ICS11.220

CCSB41

53

云南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB53/T1064.3—2021

綠孔雀檢疫技術(shù)第3部分：羽虱實驗室檢

測技術(shù)規(guī)范

QuarantinetechniqueforPavomuticus

—Part3:Technicalspecificationsforlaboratoryexaminationofchewinglice

2021-09-30發(fā)布2021-10-14實施

云南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB53/T1064.3—2021

目??次

前言...................................................................................................................................................................III

引言.....................................................................................................................................................................Ⅴ

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.....................................................................................................................................................1

4縮略語.............................................................................................................................................................1

5原理.................................................................................................................................................................1

6試驗條件.........................................................................................................................................................2

6.1實驗室通用要求.....................................................................................................................................2

6.2人員要求.................................................................................................................................................2

7儀器設(shè)備和試劑.............................................................................................................................................2

7.1儀器設(shè)備.................................................................................................................................................2

7.2試劑.........................................................................................................................................................2

8樣品.................................................................................................................................................................2

8.1樣品采集.................................................................................................................................................2

8.2樣本保存.................................................................................................................................................3

8.3樣品運輸.................................................................................................................................................3

8.4生物安全要求.........................................................................................................................................3

9試驗步驟.........................................................................................................................................................3

9.1形態(tài)學(xué)檢查.............................................................................................................................................3

9.2PCR檢測..................................................................................................................................................3

10試驗數(shù)據(jù)處理...............................................................................................................................................4

10.1形態(tài)學(xué)結(jié)果判定...................................................................................................................................4

10.2PCR結(jié)果判定........................................................................................................................................4

附錄A（規(guī)范性）羽虱形態(tài)..........................................................................................................................5

附錄B（規(guī)范性）PCR反應(yīng)...........................................................................................................................6

I

DB53/T1064.3—2021

前??言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件是DB53/T1064《綠孔雀檢疫技術(shù)》的第3部分。DB53/T1064已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第2部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第3部分：羽虱實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；

——第4部分：消化道線蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。

本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（YNTC02）歸口。

本文件主要起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院、云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所、昆明動物園。

本文件主要起草人：鄒豐才、黃艷梅、宋海洋、朱勛程、楊建發(fā)、李杰、陳培富、蒙英雯、衡昭君、

張譽方、朱尤帥、李云喬。

III

DB53/T1064.3—2021

引言

綠孔雀（Pavomuticus）在我國僅分布于云南，是國家Ⅰ級重點保護(hù)野生動物，也是全球瀕危物種，

并已列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》。為

切實貫徹《中華人民共和國野生動物保護(hù)法》和《中華人民共和國動物防疫法》，編制并發(fā)布DB53/T1064

《綠孔雀檢疫技術(shù)》地方標(biāo)準(zhǔn)，可讓從事綠孔雀保護(hù)的相關(guān)人員按標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化程序開展綠孔雀病原

學(xué)診斷，從而采取必要的防治措施，以提高染疫綠孔雀的成活率，維護(hù)綠孔雀種群健康和地區(qū)生態(tài)平衡，

提升生物多樣性保護(hù)成效。

本文件已發(fā)布4個部分：

——第1部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽副黏病毒實驗室檢測技術(shù)的總則、儀

器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第2部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)的總則、禽

流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方

面制定了規(guī)范；

——第3部分：羽虱實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從羽虱實驗室檢測的原理、試驗條件、儀器設(shè)備

和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；

——第4部分：消化道線蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從消化道線蟲實驗室檢測技術(shù)的試驗原理、

常見線蟲形態(tài)特征、試驗條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定

了規(guī)范。

Ⅴ

DB53/T1064.3—2021

綠孔雀檢疫技術(shù)

第3部分：羽虱實驗室檢測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了綠孔雀（Pavomuticus）檢疫技術(shù)中羽虱實驗室檢測技術(shù)的原理、試驗條件、儀器設(shè)

備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理。

本文件適用于綠孔雀檢疫技術(shù)中羽虱實驗室檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

羽虱chewinglice

羽虱是主要寄生在鳥類體表和少數(shù)寄生于哺乳動物的永久性體表寄生蟲，隸屬于昆蟲綱（Insecta）、

有翅亞綱（Pterygota）、虱目（Phthiraptera）、長角羽虱科（Philopteridae）。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

BLAST：基于局部序列比對算法的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool

bp：堿基對BasePair

ddH2O：雙蒸水DoubleDistilledWater

DNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid

NCBI：美國國家生物技術(shù)信息中心NationalCenterforBiotechnologyInformation

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction

TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液TrisAcetate-EDTABuffer

5原理

根據(jù)羽虱的形態(tài)特征，采用顯微鏡鏡檢方法，判定是否有羽虱感染，對于蟲卵、若蟲、存疑蟲體及

殘破蟲體無法確定其種類，可進(jìn)行PCR鑒定。

1

DB53/T1064.3—2021

6試驗條件

6.1實驗室通用要求

實驗室滿足GB19489中生物安全實驗室的要求。

6.2人員要求

采樣和試驗人員應(yīng)具有相應(yīng)的專業(yè)知識。

7儀器設(shè)備和試劑

7.1儀器設(shè)備

7.1.1體視顯微鏡。

7.2.2載玻片、培養(yǎng)皿、離心管、樣品管。

7.2.3PCR儀。

7.2.4微量移液器：單道可調(diào)，量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～

1000μL。

7.2.5電子天平：量程0.01mg～10000mg。

7.2.6恒溫水浴鍋：36℃±1℃，65℃±1℃。

7.2.7高速離心機：轉(zhuǎn)速可達(dá)12000r/min。

7.2.8電泳系統(tǒng)。

7.2.9微波爐。

7.2.10凝膠成像系統(tǒng)。

7.2試劑

7.2.150×TAE緩沖液：Tris堿242g和57.1mL冰醋酸，用雙蒸水定容到1L。

7.2.2核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。

7.2.32×TaqPCRMix。

7.2.4引物（基于COI基因設(shè)計引物）。

7.2.5霍氏液。

7.2.6乙酸乙酯。

7.2.770%乙醇。

7.2.8商品化DNA提取試劑盒。

7.2.9DL2000DNAMarker。

7.2.10瓊脂糖。1.5%瓊脂糖凝膠：1.5g瓊脂糖與100mL1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，加入10μL

核酸染料，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。

8樣品

8.1樣品采集

2

DB53/T1064.3—2021

在體表皮膚、毛根、羽毛處找到淡黃色或暗灰色的虱體或蟲卵，收集放入樣品管中，做好記錄。剛

死亡綠孔雀可將其放入有乙酸乙酯的密閉容器中，熏蒸5min后，用手逆向撥動羽毛，羽虱掉落,將羽虱

收集放入樣品管。

8.2樣本保存

將羽虱樣本保存于70%乙醇內(nèi)，擰緊蓋子后上下?lián)u晃使虱體充分浸泡在70%乙醇中，并檢查是否有液

體滲漏。低溫或置于4℃冰箱儲存。

8.3樣品運輸

樣品采集完成后運輸?shù)綄嶒炇疫M(jìn)行檢測。70%的乙醇屬于危險化學(xué)品，運輸過程中要確保容器不泄

漏、不損壞。不應(yīng)與酸類、易燃物、自燃物品等并車混運。

8.4生物安全要求

樣品采集及試驗過程中做好自身防護(hù)，同時注意對綠孔雀的生活環(huán)境進(jìn)行清掃、環(huán)境消毒。生物安

全要求按照GB/T27401的規(guī)定進(jìn)行。

9試驗步驟

9.1形態(tài)學(xué)檢查

9.1.1直接觀察法

按下列區(qū)域順序?qū)G孔雀進(jìn)行檢查：翅(下側(cè))、腹側(cè)、腹部、臀部(下側(cè))、胸部、翅(上側(cè))、背部、

臀部(上側(cè))、頸部、頭部。觀察是否有羽虱。

9.1.2顯微鏡檢查

將樣品管內(nèi)保存的羽虱放在透明培養(yǎng)皿或載玻片上，用清水清洗干凈蟲體，滴加霍氏液固定，蓋上

蓋玻片。對比附錄A中的圖A.1，用體視顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

9.2PCR檢測

9.2.1樣品DNA提取與保存

將8.1收集的羽虱樣品用商品化DNA提取試劑盒進(jìn)行試驗。DNA提取具體操作步驟按照試劑盒說明書

進(jìn)行，將提好的DNA保存于4℃冰箱中。

9.2.2PCR擴增

9.2.2.1PCR擴增引物

PCR擴增引物見附錄B中的B.1。

9.2.2.2PCR擴增體系

PCR擴增體系見附錄B中的B.2。

9.2.2.3PCR擴增程序

3

DB53/T1064.3—2021

樣品DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴增的反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min，95℃變性1min，50℃退火

45s，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。

9.2.3PCR產(chǎn)物檢測

PCR擴增完成后，取PCR產(chǎn)物5μL，加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳孔中，以DL2000DNAMarker作為參

照，110V電壓電泳30min后，將凝膠置于紫外凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行觀察拍照，若出現(xiàn)預(yù)期的475bp

左右的條帶，擴增條帶進(jìn)行測序后驗證。

10試驗數(shù)據(jù)處理

10.1形態(tài)學(xué)結(jié)果判定

羽虱體型較小，長0.5mm～10mm，頭部形狀多變，類似于三角形或卵圓形，頭端的寬度大于胸部，

觸角一對，口器位于頭腹面，咀嚼式。胸部三節(jié)，無翅，三對足分別位于前、中、后胸。腹部圓形至長

卵圓形，體型寬短或細(xì)長，呈淡黃色或灰色。

用顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)形態(tài)符合附錄A中圖A.1羽虱形態(tài)特征，則鑒定為綠孔雀羽虱。

10.2PCR結(jié)果判定

將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBIGenBank中的序列進(jìn)行BLAST在線比對，與羽虱相應(yīng)序列匹配率不小

于90%時即可判定綠孔雀羽虱感染陽性。

4

DB53/T1064.3—2021

附錄A

（規(guī)范性）

羽虱形態(tài)

體視顯微鏡下羽虱形態(tài)如圖A.1所示。

圖A.1羽虱鏡檢圖（×40）

5

DB53/T1064.3—2021

附錄B

（規(guī)范性）

PCR反應(yīng)

B.1PCR擴增引物序列

根據(jù)COI基因設(shè)計PCR擴增引物，引物序列如下表B.1所示。