、多靶點聯(lián)合沉默策略（如使用siRNAcocktail）等方面。29.論述miRNA與siRNA在生物體內介導基因沉默的過程中，它們在來源、結構、作用機制以及對靶標的選擇性等方面的主要異同點。并舉例說明miRNA在生物體內的重要功能。解析：miRNA（microRNA）與siRNA（smallinterferingRNA）都是長度約為21-23nt的單鏈RNA分子，通過相似的作用機制在生物體內介導基因沉默，但它們在來源、結構細節(jié)、作用機制細節(jié)以及對靶標的選擇性等方面存在主要異同點。主要異同點：|特征|miRNA|siRNA||------------|--------------------------------------------------------|---------------------------------------------------------------||來源|通常來源于基因組中的內含子、基因間區(qū)或外顯子區(qū)域，是基因轉錄本（pre-mRNA）的衍生物。|通常來源于外源雙鏈RNA（如病毒RNA、轉座子RNA），或內源的雙鏈RNA（如基因重復序列、發(fā)夾結構）。也可以是人工合成的。||結構|在轉錄后加工過程中，miRNA通常先被核內RNA結合蛋白（RBP）識別，然后由Drosha（核內）切割成約70nt的pre-miRNA，再被轉運到細胞質中由Dicer切割成成熟miRNA（單鏈）。miRNA通常位于一個更大的轉錄本（如pre-mRNA）中。|siRNA通常直接由Dicer切割雙鏈RNA（dsRNA）產(chǎn)生，或由人工合成。它是一個獨立的分子，通常不包含在其他大分子中。||作用機制|miRNA通常通過不完全互補配對（不完全堿基配對，存在錯配和/或空位）與靶mRNA的3'-非編碼區(qū)（3'-UTR）結合。這種結合主要通過RISC復合物中的Argonaute蛋白（如Ago2）介導，通常會抑制靶mRNA的翻譯起始，或者在某些情況下促進其降解。