第51課時基因工程的基本工具和操作程序

課1.闡明DNA重組技術的實現(xiàn)需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和

標載體三種基本工具。

要2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表

求達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。

1.重組DNA技術

2024?山東卷，5；2024?江西卷,12；2023?新課標卷,6

的基本工具

考

2024?重慶卷，19；2024湖南卷,21：2024?甘肅卷，24：

情

2024?安徽卷，20;2024?河北卷,22；2024?山東卷，25；

分2.基因工程的基

2024?全國甲卷，38；2024?新課標卷，35；2024?黑吉遼

析本操作程序

卷，25；2023,全國乙卷,38；2023?全國甲卷，38；2023?湖

北卷，4；2023?廣東卷，20

命題點一重組DNA技術的基本工具

主干知識?復盤再研必備知識

1.基因工程的概念

［認知覺醒］基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新

的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。下列關于基因

工程的敘述，錯誤的有0

①基因工程的原理是基因突變

②從操作層面看，基因工程是在細胞水平上進行設計和施工的

③基因工程能克服遠緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀

④基因工程是在生物化學、分子生物學和微生物學等學科的基礎上發(fā)展起來的

提示①②

2.基因工程的工具

［認知覺醒］EcoRI限制酶的識別序列和切割位點為5，-GIAATTC-3\

SmaI限制酶的識別序列和切割位點為5，一CCCIGGG-3%下列關于限制酶（限

制性內切核酸酶)的敘述，正確的是_______。

①限制酶只存在于原核生物中

②限制酶能識別DNA分子的特定核甘酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷

酸二酯鍵斷開

③EcoRI限制酶切割DNA分子后形成平末端

@Sma1限制酶切割DNA分子后形成黏性末端

⑤EcoRI限制酶是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制醐

提示②⑤

1967年，世界上幾個實驗室兒乎同時發(fā)現(xiàn)了一種能夠將兩個DNA片段連接起

來的酶,稱之為DNA連接酶。下列關于DNA連接酶的敘述,錯誤的有o

①DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的斷裂

②T4DNA連接酶只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有

平末端的DNA片段

③E.co〃DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫

合”雙鏈DNA片段的平末端

@T4DNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠低于E.coliDNA連

接酶

⑤DNA連接酶與DNA聚合醐是同一種酶，作用相同

提示①②④⑤

思維升華(l)DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的

脫氧核甘酸連接到已有的DNA片段上。

(2)DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。

基因工程中的載體，能攜帶外源DNA片段進入受體細胞，被稱為“分子運輸

車”。

⑴基因工程中通常是利用作為載體，將基因送入細胞。除此以外，常用

的載體還有等。

提示質粒噬菌體、動植物病毒

(2)作為基因工程的載體，應滿足哪些主要條件？

提示①能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNAL,隨受體DNA同步復

制；②有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中；③有特

殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選。

I關鍵能力?提升深研典型例題

題型1基因工程的兩大工具酶（科學思維）

[例1]（2023?新課標卷，6）某同學擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接

能為工具，將日的基囚（兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點）和質粒進行切

割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。

II

5,-GAATTC-3,5'-GGATCC-3'

3,-CTTAAG-5,3'-CCTAGG-5'

tf

伽酶2

I5-XGATCT-3,

5,-CCCGGG-3,

3,-GGG<CCC-5,3,-TCTACjA-5,

酣3梅4

下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是（）

A.質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接

B.質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接

答案C

解析酶3切割后得到的是平末端，可以用E.co"DNA連接酶，但￡co〃DNA

連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠低『T4DNA連接酶，A不符

合題意；質粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末

端，二者不能連接，B不符合題意；質粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到

黏性末端，用T4DNA連接酶連接，還能保證目的基因在質粒上的連接方向，此

重組表達載體的構建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質粒

和目的基因，會破壞質粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標

A.在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒

B.所有的質粒都可以作為基因工程中的載體

C.質粒是一種獨立于細菌染色體外的環(huán)狀DNA分子

D.作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因

答案CD

解析在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過

人工改造的，A錯誤；具有一個至多個限制酶切割位點、具有標記基因、能進行

自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制的質粒才可以作為基因

工程中的載體，B錯誤；質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA

之外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，細菌是原核生物，沒有染色體，C正確；作為載體

的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因，且能在受體細

胞中復制并穩(wěn)定保存，DJF確。

［例3］（2025?陜西漢中模擬）質粒是基因工程中常用的一種載體。下列關于質粒的

說法，錯誤的是（）

A.質粒中的喋吟堿基數(shù)和喀咤堿基數(shù)是相等的

B/-些質粒可以整合到目的細胞的染色體.上，隨受體DNA同步復制

C.可以利用質粒上的特殊標記基因對目的基因進行篩選

D.質粒至少應有三個限制酶識別切割位點，便于目的基因插入

答案D

解析雙鏈DNA中，A=T、G=C,因此A+G=T+C,即喋吟堿基數(shù)等于喀唳

堿基數(shù)，A正確；基因工程中的載體必須具備自我復制的能力，或整合到受體DNA

上，隨受體DNA同步復制，以便提供大量的目的基因，B正確；質粒上需要具

有某些特殊的標記基因，以便于重組DNA分子的篩選，C正確；質粒一般具有

一個至多個限制酶切割位點，以供目的基因插入其中，D錯誤。

命題點二基因工程的基本操作程序

主干知識?復盤再研必備知識

1.目的基因的篩選與獲取

［認知覺醒］利用PCR技術獲取和擴增目的基因是基因工程中獲取R的基因的

重要方法之一，其每個循環(huán)的過程如下圖所示。

一

5，

W產353

V,3y=三

三

，r3

5三

彳5

Ir15,伸

三3

三=

物

小

F延

三=

性

⑶三=

三

口-

三=

53r

三=

幽

弓3:

三

5三=

」555S535

3r>.

(1)PCR技術的原理是________________________________________________,

⑵變性時，需要將溫度升高到℃以上，目的是破壞模板DNA分子之間

的，使模板雙鏈DNA解聚成o

(3)復性時，溫度下降到℃左右，目的是讓通過堿基互補配

對與兩條單鏈DNA結合。

(4)延伸時，需要將溫度上升到℃左右，溶液中的4種脫氧核甘酸在

酶的作用卜，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。

提示(l)DNA半保留復制(2)90氫鍵單鏈

(3)50兩種引物(4)72耐高溫的DNA聚合

［深度思考］⑴在PCR過程中實際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、

dCTP),其有何作用？

提示既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。

(2)為擴增目的基因，應選擇下圖所示引物中的

弓網II3,

目的基閃I

3，-，~，S'

,引物II引物IV'

提示引物1【和引物川

(3)設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿

基序歹|J)都不合理(如圖)，請分別說明理由。

引物I

第1組引物CAGGCT

引物【I

AGCCTG

引物I'

笫2組引物AACTGCAGTT

引物『

CGACTGATTA

①第1組:

②第2組：。

提示引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補配對而失效引物I'自身折疊后會出

現(xiàn)局部堿基互補配對而失效

（4）若一個DNA分子在PCR中經過〃輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個引物？第〃

輪循環(huán)需要消耗多少個引物數(shù)？

提示經過〃輪循環(huán)需要消耗引物數(shù)為（2內一2）個，第〃輪循環(huán)需要消耗的引物

數(shù)為2〃個。

思維升華體內DNA復制與PCR技術的比較

PCR技術體內DNA復制

原則堿基互補配對

相

DNA母鏈作為模板、弓1物（體內弓1物RNA、體外引物DNA）、4

同條件

種脫氧核井酸為原料

點

延伸方向新鏈都是從5,端向3'端延伸

解旋方式90℃以上高溫解旋解旋酶催化

場所PCR擴增儀主要在細胞核

延伸用酶耐高溫的DNA聚合酶DNA聚合酶

不

溫度控制溫度、需要在不同溫度下進行細胞內溫和條件

同

點5

過程r>41111

’3，；：w,

結果大量的DNA片段（或目的基因）形成完整的子代DNA

2.基因表達載體的構建——核心

［認知覺醒I構建基因表達載體

是基因工程的核心工作。如圖表示基因表達載體的一般構成，請回答問題:

⑴構建基因表達載體的目的是什么？

提示使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時使目的基因

能夠表達和發(fā)揮作用。

(2)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的游，緊挨轉

錄的起始位點，它是_________________識別和結合的部位。

提示上RNA聚合解

(3)構建因表達載體的過程分為酶切和連接兩個步驟。下圖為構建基因表達載體時

所用的載體及目的基因所在DNA片段上限制酶的識別切割位點情況。

Sp?I5,-ACTAGT-3,

&oRl5—G入ATTC-3'

BamttI5'-G%ATCC-3'&oRl

/BamHI

BN115J《GATCT-3'后

HindIII5'-A'AGCTT-3'(uni

、終止子

IEioRI0g/11

5Tii―r星制i

?一t目的基因t[5,原點、

標記法因

SueISpeIHindIII

①構建基因表達載體時(“能”或“不能”EcoRI,原因是

提示不能反。RI會破壞目的基因

②選擇SpcI進行單酶切構建基因表達載體時，容易出現(xiàn)目的基因和載體的自身

環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接，導致目的基因轉錄時出現(xiàn)錯誤，無法

表達正常的蛋白質。

提示模板鏈

③選擇BamHI與Bg/H進行雙酶切構建基因表達載體時，能否避免單酶切時出現(xiàn)

的目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接？為什么？

提示不能，因為及7HI與雖然識別序列不同，但是切割后產生的黏性末

端相同。

④選擇BamWI與dill進行雙酶切構建基因表達載體時，能否避免單酶切時出

現(xiàn)的目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接？為什么？

提示能，因為8刖汨1與”泳1IH切割后產生的黏性末端不同。

思維升華關于同尾酶及切割連接

不同種限制性內切核酸酶識別序列各不相同，但切割后能產生相同的黏性末端，

則稱為同尾酶。如HI、BelIBglll、Sau3AI、X/wII為一組同尾酶，它

們的識別序列和切割位點依次分別是5'—G\GATCC—3'、5'—TIGATCA-3'、

5'-AIGATCT—3'、5'—IGATC-3'、5'—RIGATCY-3',它們切割DNA后

都形成由GATC組成的黏性末端。

由同尾酶酶切產生的DNA片段，能夠通過黏性末端的互補作用而彼此連接起來。

一般情況下，同尾酶產生的黏性末端連接后不能再被原來的限制酶切割，這是因

為同尾酶產生的黏性末端連接后原來的酶切位點將不復存在，故不能被原來的限

制酶切割，但可以被識別序列短的限制酶切割，如被上述Saw3Al識別并切割。

3.將目的基因導入受體細胞

［認知覺醒］將構建好的基因表達載體導入不同受體細胞，往往采取不同的方

法。

（1）將基因表達載體導入植物細胞，常常采用法或法。

⑵將基因表達載體導入動物細胞，受體細胞通常是動物,一般采用

____________法。

（3）將基因表達載體導入原核細胞時，應用最為廣泛的受體細胞是____________,

一-般先用處理受體細胞，使其處于一種

的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達載體導入其中。

提示（1）花粉管通道農桿菌轉化（2）受精卵顯微注射（3）大腸桿菌Ca2h

能吸收周圍環(huán)境中DNA分子

?名師解讀，

（1）農桿菌特點

①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染

能力。

②農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能二符Ti質粒上的T-DNA轉

移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。

⑵農桿菌轉化法中的兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的

T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細

胞的染色體DNA上；兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿

菌，第二次導入（非人工操作）是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。

（3）導入的目的基因，可能存在于細胞質中，也可能整合到染色體DNA上。存在

于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中，造成

“基因污染”。

4.目的基因的檢測與鑒定

［認知覺醒］目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，還

需要進行檢測與鑒定。

（1）分子水平的檢測，通常借助等技術，檢測受體染色體DNA上是否插

入目的基因或目的基因是否;

從轉基囚生物體

內提取出相關蛋白質，用相應的抗體進行,檢測目的基因

是否翻譯出相應的蛋白質。

⑵水平的鑒定，通過抗蟲、抗病接種實驗，檢測轉基因生物是

否賦予了相關的遺傳特性以及這種特性的程度。

提示（l）PCR轉錄出mRNA抗原一抗體雜交

（2）個體生物學

關鍵能力,提升深研典型例題

題型基因工程的基本步驟（科學思維）

［例1］（2023?湖北卷，4）用氨節(jié)青霉素抗性基因（A〃!〃R）、四環(huán)素抗性基因（左產）作為

標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶

切后的質粒，構建基區(qū)表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤

的是（）

HindIH

Ptu1“SphT

SeaI

A.若用“加dHI酶切，目的基因轉錄的產物可能不同

B.若用Gul能切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用SphI酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否

D.若用SphI酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨平青霉素）和Tet的培養(yǎng)基

中能形成菌落

答案D

解析若用〃山din酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物

可能不同，A正確；若用PmI酶切，重組質粒和質粒中都有四環(huán)素抗性基因（我產）,

因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝

膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠

鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；S/MI的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因中，

若用5〃〃【酶切，會破壞四環(huán)素抗性基因，重組質粒中含氨苦青霉素抗性基因

(A〃?pR),因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨羊青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌

落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。

[例2](2024?江蘇卷，23)為了高效純化超氧化物歧化酶(SOD),科研人員將ELP50

片段插入pET-SOD構建重組質粒pET-SOD-ELP50,以融合表達SOD-ELPso

蛋白，過程如圖1。其中，ELPso是由人工合成的DNA片段，序列為：限制酶a

識別序列一(GTTCCTGGTGTTGGC)5o一限制酶b識別序歹ij,50為重復次數(shù)。請

回答下列問題：

⑴步驟①雙酶切時，需使用的限制酶a和限制酶b分別是

(2)步驟②轉化時，科研人員常用處理大楊桿菌，使細胞處于感受態(tài)，轉

化后的大腸桿菌采用含有的培養(yǎng)基進行篩選。用PCR技術篩選成功導入

pET—SOD—ELP50的大腸桿菌，應選用的一對引物是o

⑶步驟③大腸桿菌中RNA聚合酶與結合，驅動轉錄，翻譯SOD-ELP50

蛋白。已知蛋白質中氨基酸殘基的平均相對分子質量約為0.11kDa,將表達的蛋

白先進行凝膠電泳，然后用SOD抗體進行雜交，顯示的條帶應是_______(從圖

2的“A?D”中選填)。

(4)步驟④為探尋高效純化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人員研究了溫度、NaCl

對SOD-ELPso蛋白純化效果的影響，部分結果如圖3。

不力IINaCI力口NaCI不加NaCI川NaCl

20tloot

圖3

①20℃時，加入NaCl后實驗結果是_______________

②100℃時，導致各組中所有蛋白都沉淀的原因是0

③據圖分析，融合表達S0D-ELP5。蛋白的優(yōu)點有

_____________________________________________________________________0

答案⑴氏oRI、HindlW

⑵CaCb卡那霉素S-F和E-R

(3)啟動子C

(4)①SOD-ELP$o組純化蛋白含量比SOD組高②高溫使蛋白變性，離心后沉淀

③純化回收率高、雜蛋白少、低溫下純化有利于酶活性的保持

解析(1)目的基因應插入啟動子和終止子之間，結合題意可知，ELP50應插入pET

一SOD之后，由圖可知，限制酶a和限制酶b分別是EcoRI、H山dill。(2)步驟

②轉化時常用CaCb處理細菌，使細胞處于感受態(tài)。由圖可知，重組DNA含有標

記基因卡那霉素抗性基因，所以轉化后的大腸桿菌采用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進

行篩選。pET-SOD-ELPso的大腸桿菌同時含有SOD和ELPso,結合圖示可知，

選用引物S-F和E-R可特異性對SOD-ELPso進行擴增。(3)RNA聚合酶與啟

動子結合后，驅動轉錄。由圖1可知，ELPso中一(GTTCCTGGTGTTGGC)50一轉

錄出的RNA對應5X50=250(個)密碼子，ELPso為750bp,SOD為462bp,同理

可以算出SOD轉錄出的RNA對應154個密碼子，則pET—SOD—ELPso轉錄出

的RNA對應404個密碼子，即對應404個氨基酸，其脫水縮合形成的蛋白質質

量為404X0.U=44.44（kDa）,電泳后應該為條帶C。（4）①由圖3可知，20℃時，

加入NaCl后，SOD—ELPso組較SOD組純化蛋白數(shù)量更多。②100C時，溫度過

高，導致蛋白質變性而沉淀。③20℃,加入NaCl時，與SOD組相比，SOD—ELPso

組沉淀中蛋白質相對含量較高，說明低溫下添加Na。有利于SOD蛋白純化，且

雜蛋白較少，有利于酶活性的保持。

■關鍵?真題必刷

1.（2023?重慶卷，12）某小組通過PCR（假設引物長度為8個堿基，短于實際長度）

獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切（如下圖），再用所得片段

成功構建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是（）

限制酶S/,eI5'-ACTAGT-3'

識別序列3'-TGATCA-5'

Niu-I5'-GCTAGC-3'QbI5'-GCGC-3'

3,-CGATCG-5,：r-CGCG-5'

擴增茯得

S^AGCTAGCAATGCTC……ATGAACTGCGCA-3,

的

DNA：r-TCGATCGTTACGAG……TACTTGACGCGT-S,

片段①刖力

5r-CTAGCAATGCTC....ATGAACTGCG-B*

rr-GTTACGAG.......TACTTGAC-5*

A.實驗所用引物，其中一個序列為5-TGCGCAGT-3,

B.步驟①所用酶是SpeI和C狗I

C.用步驟①的酶對載體進行酶切至少獲得了2個片段

D.酶切片段和載體連接時可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶

答案B

解析根據擴增所得DNA片段可知，實驗所用的兩種引物序列為5，一

TGCGCAGT-3,和5，-AGCTAGCA—31A正確；根據酶切后得到的黏性末端判

斷，步驟①所用酶是人力el和依I,B錯誤；步驟①用兩種酶切割載體（質粒）,

質粒上至少有兩個切口，至少產生2個片段，C正確；目的基因片段和質粒經酶

切后產生的均為黏性末端，可用￡co"DNA連接酶或T4DNA連接酶連接，D正

確。

2.（2024?重慶卷，19）大豆是重要的糧油作物，提高大豆產量是我國農業(yè)領域的重

要任務。我國研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN（種子較大）中的表達量高于品

種TL（種子較?。?，然后克隆了該基因（兩品種中基因S序列無差異）及其上游的啟

動子序列，并開展相關研究。

①表達載體

限制酶識別位點(“加dill,SpeI,EcoRI,XbaI)

②啟動子D+基因S

5c.......TAGAATTCCA.......3，

3'.......ATCTTAAGGT.......5'

③四種限制酶識別序列及切割位點

叫di"S罕IEcoRIXba\

5JAAGCTT-3'5=ACTAGT-3'5'-GAATTC-3'5-TCTAGA-3f

3JTTCGAA-5'3JTGATCA-5'3-CTTAAG-5f3'-AGATCT-5'

Itt?

注：箭頭表示酶的切割位置。

(1)基因S啟動子的基本組成單位是________0

⑵通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D+基因S”序列導入無基因S的

優(yōu)質大豆品種YZo根據題圖所示信息(不考慮未標明序列)判斷構建重組表達載體

時，為保證目標序列的完整性，不宜使用的限制酶是；此外，不宜同時

選用酶SpeI和XbaI,原因是_______________________________________

(3)為驗證“啟動子D+基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達

載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應

有o經驗證的重組表達載體需轉入農桿菌，檢測轉入是否

成功的技術是_______o

(4)用檢測后的農桿菌轉化品種YZ所得再生植株YZ-1的種子變大。同時將從

TL克隆的“啟動子T+基因S”序列成功導入YZ,所得再生植株YZ-2的種子

也變大，但小于YZ-U綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是

答案(1)脫氧核糖核甘酸(脫氧核甘酸)(2)EcoRI酶切后形成的片段黏性末

端相同，易自我環(huán)化；不能保證目標片段與載體定向連接（或反向連接）（3）酶切

后的空載體片段、“啟動子D+基因S”片段PCR（4）品種DN的基因S上游

啟動子效應比TL強，使得基因S表達量更高，種子更大

解析（1）啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，用于啟動基因的轉錄，是一

段有特殊結構序列的DNA片段，其基本組成單位是脫氧核糖核普酸。（2）根據圖

示信息可知，“啟動子D+基因S”的DNA序列上存在EcoRi的識別序列，若

使用限制酶EcoRI，會使目的基因序列被破壞；根據圖中限制酶的識別序列可知，

酶SpeI和XMI切割產生的黏性末端相同，若用這兩種限制酶切割，形成的DNA

片段在構建基因表達載體時，容易出現(xiàn)自我環(huán)化，以及無法保證目的基因片段與

載體片段定向連接，影響目的基因在受體細胞中的表達。（3）DNA電泳可以分離

不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達載體酶切后的產物不僅有“啟動子

D+基因S”片段，還有酶切后的空載體片段，因此電泳時，對照樣品除指示分

子大小的標準參照物外，還應有酶切后的空載體片段和“啟動子D+基因S”片

段；在分子水平上檢測目的基因是否轉入成功可通過PCR等技術檢測受體細胞的

DNA上是否插入目的基因或目的基因是否轉錄出mRNAo（4）根據題目（4）信息可

知，再生植株YZ—1導入的目的基因為取自品種DN的“啟動子D+基因S”序

列，再生植株YZ—2導入的目的基因為取自品種TL的“啟動子T+基因S”序

列，結合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測：品種DN的基因S上

游的啟動子D的效應強于品種TL的啟動子T,啟動子D使基因S表達量更高，

因而種子更大。

限時練51基因工程的基本工具和操作程序

（時間:40分鐘）

一、選擇題

1.（2025?湖北襄陽四中聯(lián)考）大腸桿菌puC118質粒是基因工程中常用的一種載體，

具有氨芳青霉素抗性基因，該質粒中某限制酶的唯一切點位于LacZ基因中。在

特定的選擇培養(yǎng)基中，若。cZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍色；若LacZ

基因被破壞，則菌落呈白色。關于圖中操作的敘述正確的是（）

氨節(jié)青

試管3

基因

目的

因T

基

貓

用

◎

卜

霉素抗&

性基因

菌）

基細

培養(yǎng)

選擇

試管2

試管1

接酶

A連

和DN

制酶

入限

應加

管1中

A.試

腸桿菌

理大

?'處

用Ca

，需

桿菌

大腸

導入

質粒

重組

中將

管2

B.試

現(xiàn)白色

落均呈