第三章基因工程

第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具

一、基因工程的概念:基因工程是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù),賦予生物新的遺傳特性,

創(chuàng)造出更符合人們需要的新的牛.物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子

水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的,因此又叫重組DNA技術(shù)。（P67）

（1）原理：重組DNA技術(shù)。（2）操作對(duì)象：基因。（3）操作場(chǎng)所：生物體外。（4）操作水平：金壬

水平。（5）操作結(jié)果：賦予生物新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。

二、DNA重組技術(shù)的基本工具

1.限制性內(nèi)切核酸酶（又稱限制酶）一“分子手術(shù)刀”（P71）

土燮東源

原核生物

把婁一分離的限制稀有數(shù)T-種

特點(diǎn)識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核件酸序列.

（專一性）’使每一條鏈中特定部位的磷酸二隔鍵

限斷開(kāi)

制

一作用一斷開(kāi)兩個(gè)核件酸之間的磷松二侑鍵

麗

切割位置：識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)

EcoRI

S'GAATTC3'GAATTC

（在G與

親疝r(nóng)

A之間3'CTTAAG5CTTAAG

結(jié)梟切制）中軸線

切割位置：識(shí)別序列的中心軸線處

SmaI

平一（在GqGGG3/CCCGGG

C之間

CCC5rGGGCCC

切割）

中軸線

限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？（P71思考）切割外源DNA、使之失效，以保證自身安

金。限制酶為什么不會(huì)切割自身的DNA?原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已被修飾。

2.DNA連接酶一“分子縫合針”

作用將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制

醉切開(kāi)的磷酸二酯鍵

DNA

連—來(lái)源■大防桿菌

?人WTI

接E.coliDNA

連接酹功能r“緋，、”打Z卜句;上上1

酶由！

來(lái)源，T.1噬菌體

■一*慳m吠

T4DNA

連接的啞一“縫合”互補(bǔ)的黏性末端

和平末端

T4DNA連接酶連接黏性末端和平末端的效率一樣嗎？（P72）不一樣，連接平末端的效率相對(duì)較低。

比較DNA連接酶與DNA聚合酶

DNA連接酶DNA聚合酶

比較

催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二催化單個(gè)核昔酸加到已有核甘酸片段的

作用實(shí)質(zhì)

能鍵。工'末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵。

催化具TT互補(bǔ)黏性末端或平末端的

催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈，形成

作用結(jié)果DNA片段連接起來(lái)，形成重組DNA分

新的雙鏈DNA分子。

壬。

模板不需要模板需要模板

1

3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的栽休一一“分子運(yùn)愉車”（P72）

枇婁質(zhì)粒（常用載體）：環(huán)狀雙鏈DNA分子

噬菌體、動(dòng)植物病毒等

行一個(gè)至多個(gè)限制版切割位點(diǎn)

攜耐源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)

載特點(diǎn)胞后,能在細(xì)胞中進(jìn)行門我復(fù)制,或整

體

合到受體DNA上,隨受體DNA同步復(fù)制

常有特殊的標(biāo)記基因,便于重組DNA

分子的篩選

竹用攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞

質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，獨(dú)立于真核細(xì)胞（如酵母菌）的細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA

之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DKA分子。（P72）

在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的,這些質(zhì)粒上

常有特殊的標(biāo)記基因,如四環(huán)素抗性基因、氨有青霉素抗性基因等,便于重組DNA分子的篩選。

四、DNA的粗提取與鑒定

1.DNA的提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在的差異,選用適當(dāng)

的物理或化學(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。

2.DNA的提取原理：

（1）DNA不溶于酒精,蛋白質(zhì)溶于酒精,利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。（P74）

（2）DMA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（P74）

3.DNA的鑒定原理：在一定溫度下（沸水浴），DNA遇二苯胺試前會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色,因此二苯胺試劑可以作

為鑒定DNA的試劑。（P74）

4.選材應(yīng)選擇DNA含量相對(duì)較高的生物組織。

5.選材不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞。原因:哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒(méi)TT細(xì)胞核和線粒體，幾乎

不含DNA。

6.實(shí)驗(yàn)步驟

取材、研磨］

在漏斗中墊上紗布,將研磨液過(guò)

注到燒杯中,在4霓冰箱中放置

去除灌液中

幾分鐘后（或直接將研磨液倒入

雜質(zhì)

塑料離心管中,離心5min）,再

取匕清液

在上清液中加入等體積的、預(yù)冷

的體枳分?jǐn)?shù)為也的酒梢溶液.

靜置2~3min.用玻璃棒沿一個(gè)

DNA的析出J方向攪拌.卷起絲狀物.用濾紙

吸去上面的水分（或?qū)⑷芤旱谷?/p>

塑料離心管中,離心5min.棄上清

液，將管底的沉淀物晾干）

將絲狀物或沉淀物用2mol/L的

NaCl溶液溶解，然后加入二苯

DNA的鑒定

胺試劑，混勻后置于沸水中加

熱5min.冷卻后觀察顏色變化

2

思考：

1.如果選用雞血細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如何快速破碎細(xì)胞？將雞血細(xì)胞置于蒸鐲水中，待細(xì)胞漲破后，收集

濾液。

2.思考：有時(shí)還會(huì)反復(fù)利用不同濃度的NaCl溶液來(lái)溶解、析出DNA,試猜想該操作的目的？（P75）

進(jìn)一步純化DNA——用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽溶液

使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA,就能夠除去與DNA

溶解度不同的多種雜質(zhì)。

第二節(jié)基因工程的基本操作程序

L基因工程的基本操作程序：

（1）目的基因的篩選與獲取;⑵基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）:（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；（4）目

的基因的檢測(cè)與鑒定。（P76）

一、目的基因的篩選與獲取

1.目的基因的概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基

因。（P76）根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因或者有一定調(diào)控作用的

基因

2.篩選合適的目的基因較為有效的方法：從相關(guān)的已知結(jié)陶和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。認(rèn)識(shí)基

因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：DNA測(cè)序技術(shù)、遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）.序列比對(duì)工具（如BLAST）

等

3.獲取日的基囚的方法：PCR擴(kuò)增（P82）

P概念：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫,它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理,在體外提供參與DNA

復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)方的基因的核昔酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。（P77）

（1）全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。（2）原理：DNA半保留復(fù)制。（3）操作環(huán)境：體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR

R）o（4）目的：對(duì)目的基因的核昔酸序列進(jìn)行大量復(fù)制。（5）優(yōu)點(diǎn):可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的

基因。PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明,并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。（P77）

條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、四種脫氧核甘酸、耐高溫的DNA聚合酶。（P77）

過(guò)程：（1）變性：溫度上升到90℃以上，目的基因DNA受熱變性后解為單鏈。該過(guò)程中打開(kāi)的化學(xué)

鍵是氫鍵。（P78）（2）復(fù)性：溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA

結(jié)合。該過(guò)程堿基⑶延伸：溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中四種脫氧核什酸在耐島溫的DNA聚合

醒的作用下加到引物的3二端合成子鏈。（P78）（4）重復(fù)循環(huán)多次。

結(jié)果：呈指數(shù)形式擴(kuò)增（n次擴(kuò)增循環(huán)后，DNA數(shù)量約為2"）。為什么呈指數(shù)形式擴(kuò)增？一個(gè)循環(huán)得

到的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后E的基因的量可以增加一倍。

注意點(diǎn)

1.DNA體內(nèi)復(fù)制解旋條件為解旋晦,PCR解旋條件為90℃以上高溫;

2.DNA體內(nèi)復(fù)制合成DNA子鏈需要DNA聚合酶催化,PCR合成DNA子鏈需要耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA

聚合酶）催化。

3.PCR的擴(kuò)增緩沖液中一般含有Y『作用為激活DNA聚合酶。（P77相關(guān)信息）

4.PCR中復(fù)制的原料實(shí)際為dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）除作為原料，還可以水解產(chǎn)生能量為合

成DNA子鏈提供能量。因此，PCR反應(yīng)體系中不需要添加ATP。

5.引物是一小段能DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。

（1）設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是：目的基因兩端的核昔酸序列。

（2）引物設(shè)計(jì)時(shí)既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因是：為/便于擴(kuò)增的DNA片段與

表達(dá)載體連接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位點(diǎn)。

（3）使用的一對(duì)引物的序列相同嗎？不相同，目的基因兩端具有不同的核昔酸序列。兩種引物才能

確保DNA的兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增

（4）引物設(shè)計(jì)的要求（或引物失效的原因）a.每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)。b.兩種引

物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。

3

（5）每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)的原因：防上引物自身折疊.

（6）兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的原因：防止引物之間配對(duì)，導(dǎo)致弓物不能同模板

鏈結(jié)合O

益二|物長(zhǎng)度一般為絆組個(gè)核甘酸，若引物長(zhǎng)度過(guò)短，則引物與模板鏈結(jié)合的特異性較差。

引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開(kāi)始連接脫氧核昔酸。（P77）

為什么需要引物？DNA復(fù)制不能從頭開(kāi)始，DNA聚合酶只能從引物的合端延伸DNA鏈.（DNA聚合酶只

能催化單個(gè)核甘酸加到已有核巖酸片段的3'端的羥基上）

6.兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的3二端，脫氧核甘酸連接在引物的3二端進(jìn)行延伸。

7.DNA新鏈延伸的方向?yàn)閺?'端向3'端延伸。（P78圖）

8.PCR的產(chǎn)物通常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。（P79）

9.用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎?mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。

10.PCR與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較：

PCR技術(shù)DNA復(fù)制

相原則堿基互補(bǔ)配對(duì)

問(wèn)

條件DNA母鏈作為模板、引物、4種脫氧核甘酸為原料（實(shí)為dNTP）

點(diǎn)

延伸方向新鏈都是從5'端向3'端延伸

解旋方式90℃以上高溫解旋解旋酶催化

場(chǎng)所體外-PCR擴(kuò)增儀（PCR儀）體內(nèi)-主要在細(xì)胞核

不

同延伸用酶耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶

點(diǎn)

溫度控制溫度，需要在不同溫度下進(jìn)行（90C體內(nèi)溫和條件

以上變性、50c左右復(fù)性、72c左右延伸）

過(guò)程3III1

’,,,5-變性、品性、延伸備:邊學(xué)旋.邊復(fù)制（石岡崎片段）

,-------------LHL

5y

結(jié)果大量的DMA片段（目的基因）形成完整的子代DNA

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1.地位：基因表達(dá)載體的構(gòu)建這一步是基因工程的核心工作。（P80）

2.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：⑴使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代。（2）

使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。3.基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體必須包括且的基因、標(biāo)記基

因、啟動(dòng)子、終止子等（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有復(fù)制原點(diǎn)）。

后/位置：目的基因的上游

廬二0\現(xiàn)］功能/幽魂金盤識(shí)別和結(jié)合的部位，

Ut驅(qū)動(dòng)基面電皿

u表達(dá)載體IX目的基因:人們所需要的塞因

K弋終止力子位｛置功能：終目止的轉(zhuǎn)基錄因的工避

、標(biāo)記基因：用于目的基因的檢測(cè)與篩選

4.啟動(dòng)子：（P80）（1）本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。（2）位置：位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)

錄的起始位點(diǎn)。（3）功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。（4）特殊類型：誘

導(dǎo)型啟動(dòng)子。（5）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。

4

5.終止子：（1）木質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的咽_片段.（2）位置：位于基因的下游。（3）功能：使

轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。

6.標(biāo)記基因（1）作用：便于重組DNA分子的篩選。（2）常見(jiàn)類型抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等

7.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：首先用一定的限制醛切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口；然后用同種限制

酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段（使之產(chǎn)生平末端或相同的黏性末端）;再利

用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處。這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子。（P80）

8.切割載體和切割含有目的基因的DNA片段的限制前為什么應(yīng)為同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限

制酶？產(chǎn)生相同的黏性的端或平末端，以便通過(guò)DNA連接酶連接。

9.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA,再用DNA連接酶處理后，一定會(huì)形成重組DNA分

子嗎？不?定，載體和目的基因都可能出現(xiàn)自身環(huán)化。

10.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA,再用DNA連接酶處理后，可能有幾種產(chǎn)物？自

連（目的基因自身環(huán)化、載體自身環(huán)化）兩兩連接（目的基因與目的基因連接、載體目載體連接、H

的基因與載體連接）。

11.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA,再用DNA連接酶處理后，形成的“載體-目的基

因”產(chǎn)物一定符合要求嗎？

不一定，目的基因可能反向連接到質(zhì)粒上。

12.如何避免上述問(wèn)題？同時(shí)用兩種限制陶切割含目的基因的DNA片段和載體。

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1.日的基囚導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法

生物種類植物動(dòng)物微生物

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通

常用方法顯微注射法5M處理法

道法

受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞

將FI的基因插入Ti質(zhì)粒的

將含有目的基因的表達(dá)載Ca2+處理細(xì)胞一細(xì)胞處J--

T-DNA中一農(nóng)桿菌一導(dǎo)

體提純f取卵（受精卵）一一種能吸收周圍環(huán)境中

轉(zhuǎn)化過(guò)程入植物細(xì)胞一整合到受體

顯微注射一受精卵發(fā)育一DNA分子的生理狀態(tài)一基

細(xì)胞的染色體DNA±-

獲得具有新性狀的動(dòng)物因表達(dá)載體導(dǎo)入

表達(dá)

（1）目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（P80）

①花粉管通道法

用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入壬房中。

在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道進(jìn)

入胚囊。

花粉管通道法的受體細(xì)胞：受精卵。

花粉管通道法的地位：我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)（將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞）。

②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（P81資料卡）

將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中一農(nóng)桿菌一導(dǎo)入植物細(xì)胞一整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上一表達(dá)

農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力;

農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒,當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到

被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。（P81）

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的實(shí)驗(yàn)思路（過(guò)程）：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中,通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用,就

5

可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，（P81）并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定

和表達(dá)。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的兩種具體操作

a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片（即處植隹）與農(nóng)砰菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞,并再生

成植株;受體細(xì)胞為體細(xì)胞。

b.可以將花序直接遜在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子,再進(jìn)行篩選、鑒

定等；受體細(xì)胞為受精卵。

（2）目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞

受體細(xì)胞為受精卵.為什么選擇該細(xì)胞?受精卵容易表現(xiàn)出全能性。（P82）

①常用方法；顯微注射法。

②將目的基因?qū)胧芫押?，還要經(jīng)過(guò)早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植才能夠獲得具有新性狀的動(dòng)物。

③獲得的動(dòng)物具有新性狀是因?yàn)楫a(chǎn)生了新基因嗎？不是。

（3）目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞時(shí)，常用原核生物作為受體細(xì)胞,其中以大腸桿菌最廣泛。（P82）

①Cd?'處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）的一般過(guò)程：先用Q處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周

圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),然后將基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。

②原核生物的優(yōu)點(diǎn)（為什么選擇原核生物作為受體細(xì)胞）。繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易

于培養(yǎng)。

③溫的作用:增加細(xì)胞壁的通透性（有的也說(shuō)是細(xì)胞膜）。

④什么是感受態(tài)：一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。

⑤思考：當(dāng)真核生物的基因以原核生物作為受體細(xì)胞時(shí)：

若無(wú)法獲得該蛋白，原因可能是什么？真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒(méi)有真核生物所具有的切

除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，因此無(wú)法

表達(dá)出該蛋白。

以上情況如何解決？使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞。

若可以獲得該蛋白，但是蛋白質(zhì)無(wú)活性，原因可能是？原核牛.物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無(wú)

法對(duì)真核生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的加工。

以上情況如何解決？人匚體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞

二、E的基因的檢測(cè)與鑒定

分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)

水平的鑒定

個(gè)體生物學(xué)水平鑒定的內(nèi)容：表達(dá)產(chǎn)物是否具有生物學(xué)活性（個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀）。

轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志

抗蟲(chóng)植物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡

抗病毒（菌）植物病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未侵染上病斑

抗鹽植物鹽水澆灌正常生長(zhǎng)

抗除草劑植物噴灑除草劑正常生長(zhǎng)

獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比功能、活性正常

物牧

6

探究：DNA片段擴(kuò)增及電泳鑒定(P84)

1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段才增的原理

(1)PCR利用了DNA的熱變性原理,通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合,PCR儀實(shí)質(zhì)上就是

一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。

(2)PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。

(3)一次PCR一般要經(jīng)歷組次循環(huán)。

2.DNA熱變性的難易程度跟DNA分子中具有三個(gè)氫鍵的GC堿基對(duì)的比例有關(guān)，該比例越高，DNA熱穩(wěn)

定性越高，越避熱變性。

3.過(guò)程

「?用微量移液器按照配方或PCR試劑盒的

〔楚曾說(shuō)明書,向微量離心管中依次加入各組分

磁卜蓋嚴(yán)離心管的蓋子

金、將微質(zhì)離心管放在離心機(jī)里，離心約10S,

少?gòu)V使反應(yīng)液集中在管的底部

「廠口設(shè)餐好PCR儀的循環(huán)程序?將裝有反應(yīng)液

回㈣的微量離心管放在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)

4.DNA片段電泳鑒定的原理：(P84)

(1)DNA分子具有可解離的基團(tuán),在一定的迎下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷,在電場(chǎng)的作

用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng),這個(gè)過(guò)程就是電泳。

(2)PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。

(3)在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象(遷移速率與之呈負(fù)相關(guān))

等有關(guān)；

(4)凝膠中的DNA分子通過(guò)染色,可以在波長(zhǎng)為300noi的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái).

5.成功擴(kuò)增出DNA片段的判斷依據(jù)是什么？可以在紫外燈下亙接觀察到DNA條帶(根據(jù)條帶的分布及

粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果)。

第三節(jié)基因工程的應(yīng)用

一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用

7

抗蟲(chóng)植物：從某此牛物中分離出

-具有抗蟲(chóng)功能的基因,將它導(dǎo)入作

物中培育出的具有抗蟲(chóng)性的作物

抗病植物：將來(lái)源于某些病毒、真菌

培養(yǎng)抗性

等的抗病聯(lián)因?qū)胫参镏信嘤鲛D(zhuǎn)

植物

基因抗病植物

抗除草劑植物：將降解或抵抗某

L種除草劑的基因?qū)胫参锱嘤隹?/p>

除草劑的作物品種

將某種必需基基酸含量多的趣自

質(zhì)編碼基因?qū)胫参镏?可以提

農(nóng)

牧“、心.高這種亞基酸的含量

改良植物

業(yè)

方的品質(zhì)將與植物花青素代謝相關(guān)的基

［導(dǎo)入矮牽牛中，使它呈現(xiàn)出自然w

面

界沒(méi)有的顏色變異,大大提高了

它的觀賞價(jià)值

1

?料警如導(dǎo)入外源生長(zhǎng)激素基因

生長(zhǎng)速率--------------

將腸乳糖醐基因?qū)肽放；蚪M.

改善畜產(chǎn)使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的第世中，

品的品質(zhì)乳糖的含玨大大降低，而其他營(yíng)

於成分不受影響

二、基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用

微生物回濁對(duì)微生物或動(dòng)植物的細(xì)胞進(jìn)行

植物的細(xì)胞基因改造.使它們能夠生產(chǎn)藥物

，生產(chǎn)科學(xué)家將藥用蛋向基因與乳腥

藥物中特異表達(dá)的基因的一動(dòng)子等

，

醫(yī)哺乳動(dòng)物批調(diào)控元件幣:組在一起，通過(guò)顯

藥■生產(chǎn)藥物微注射的方法導(dǎo)入喃乳動(dòng)物的

居

受精卵中，制成乳腺生物反應(yīng)

領(lǐng)

器或乳房生物反應(yīng)器

域

在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)

因子，以抑制抗原決定基因的表達(dá)，或

前言昔?設(shè)法除去抗原決定施因.然后再結(jié)合

'克隆技術(shù),培育出不會(huì)引起免疫排斥

反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆器官

1.常見(jiàn)的基因工程藥物類型：細(xì)胞因的、抗體、疫苗和激素等。（P90）

2.實(shí)例：重組人干擾素、血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子等基因工程藥物。

思考：（1）干擾素的化學(xué)本質(zhì)是葉么？融蛋白.（P90資料卡）

（2）干擾素的作用機(jī)理是怎樣的？干擾病毒復(fù)制。（P90資料卡）

（3）干擾素用于哪些疾病的治療？病毒感染性疾病、乳腺癌、淋已癌、多發(fā)骨髓瘤和某些白血病等。

（4）芍統(tǒng)生產(chǎn)干擾素的方法是什么？（P90資料卡）從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取。

（5）目前大量生產(chǎn)干擾素的方法是什么？（P90資料卡）月基因工程方法從大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞

內(nèi)獲得。

（6）我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)的第一個(gè)基因工程藥物的名稱叫什么？重組人干擾素aTb用于治療哪些疾病?

主要用于治療慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等。

3.讓轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物批量生產(chǎn)藥物實(shí)例：乳腺（房）生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗凝血酶、血清白蛋白、生長(zhǎng)素

和a-抗胰蛋白等重要醫(yī)藥產(chǎn)品0

8

4.技術(shù)方法

（1）對(duì)微生物或動(dòng)植物的細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使它們能夠生產(chǎn)藥物。（P90）

（2）利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物：將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子等調(diào)控元件

重組在一起，通過(guò)顯微注射導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中,胚胎移植前應(yīng)做DNA分析，鑒定性別，保留雌

tto轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)入泌乳期后，可以通過(guò)分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥物。

思考：（1）乳腺生物反應(yīng)器經(jīng)過(guò)有性生殖產(chǎn)生的后代一定可以產(chǎn)生目標(biāo)蛋白嗎？丕二定；

①目的基因在受體細(xì)胞中不是成對(duì)存在的，相當(dāng)于雜合了，配了中可能不含該基因，則有性生殖產(chǎn)生

的后代中可能不含目的基因。

②有性生殖產(chǎn)生的后代可能為雄性，不能分泌乳汁。

（2）乳腺生物反應(yīng)器指的是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺嗎？不是，乳腺生物反應(yīng)器指的就是這個(gè)轉(zhuǎn)基因生物。

（3）為什么將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子等調(diào)控元件重組在一起？讓藥用蛋白

基因只在乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)。

（4）藥用蛋白基因存在于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的哪些細(xì)胞中？幾乎所有細(xì)胞。

（5）生物反應(yīng)器除了用乳腺，還可以用什么器官？膀胱。

（6）膀胱生物反應(yīng)器哪些方面優(yōu)于乳腺生物反應(yīng)器？不局限于性別與生長(zhǎng)期（乳腺生物反應(yīng)器必須

是雌性，且泌乳期才會(huì)分泌）。

（7）研制膀胱生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)如何處理目的基因？將目的基因與膀胱上皮細(xì)胞中特異表達(dá)的基因

的啟動(dòng)子重組。

（8）用生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn)？產(chǎn)物容易提取。

比較項(xiàng)目乳腺（房）生物反應(yīng)器基因工程菌生產(chǎn)藥物

基因結(jié)構(gòu)哺乳動(dòng)物基因的結(jié)構(gòu)與人類結(jié)構(gòu)細(xì)菌或酵母菌等生物的基因結(jié)構(gòu)與人類基因

基本相同結(jié)構(gòu)有較大差異

基因產(chǎn)物與天然蛋白質(zhì)完全相同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)缺少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，

合成的蛋白質(zhì)可能不具有生物活性

受體細(xì)胞哺乳動(dòng)物的受精卵微生物細(xì)胞

目的基因?qū)敕斤@微注射法顯微注射法

式

生產(chǎn)條件不需要嚴(yán)格的滅菌，溫度等外界需嚴(yán)格滅菌，嚴(yán)格控制工程菌所需的溫度、pH、

條件對(duì)其影響不大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等外界條件

產(chǎn)物提取從動(dòng)物乳汁中提取，相對(duì)簡(jiǎn)單（一般經(jīng)過(guò)工業(yè)發(fā)酵后）從微生物細(xì)胞（或發(fā)

酵液）中提取，相對(duì)復(fù)雜

基因工程在食品工業(yè)方面的板用

利用基因「?程菌生產(chǎn)食品「.業(yè)用前、氨基

食酸和維生素等

品

工科學(xué)家將編碼牛凝乳髀的基因?qū)氪竽c

業(yè)桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中,再通

方過(guò)工業(yè)發(fā)醉批H生產(chǎn)凝乳醐

面

加工轉(zhuǎn)化糖漿需要的淀粉穆?加工烘烤食

匚品要用到的脂肪酶等也都可以通過(guò)構(gòu)建基

因匚程菌,然后用發(fā)醉技術(shù)大盤生產(chǎn)

第四節(jié)蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用

一、蛋白質(zhì)工程

9

一、蛋白質(zhì)工程的基木原理

蛋白質(zhì)工程思路(蛋白質(zhì)工程與天然蛋白質(zhì)合成的過(guò)程相反)：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)f設(shè)計(jì)預(yù)期

的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)f推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列f找到并改變相對(duì)應(yīng)的脫氧核甘酸序列或合成新基因f獲得

所需要的蛋白質(zhì)(包括目的基因轉(zhuǎn)錄成,然后翻建獲得氨基酸序列(多肽鏈)，再通過(guò)盤曲折疊獲得

高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而行使預(yù)期功能)。(P94)

三.蛋白質(zhì)工程與基因工程比較

項(xiàng)目蛋白質(zhì)工程基因工程

從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)一設(shè)計(jì)預(yù)期的

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一推測(cè)應(yīng)有的朝基酸序列一目的基因的篩選與獲取一基因表達(dá)載

過(guò)程找到并改變相對(duì)應(yīng)的脫氧核昔酸序列體的構(gòu)建一將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

(基因)或合成新的基因f獲得所需要的f目的基因的檢測(cè)與鑒定

蛋白質(zhì)

定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類

實(shí)質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類所需要的蛋白質(zhì)

所需的生物類型或生物產(chǎn)品

結(jié)果可生產(chǎn)自然界中不存在的蛋白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界中已存在的蛋白質(zhì)

聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)一上，延伸出來(lái)的第二代基因工程

5.判斷是基因工程還是蛋白質(zhì)工程的依據(jù)：是否改造或因成基因，得白的蛋白質(zhì)是否為天然蛋白質(zhì)。

補(bǔ)充：基因的定點(diǎn)突變技術(shù)1一一重疊PCR

引物a引物C

XXXXXX

PCR1引物b

PCR2

產(chǎn)物AB

產(chǎn)物CD

①

AB上鏈

CD下鏈

_______________畛突變位點(diǎn)、

突變衣物AD