動物病理學實驗程序一、實驗準備

（一）實驗設備與材料

1.實驗設備：

(1)顯微鏡：配備正置與倒置顯微鏡，分辨率不低于0.2μm。

(2)解剖臺：不銹鋼材質(zhì)，尺寸為120cm×80cm，配備照明系統(tǒng)。

(3)組織切片機：手動或自動，切片厚度范圍10-50μm。

(4)離心機：高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)速范圍0-16,000rpm。

(5)電子天平：精度0.1mg，用于樣品稱重。

2.實驗材料：

(1)實驗動物：常用實驗動物包括小鼠、大鼠、兔子等，需符合實驗動物福利標準。

(2)染料與試劑：蘇木精、伊紅、HE染色液，梯度酒精（70%-100%），二甲苯等。

(3)保存液：10%中性緩沖甲醛溶液，75%乙醇溶液。

（二）實驗環(huán)境要求

1.溫濕度控制：實驗室溫度22±2℃，濕度50±10%，保持通風。

2.消毒措施：實驗前使用75%酒精擦拭設備，紫外線消毒30分鐘。

3.個人防護：佩戴實驗服、手套、護目鏡，必要時佩戴口罩。

二、實驗步驟

（一）動物麻醉與處死

1.麻醉方法：

(1)腹腔注射：常用麻醉劑為水合氯醛（300-500mg/kg），緩慢注入。

(2)吸入麻醉：異氟烷濃度1%-3%，持續(xù)通氣。

2.處死標準：

(1)觸摸角膜反射消失，肌肉松弛為有效麻醉。

(2)使用二氧化碳窒息法或頸椎脫臼法快速處死，確保無痛。

（二）樣本采集與固定

1.樣本采集：

(1)器官采集：心、肝、脾等器官用生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中。

(2)組織塊：取病變部位1mm3組織，立即固定。

2.固定規(guī)范：

(1)時間：常溫固定4-6小時，后續(xù)轉(zhuǎn)移至4℃冰箱保存。

(2)濃度：固定液與組織體積比例1:10，避免過度浸泡。

（三）組織處理與切片

1.脫水與透明：

(1)梯度脫水：依次浸泡70%、85%、95%、100%酒精各1小時。

(2)透明處理：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15分鐘，使組織透明。

2.石蠟包埋：

(1)浸蠟：純石蠟60℃浸泡1小時，待組織完全浸透。

(2)包埋：使用模具將組織塊固定，確保切片方向一致。

（四）染色與封片

1.染色流程：

(1)蘇木精染色：60℃加熱30分鐘，自來水沖洗10分鐘。

(2)伊紅復染：1%伊紅溶液10分鐘，蒸餾水沖洗。

2.封片操作：

(1)脫水：梯度酒精脫水至100%。

(2)透明：二甲苯透明5分鐘。

(3)封片：滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，用指甲輕壓固定。

三、實驗記錄與保存

（一）實驗記錄要點

1.記錄內(nèi)容：

(1)動物基本信息：品種、體重、麻醉劑量。

(2)病變觀察：記錄病灶位置、大小、顏色等特征。

(3)染色結(jié)果：描述細胞核形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)變化。

2.數(shù)據(jù)處理：

(1)病變量化：統(tǒng)計病變細胞百分比，計算平均值±標準差。

(2)圖片采集：顯微鏡拍照時設置統(tǒng)一放大倍數(shù)（如400×）。

（二）樣本保存方法

1.短期保存：

(1)石蠟切片：置于干燥柜中室溫保存，有效期1年。

(2)組織原液：-80℃凍存，可用3-6個月。

2.長期保存：

(1)甲醛固定：轉(zhuǎn)移至15%甲醛溶液，-20℃保存5年以上。

(2)冷凍保存：液氮罐保存，使用前需預冷至-196℃。

四、安全注意事項

（一）操作規(guī)范

1.個人防護：

(1)染色時佩戴護目鏡，避免化學試劑接觸皮膚。

(2)切片時使用一次性刀片，防止交叉污染。

2.廢物處理：

(1)化學廢液分類收集，委托專業(yè)機構(gòu)處理。

(2)動物尸體高溫高壓滅菌后深埋。

（二）應急措施

1.試劑泄漏：

(1)小范圍泄漏：用吸附棉擦拭，再用酒精清洗。

(2)大范圍泄漏：疏散人員，使用防爆風機通風。

2.設備故障：

(1)顯微鏡故障：立即斷電檢查電路，聯(lián)系維修人員。

(2)離心機異常：停止運行，檢查轉(zhuǎn)子是否平衡。

**一、實驗準備**

**（一）實驗設備與材料**

1.**實驗設備：**

(1)**顯微鏡：**配備正置與倒置顯微鏡，以滿足不同觀察需求。正置顯微鏡適用于組織切片的精細結(jié)構(gòu)觀察，建議配置數(shù)值孔徑不低于1.4物鏡和100×油鏡，分辨率不低于0.2μm。倒置顯微鏡適用于活體組織、細胞培養(yǎng)或小型器官的觀察，配置長工作距離物鏡以便于操作。確保顯微鏡具備穩(wěn)定的照明系統(tǒng)，如LED冷光源，亮度可調(diào)，且配備數(shù)字攝像頭或攝影系統(tǒng)，以便于圖像采集與記錄。

(2)**解剖臺：**選用不銹鋼材質(zhì)的解剖臺，尺寸根據(jù)實驗規(guī)模選擇，常見的為120cm×80cm，臺面應具備良好的防水、防腐蝕性能，并設有排水系統(tǒng)。配備可調(diào)節(jié)亮度的無影照明燈，確保操作區(qū)域光線充足且無陰影干擾。臺面應平整，邊緣圓潤，防止操作時劃傷。

(3)**組織切片機：**可選用手動或自動組織切片機。手動切片機操作靈活，適用于少量樣本或特殊切片需求；自動切片機效率高，切片厚度均勻，重復性好，更適用于大批量樣本處理。切片厚度范圍應可調(diào)，通常在10-50μm，精確度需達到±5μm。設備應配備鋒利的切片刀片，并定期進行更換和保養(yǎng)。

(4)**離心機：**選用高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)速范圍可達0-16,000rpm，相對離心力（RCF）范圍廣（如0-160,000×g）。離心機需具備精確的速度和定時控制功能，轉(zhuǎn)子需經(jīng)過平衡測試。冷凍功能有助于在離心過程中保持樣品（如細胞沉淀）的活性或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

(5)**電子天平：**選用精度為0.1mg的電子天平，用于精確稱量試劑、樣品或麻醉劑。天平應放置在穩(wěn)固、水平的臺面上，并定期進行校準，確保稱量準確性。

2.**實驗材料：**

(1)**實驗動物：**根據(jù)實驗目的選擇合適的實驗動物，常用有小鼠（如ICR、C57BL/6品系）、大鼠（如SD、Wistar品系）、兔子等。所有實驗動物均需來源可靠，具備完整的出生日期、譜系信息，并符合相應的動物福利標準和實驗動物環(huán)境要求。動物應健康狀況良好，無可見異常。

(2)**染料與試劑：**

***蘇木精（Hematoxylin）：**常用的是堿性蘇木精，用于使細胞核呈藍紫色。

***伊紅（Eosin）：**常用的是酸性伊紅，用于使細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)等呈紅色或粉色。

***HE染色液：**即蘇木精-伊紅復合染色液，是組織病理學最常用的染色方法，能同時區(qū)分細胞核和細胞質(zhì)。

***梯度酒精：**配備一系列濃度梯度酒精，包括70%、85%、95%、100%（無水乙醇），用于組織脫水和透明。

***二甲苯（Xylene）：**兩種純度的二甲苯（如二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ）用于組織透明，便于石蠟浸透和與樹膠混合。

***其他輔助試劑：**如中性樹膠（中性香柏油）、二甲苯替代品（如透明劑）、組織固定液（如4%中性緩沖甲醛溶液）、洗滌液（如蒸餾水、PBS緩沖液）等。

(3)**保存液：**主要為10%中性緩沖甲醛溶液（pH7.4），用于固定新鮮采集的組織樣本，保存其形態(tài)結(jié)構(gòu)。75%乙醇溶液可用于長期保存某些未染色或特定染色的組織樣本，或作為某些染色步驟的溶劑。

**（二）實驗環(huán)境要求**

1.**溫濕度控制：**實驗室應保持恒定的溫度（22±2℃）和相對濕度（50±10%），以減少環(huán)境因素對實驗操作和試劑穩(wěn)定性的影響。良好的通風系統(tǒng)有助于排除有害氣體（如二甲苯揮發(fā)），保持空氣清新。

2.**消毒措施：**實驗前對所有接觸的設備表面（如解剖臺、顯微鏡載物臺）使用75%酒精進行徹底擦拭消毒。必要時，可使用紫外線燈對實驗區(qū)域進行空氣消毒，但需在人員離開后進行，并確保足夠的照射時間（如30分鐘）。所有玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、離心管）均需經(jīng)過高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）處理。

3.**個人防護：**所有參與實驗人員必須佩戴合適的實驗服（覆蓋前胸和前臂），防滲透實驗手套（如丁腈手套），以及護目鏡（必要時佩戴面罩）。長時間操作或處理揮發(fā)性試劑時，建議佩戴口罩。實驗結(jié)束后，需按照規(guī)定流程脫去防護用品并進行手部清潔。

**二、實驗步驟**

**（一）動物麻醉與處死**

1.**麻醉方法：**

***腹腔注射法：**這是最常用的麻醉方法之一。選擇合適的麻醉劑，如水合氯醛（常用劑量為300-500mg/kg體重，溶于生理鹽水或注射用水），根據(jù)動物體重精確計算劑量。用一次性注射器吸取麻醉劑，緩慢地注入動物腹腔（通常選擇下腹部），注射速度不宜過快，以免引起動物驚厥。麻醉效果通常在注射后5-15分鐘顯現(xiàn)，可通過觸摸角膜反射消失、肌肉松弛來判斷麻醉成功。

***吸入麻醉法：**適用于需要觀察麻醉后生理變化或進行特定操作的情況。常用異氟烷作為吸入麻醉劑，根據(jù)設備和個人經(jīng)驗，設置吸入濃度為1%-3%。確保麻醉氣體充分通入，通常通過動物呼吸或?qū)ｉT的麻醉呼吸系統(tǒng)進行。需持續(xù)監(jiān)測麻醉深度。

***其他方法：**根據(jù)實驗需求和動物種類，還可選用其他麻醉方式，如靜脈注射麻醉劑（如戊巴比妥鈉）、吸入麻醉氣體（如地氟烷）等。選擇麻醉方法時需考慮實驗目的、動物種類、麻醉深度要求及安全性。

2.**處死標準：**

***判斷麻醉深度：**成功的麻醉應使動物失去意識，對刺激無反應?？赏ㄟ^觸摸角膜反射消失、對疼痛刺激（如腳底輕彈）無反應、肌肉完全松弛來判斷。確保動物處于無痛狀態(tài)。

***處死方法：**為確?？焖佟⑷说赖靥幩绖游?，避免其遭受痛苦，可選用以下方法：

***二氧化碳窒息法：**將動物置于充滿干燥二氧化碳的密閉容器中，逐步提高濃度，直至動物呼吸停止。此方法相對溫和。

***頸椎脫臼法：**適用于大鼠、小鼠等小型動物?？焖佟蚀_地使動物頸椎脫位，中斷脊髓與腦干的連接。需由經(jīng)驗豐富的人員操作，確保一次性成功。

***其他方法：**如使用特定安樂死設備（如Euthanasiachamber，通過特定氣體混合物快速作用）。處死方法的選擇應遵循動物福利原則，并符合相關(guān)倫理要求。

**（二）樣本采集與固定**

1.**樣本采集：**

***器官采集：**根據(jù)實驗研究目標，選擇需要觀察的器官（如心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦等）。使用無菌手術(shù)器械（如手術(shù)剪、鑷子）進行解剖，仔細分離目標器官。用生理鹽水（0.9%NaCl溶液）或無菌緩沖液沖洗掉血液和雜質(zhì)。采集時注意保持器官的完整性，特別是需要做連續(xù)切片的器官（如腦、脊髓），應按特定方向（如從前向后）進行分段。

***病變部位取樣：**如果動物表現(xiàn)出可見病變（如腫塊、炎癥區(qū)域），應重點采集這些病變部位的組織樣本?？捎檬中g(shù)刀取小塊組織（通常1-2mm3），避免混入正常組織或壞死組織過重。

***組織塊制備：**對于某些實驗（如組織培養(yǎng)、特殊染色），可能需要制備特定大小和形狀的組織塊。使用組織剪或手術(shù)刀將采集到的組織修整成1-3mm3的小塊，確保組織塊大小均勻，便于后續(xù)處理。

***操作要點：**整個采集過程應在無菌條件下進行（或至少在潔凈環(huán)境中），使用無菌器械，動作輕柔，減少組織損傷和污染。采集完成后，立即將組織放入含有適量固定液的容器中。

2.**固定規(guī)范：**

***固定液選擇：**最常用的固定液是10%中性緩沖甲醛溶液（Formalin）。它能使組織蛋白變性凝固，固定細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)。根據(jù)需要也可選用其他固定液，如Bouin's液（適用于神經(jīng)組織）、Zenker's液（適用于細胞核染色）等。

***固定時間：**固定時間對組織結(jié)構(gòu)保存至關(guān)重要。常溫（約20-25℃）固定通常需要4-6小時，對于較大的器官或樣本，可能需要更長時間。之后應將樣本轉(zhuǎn)入4℃冰箱冷藏保存，以減緩固定過程，便于后續(xù)處理。固定時間一般以組織完全變硬為準。

***固定液與組織比例：**固定液體積應至少是組織體積的10倍，甚至更多，以確保組織能被充分浸泡，固定效果更佳。

***注意事項：**固定液濃度不宜過高，以免過度固定導致組織變脆。避免將固定液濺到實驗臺面或其他非目標表面。固定后的樣本應貼上標簽，注明動物編號、器官名稱、固定日期等信息。

**（三）組織處理與切片**

1.**脫水與透明：**

***梯度脫水：**將固定好的組織塊（或已放入小瓶中的器官）從固定液中取出，依次置于不同濃度的梯度酒精中脫水，目的是去除組織中的水分，使其能夠被石蠟浸透。操作步驟通常為：

*70%酒精：浸泡1小時。

*85%酒精：浸泡1小時。

*95%酒精：浸泡1小時。

*100%酒精（無水乙醇）：依次浸泡兩次，每次1小時。每次更換酒精時，需用新的酒精潤洗組織，以去除殘留的lowerconcentration酒精。

***透明處理：**脫水后的組織需要用與石蠟密度相近的透明劑（主要是二甲苯）進行處理，使組織變得透明，便于后續(xù)浸蠟和包埋。操作步驟通常為：

*二甲苯Ⅰ：浸泡15分鐘。

*二甲苯Ⅱ：浸泡15分鐘。使用兩種二甲苯是為了更好地去除酒精，防止脫蠟不徹底。

***操作要點：**脫水和透明過程應在通風良好的環(huán)境下進行，或使用通風櫥，以減少吸入有害有機溶劑蒸汽。每次更換溶液時，需將組織充分浸沒。

2.**石蠟包埋：**

***浸蠟：**將透明后的組織從二甲苯中取出，置于60℃的純石蠟（Paraffinwax）中浸泡1小時左右，使組織充分吸收石蠟，達到與石蠟密度一致的狀態(tài)。

***冷卻：**將組織從60℃的石蠟中取出，自然冷卻至室溫或稍高于室溫（約40-50℃），此時石蠟變得稍微柔軟。

***包埋：**將冷卻后的組織放入預熱至略高于石蠟熔點的包埋盒（Embeddingmold）中。通常在包埋盒底部預先放置一小塊石蠟作為基座。用鑷子或組織鑷輕輕將組織放置在基座上，調(diào)整位置，使其便于切片。然后緩慢、均勻地澆注熔化的石蠟，直至組織完全被石蠟覆蓋，并超出組織邊緣一定距離，形成包埋塊。

***固化與聚合：**靜置包埋盒，待石蠟完全冷卻并凝固。為使包埋塊更堅硬，可在56-60℃的烘箱中干燥1-2小時，促進石蠟聚合。包埋好的組織塊應妥善標記，注明相關(guān)信息。

***注意事項：**包埋時動作要輕柔，避免組織移位或損傷。石蠟量要充足，但不宜過多。包埋塊的大小應適中，便于切片操作。

**（四）染色與封片**

1.**染色流程（以HE染色為例）：**

***脫蠟：**將包埋塊從石蠟中取出，依次置于不同濃度的梯度酒精中脫蠟，去除石蠟，使組織重新變濕。操作步驟通常為：

*100%酒精Ⅰ：浸泡5-10分鐘。

*100%酒精Ⅱ：浸泡5-10分鐘。

*95%酒精：浸泡5分鐘。

*85%酒精：浸泡5分鐘。

*70%酒精：浸泡5分鐘。

*蒸餾水或PBS清洗：浸泡2-3次，每次5分鐘，以去除殘留酒精。

***蘇木精染色：**將組織置于新鮮配置或已使用但效果尚可的蘇木精染色液中，60℃加熱30分鐘，使細胞核著色。加熱有助于蘇木精進入組織，并增強染色效果。染色時間需根據(jù)組織類型和所需染色深度調(diào)整。

***洗滌：**自來水緩慢沖洗10分鐘，或使用緩沖液（如PBS或Tris緩沖液）沖洗，洗去浮色，避免伊紅過度染色細胞核。

***分化（可選）：**對于某些組織或需要更清晰核質(zhì)對比的情況，可在水洗后進行分化。將組織置于蒸餾水中，輕輕晃動或用濾紙吸去多余水分，觀察染色效果，直至細胞核呈清晰的藍色，細胞質(zhì)呈淺色。分化時間需嚴格控制，過長會使細胞核顏色過淺。

***伊紅復染：**將組織置于1%伊紅溶液中，室溫或溫箱中染色10分鐘，使細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)等結(jié)構(gòu)呈紅色或粉色。染色時間根據(jù)背景顏色要求調(diào)整。

***洗滌：**蒸餾水或緩沖液清洗2-3次，每次3-5分鐘，洗去浮色。

2.**脫水與透明：**

***梯度脫水：**將染好色的組織依次置于梯度酒精中脫水，恢復組織硬度，并準備透明。

*70%酒精：浸泡5分鐘。

*85%酒精：浸泡5分鐘。

*95%酒精：浸泡5分鐘。

*100%酒精Ⅰ：浸泡5分鐘。

*100%酒精Ⅱ：浸泡5分鐘。

***透明：**將組織置于二甲苯中透明，使組織與封片劑能夠良好混合。

*二甲苯Ⅰ：浸泡5分鐘。

*二甲苯Ⅱ：浸泡5分鐘。

3.**封片操作：**

***準備載玻片：**使用潔凈的載玻片（蓋玻片應無劃痕、無氣泡）。

***滴加封片劑：**在載玻片中央滴加1-2滴中性樹膠（中性香柏油）。樹膠具有良好的透明度和粘附性，能長期保存切片并清晰顯示組織結(jié)構(gòu)。

***放置切片：**用鑷子小心地將組織切片從切片機（或培養(yǎng)皿）中取出，迅速放置在載玻片上的樹膠滴中央，調(diào)整切片方向。

***蓋上蓋玻片：**小心地將蓋玻片輕輕蓋上，避免產(chǎn)生氣泡?？上茸屢粋?cè)邊緣與樹膠接觸，然后用吸水紙吸去多余樹膠，再緩慢放下另一側(cè)。

***壓片（可選）：**對于較薄的切片或需要觀察細微結(jié)構(gòu)的情況，可用拇指輕輕按壓蓋玻片中央，使組織片展平。注意力度要適中，避免壓碎組織。

***封片劑凝固：**將封好的載玻片置于室溫或稍溫處，待封片劑自然凝固。如有條件，可在烘箱中低溫（如37℃）干燥數(shù)小時，加速凝固，提高封片質(zhì)量。

***標簽：**在載玻片背面或邊緣貼上標簽，注明實驗編號、切片信息、染色方法、日期等。

**三、實驗記錄與保存**

**（一）實驗記錄要點**

1.**記錄內(nèi)容：**

***動物基本信息：**詳細記錄每只實驗動物的品種（如ICR小鼠）、性別、體重、年齡、來源信息（如采購編號、生產(chǎn)批號）。如果是實驗繁殖的后代，還需記錄親本信息。

***實驗分組（如適用）：**如果實驗涉及分組，需記錄每組的動物數(shù)量、編號，以及分配方式。

***麻醉過程：**記錄所使用的麻醉劑名稱、純度、劑量（mg/kg體重）、給藥途徑（如ip、iv）、給藥時間、麻醉起效時間、維持時間。

***處死過程：**記錄處死方法、處死時間、處死操作人員。

***樣本采集：**記錄采集的器官名稱、病變部位描述（如位置、大小、顏色、形態(tài)）、采集時間、固定液種類、固定液體積、初始固定溫度。

***組織處理：**記錄脫水和透明各步驟所使用的試劑名稱、濃度、浸泡時間。記錄切片厚度設置、切片數(shù)量、切片方向（如心臟是沿長軸切）。

***染色過程：**記錄所使用的染色劑名稱、濃度、染色條件（如溫度、時間）、洗滌步驟和時間。記錄分化操作（如有）的條件和時間。

***觀察結(jié)果：**這是記錄的核心。應詳細、客觀地描述組織切片在顯微鏡下的觀察所見，包括：

***整體結(jié)構(gòu)：**器官或組織的整體形態(tài)、大小、邊界是否清晰。

***細胞形態(tài)：**細胞大小、形狀、排列方式、核質(zhì)比例、核形態(tài)（大小、形狀、染色質(zhì)分布、有無核仁）。

***組織結(jié)構(gòu)：**膠原纖維、血管、腺體、上皮等結(jié)構(gòu)的變化，如炎癥細胞浸潤（種類、數(shù)量、分布）、壞死（范圍、形態(tài)）、增生（細胞數(shù)量、排列）等。

***特殊染色表現(xiàn)：**如酶活性呈色、特殊蛋白表達呈色等（如果進行了特殊染色）。

***圖像記錄：**記錄圖像采集的放大倍數(shù)、曝光參數(shù)（如適用）、圖像編號、存儲位置。

2.**數(shù)據(jù)處理：**

***病變量化：**對于需要量化的指標（如炎癥細胞浸潤百分比、腫瘤細胞面積占比、壞死面積比例等），應使用圖像分析軟件（如ImageJ）或手動計數(shù)方法進行測量和統(tǒng)計。通常需要選取多個代表性視野進行測量。

***統(tǒng)計分析：**對量化數(shù)據(jù)進行分析，計算平均值（Mean）、標準差（StandardDeviation）或標準誤（StandardError）。根據(jù)實驗設計，可能需要進行組間比較的統(tǒng)計學檢驗（如t檢驗、方差分析等）。繪制圖表（如柱狀圖、折線圖）直觀展示結(jié)果。

***結(jié)果描述：**清晰、準確地描述統(tǒng)計分析的結(jié)果，包括P值，判斷組間差異是否具有統(tǒng)計學意義。

**（二）樣本保存方法**

1.**短期保存：**

***石蠟切片：**染色封片后的石蠟切片在室溫、干燥、避光條件下可保存數(shù)月（通常6個月至1年）。長期保存需置于4℃冰箱，可保存1-2年。若需長期（數(shù)年）保存，建議置于-20℃或-80℃冰箱，可顯著延長保存期。保存時需防止切片干燥或潮濕。

***組織原液/冰凍樣本：**未經(jīng)過石蠟包埋的組織樣本（如用于細胞學檢查、分子生物學實驗的原液）應保存在合適的保存液中。如用于蛋白質(zhì)檢測，可用含蛋白酶抑制劑的生理鹽水或緩沖液保存；如用于核酸提取，可用TRIzol試劑或RNAlater溶液保存。保存在-20℃冰箱中，通?？杀４鏀?shù)月；如需長期保存，應置于-80℃冰箱。

***組織塊：**未經(jīng)過包埋的組織塊可浸泡在10%中性緩沖甲醛溶液中，置于4℃冰箱保存。如需長期保存，也可置于-20℃或-80℃冷凍。

2.**長期保存：**

***甲醛固定與保存：**將組織塊長期浸泡在15%-20%的中性緩沖甲醛溶液中，置于4℃冰箱保存。這是最常用的長期形態(tài)學保存方法，可保存數(shù)年甚至更長時間。需定期檢查固定液是否渾濁，必要時補充或更換。

***冷凍保存（-80℃）：**對于需要長期保存且后續(xù)可能需要進行分子生物學檢測（如RNA、DNA提?。┗蚣毎麑W分析的樣本，建議進行冷凍保存。將組織樣本置于含cryoprotectant（如10%DMSO）的保存液中，快速冷凍（如使用干冰-乙醇混合物或液氮），然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱或液氮（-196℃）長期保存。冷凍前需進行預冷處理，以減少細胞損傷。

**四、安全注意事項**

**（一）操作規(guī)范**

1.**個人防護：**

***穿戴要求：**任何時候進入實驗區(qū)域，必須穿戴實驗服，必要時佩戴頭套。操作涉及組織處理、染色、封片等環(huán)節(jié)時，必須佩戴防滲透實驗手套（如丁腈手套），并定期更換。進行解剖、切片等可能產(chǎn)生飛濺的操作時，必須佩戴護目鏡，必要時佩戴面罩。

***化學品防護：**處理酒精、二甲苯、甲醛、蘇木精、伊紅等化學試劑時，必須了解其安全數(shù)據(jù)表（SDS），并在通風良好的環(huán)境下操作（如通風櫥）。避免皮膚直接接觸，如不慎接觸，應立即用大量流動清水沖洗，并視情況就醫(yī)。避免吸入蒸氣，必要時佩戴合適的呼吸防護裝置。

***生物安全：**處理動物組織時，即使動物已處死，其體內(nèi)可能仍含有潛在的生物活性物質(zhì)（如病毒、細菌）。操作時應視為潛在傳染源，采取標準預防措施。實驗結(jié)束后，所有廢棄物（如組織樣本、手套、實驗服等）必須按照規(guī)定進行高壓滅菌處理，然后分類收集并交由專業(yè)機構(gòu)處理。

2.**設備使用規(guī)范：**

***顯微鏡：**使用前檢查光源亮度、物鏡與目鏡是否清潔。調(diào)整焦距時，應先使用低倍物鏡，并緩慢轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋和細準焦螺旋。禁止在載物臺上放置超過規(guī)定重量的物品。使用完畢后，清潔鏡身和物鏡，蓋好蓋罩。

***組織切片機：**使用前檢查刀片是否鋒利、安裝是否正確。切片時，手應遠離刀片區(qū)域。如需更換刀片，應先關(guān)閉機器，并按照操作規(guī)程進行。

***離心機：**使用前檢查轉(zhuǎn)子是否完好，是否與離心機型號匹配。加樣時確保樣品分布均勻，防止超載或轉(zhuǎn)子不平衡。啟動離心機前，務必蓋緊蓋子。運行過程中不得打開蓋子。離心結(jié)束后，待轉(zhuǎn)子完全停止后才能打開蓋子取物。

***解剖臺、電子天平：**定期清潔消毒。電子天平需保持水平，避免震動和溫度劇烈變化，使用后及時關(guān)閉。

3.**廢棄物處理：**

***化學廢液：**分類收集，如有機溶劑廢液、含重金屬廢液、含氰廢液等，不可隨意混合。交由有資質(zhì)的環(huán)保公司處理。

***生物廢液：**所有沾染組織樣本的廢棄物，包括手術(shù)器械、培養(yǎng)皿、吸管、離心管、手套、實驗服等，必須先經(jīng)過高壓滅菌（121℃，15-20分鐘）處理，然后作為醫(yī)療廢物或感染性廢物進行處置。

***組織樣本：**未使用的或廢棄的組織樣本應浸泡在10%甲醛溶液中，然后作為化學廢物處理。

**（二）應急措施**

1.**化學品泄漏：**

***酒精泄漏：**小范圍泄漏：用濕抹布或吸附棉小心擦拭干凈，確保通風。大范圍泄漏：疏散人員，關(guān)閉附近電源，嚴禁使用明火，使用防爆風機通風，必要時用