2025年臨床基因擴增試題及答案一、單項選擇題（每題1分，共30分。每題只有一個最佳答案，請將正確選項字母填入括號內(nèi)）1.在實時熒光定量PCR中，用于校正不同反應孔間熒光強度差異的常用內(nèi)參染料是（）A.SYBRGreenIB.ROXC.FAMD.HEX答案：B解析：ROX為被動內(nèi)參染料，不參與擴增，僅用于校正孔間熒光波動。2.下列哪項不是臨床PCR實驗室“三區(qū)兩緩”布局中的“三區(qū)”之一（）A.試劑儲存與準備區(qū)B.標本制備區(qū)C.擴增與產(chǎn)物分析區(qū)D.辦公休息區(qū)答案：D解析：辦公休息區(qū)屬于輔助區(qū)域，不在核心三區(qū)之列。3.關(guān)于UNG酶防污染體系，下列說法正確的是（）A.可水解含dUTP的RNA產(chǎn)物B.需在95℃滅活5min以上C.對天然DNA模板無影響D.必須在擴增前加入逆轉(zhuǎn)錄酶答案：C解析：UNG僅水解含U的DNA，對天然含T的DNA無作用。4.在ARMS-PCR檢測EGFRT790M突變時，引物3′端最末位堿基設(shè)計為（）A.AB.TC.CD.G答案：C解析：突變位點C與T790M的T→G突變配對，可特異性延伸。5.數(shù)字PCR中，計算拷貝數(shù)時不需要的參數(shù)是（）A.微滴總數(shù)B.陽性微滴數(shù)C.擴增效率D.泊松分布校正答案：C解析：數(shù)字PCR為終點檢測，無需擴增效率參數(shù)。6.下列哪種質(zhì)控品最適合監(jiān)測核酸提取全過程（）A.弱陽性血清B.含內(nèi)參的假病毒C.擴增產(chǎn)物稀釋液D.無模板對照答案：B解析：假病毒顆粒可模擬真實樣本經(jīng)歷提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增全過程。7.在CFTR基因ΔF508突變檢測中，引物跨越外顯子邊界的主要目的是（）A.提高Tm值B.避免基因組DNA擴增C.降低二聚體D.增加擴增長度答案：B解析：跨外顯子設(shè)計可確保僅擴增cDNA，排除gDNA干擾。8.關(guān)于qPCR標準曲線，下列哪項錯誤（）A.斜率反映擴增效率B.R2≥0.99表示線性良好C.截距代表初始模板量D.效率90–110%為可接受范圍答案：C解析：截距對應Ct值與Log濃度關(guān)系，不直接等于模板量。9.下列哪項不是逆轉(zhuǎn)錄酶常見突變改造方向（）A.降低RNaseH活性B.提高熱穩(wěn)定性C.增加3′→5′外切酶活性D.提高持續(xù)合成能力答案：C解析：逆轉(zhuǎn)錄酶無3′→5′外切校正活性，該改造方向不存在。10.在HBVDNA定量檢測中，采用內(nèi)標法的主要優(yōu)勢是（）A.降低試劑成本B.消除樣本抑制物干擾C.縮短擴增時間D.提高熒光強度答案：B解析：內(nèi)標與靶序列共提取共擴增，可識別抑制導致的假陰性。11.下列哪種熒光探針無需淬滅基團（）A.TaqManB.MolecularBeaconC.ScorpionD.Sunrise答案：D解析：Sunrise引物自淬滅，探針本身不含額外淬滅基團。12.在多重PCR中，引物二聚體最可靠的判斷方法是（）A.瓊脂糖凝膠電泳B.熔解曲線C.高分辨溶解曲線D.毛細管電泳答案：C解析：HRM可區(qū)分1℃差異，準確識別非特異產(chǎn)物。13.關(guān)于CRISPR-basedSARS-CoV-2檢測，下列哪項正確（）A.必須依賴T7轉(zhuǎn)錄B.靈敏度低于qPCRC.可用LFD讀取結(jié)果D.不能實現(xiàn)定量答案：C解析：Cas12a切割后釋放單鏈DNA報告分子，可在試紙條顯色。14.在NGS建庫中，磁珠法純化PCR產(chǎn)物的最佳比例是（）A.0.5×B.0.8×C.1.0×D.1.2×答案：B解析：0.8×可去除引物二聚體同時保留>200bp目標片段。15.下列哪項不是臨床PCR報告必須包含的內(nèi)容（）A.檢測方法B.靶基因名稱C.擴增儀型號D.結(jié)果解釋與參考范圍答案：C解析：儀器型號屬內(nèi)部記錄，無需寫入患者報告。16.在HPVE6/E7mRNA檢測中，采用NASBA技術(shù)的核心酶是（）A.BstDNA聚合酶B.T7RNA聚合酶C.AMV逆轉(zhuǎn)錄酶D.以上均需答案：D解析：NASBA需逆轉(zhuǎn)錄酶、T7聚合酶及RNaseH協(xié)同。17.關(guān)于微滴式數(shù)字PCR的“合并誤差”，正確的處理策略是（）A.增加微滴體積B.降低模板濃度C.使用泊松校正D.提高循環(huán)數(shù)答案：C解析：高濃度下多模板微滴需泊松公式修正。18.在白血病BCR-ABL1檢測中，國際標準化的IS值計算需要（）A.內(nèi)參基因ABL1拷貝數(shù)B.質(zhì)粒標準品C.國際參考品轉(zhuǎn)換系數(shù)D.以上全部答案：D解析：IS值需參考品、轉(zhuǎn)換系數(shù)及內(nèi)參共同計算。19.下列哪項不是熒光定量PCR“基線期”特征（）A.熒光信號呈指數(shù)增長B.背景熒光波動小C.Ct值計算起點D.通常設(shè)為3–15循環(huán)答案：A解析：指數(shù)增長為對數(shù)期特征，基線期熒光無顯著增長。20.在HCVRNA定量檢測中，采用一步法逆轉(zhuǎn)錄-qPCR的主要優(yōu)勢是（）A.減少開蓋污染B.提高逆轉(zhuǎn)錄效率C.降低探針成本D.增加熔解曲線功能答案：A解析：一步法將RT與PCR同管完成，減少轉(zhuǎn)移步驟。21.下列哪種突變檢測技術(shù)不依賴PCR擴增（）A.Sanger測序B.ARMS-PCRC.HRMD.CRISPR-Cas12a答案：D解析：Cas12a可直接識別靶序列并切割報告分子，無需預擴增。22.在PCR反應體系中，K?的最適濃度范圍是（）A.10–20mmol/LB.30–60mmol/LC.70–100mmol/LD.120–150mmol/L答案：B解析：K?30–60mmol/L可穩(wěn)定引物模板復合物。23.關(guān)于TaqManMGB探針，下列說法錯誤的是（）A.3′端含MGB基團B.可縮短探針長度C.提高Tm值D.5′端標記ROX答案：D解析：MGB探針5′端標記FAM/VIC，ROX為內(nèi)參染料。24.在PCR實驗室生物安全要求中，BSL-2適用于（）A.結(jié)核分枝桿菌DNA檢測B.腸道病毒RNA檢測C.瘧原蟲DNA檢測D.以上全部答案：D解析：上述病原體均屬于BSL-2級風險。25.下列哪項不是qPCRCt值的影響因素（）A.引物二聚體B.模板降解C.探針濃度D.報告基因長度答案：D解析：報告基因長度不影響Ct，僅影響最終熒光強度。26.在多重PCR中，平衡各靶點擴增效率的最佳策略是（）A.統(tǒng)一引物長度B.調(diào)整引物濃度C.降低退火溫度D.增加Mg2?濃度答案：B解析：通過濃度梯度優(yōu)化可補償效率差異。27.關(guān)于環(huán)介導等溫擴增（LAMP），下列哪項正確（）A.需4條引物B.擴增產(chǎn)物為單鏈C.依賴Bst酶鏈置換活性D.需溫度循環(huán)答案：C解析：LAMP依賴Bst酶在65℃恒溫完成鏈置換。28.在PCR污染監(jiān)測中，“陰性對照”出現(xiàn)弱陽性條帶，最可能原因是（）A.引物降解B.模板濃度過高C.氣溶膠污染D.dNTP失效答案：C解析：氣溶膠攜帶擴增產(chǎn)物導致假陽性。29.下列哪種方法可最有效去除PCR產(chǎn)物污染（）A.紫外線照射B.75%乙醇擦拭C.10%次氯酸鈉處理D.紫外線+UNG酶聯(lián)合答案：D解析：紫外線交聯(lián)+UNG水解可雙重清除污染。30.在NGS靶向捕獲中，高GC區(qū)域覆蓋度低的最主要原因是（）A.引物結(jié)合困難B.聚合酶延伸受阻C.片段化過度D.磁珠富集偏差答案：B解析：高GC模板易形成二級結(jié)構(gòu)，阻礙聚合酶延伸。二、配伍題（每題1分，共10分。每組選項可重復選用，但每題只有一個最佳答案）A.FAMB.VICC.CY5D.ROXE.HEX31.用于HPV16E6基因檢測的TaqMan探針5′端標記（）32.用于內(nèi)參基因β-globin檢測的探針標記（）33.用于多重PCR中通道3的探針標記（）34.用于校正孔間差異的被動染料（）35.常用于CRISPR熒光報告分子的標記（）答案：31A32B33C34D35AA.0.5×磁珠B.1.0×磁珠C.80%乙醇D.10mmol/LTrisE.無核酸水36.用于去除大片段引物二聚體（）37.用于洗脫純化后DNA（）38.用于磁珠洗滌（）39.用于保留小片段<100bp（）40.用于溶解凍干質(zhì)粒（）答案：36A37D38C39B40E三、填空題（每空1分，共20分）41.在qPCR中，效率E=10^(-1/斜率)-1，若斜率為-3.32，則效率為________%。答案：10042.數(shù)字PCR中，若微滴總數(shù)20000，陽性微滴1800，則拷貝數(shù)/微滴為________。答案：0.09543.臨床PCR實驗室空氣流向要求為________壓差。答案：正-負-負44.依據(jù)WHO指南，BCR-ABL1IS值≤________%視為主要分子學反應。答案：0.145.在ARMS-PCR中，引物3′端第-2位引入額外錯配的目的是________。答案：增強特異性46.用于RNA提取的Trizol主要成分為________。答案：異硫氰酸胍47.在LAMP反應中，白色沉淀由________副產(chǎn)物形成。答案：焦磷酸鎂48.依據(jù)CNAS-CL02，PCR檢測項目驗證最少需________例陽性標本。答案：2049.高分辨熔解曲線區(qū)分突變需溫度精度達________℃。答案：0.0250.在CRISPR檢測中，Cas13a切割的是________鏈。答案：單鏈RNA51.用于去除gDNA的DNaseI最適溫度為________℃。答案：3752.在NGS文庫定量中，Qubit使用________染料。答案：dsDNAHS53.依據(jù)CLSIEP17-A2，LoB是指________。答案：空白限54.在PCR反應中，DMSO常用濃度為________%。答案：5–1055.用于長片段擴增的酶具有________結(jié)構(gòu)域。答案：3′→5′外切酶56.在HPV分型中，SPF10引物靶向________基因。答案：L157.依據(jù)ISO15189，文件控制需________年復審一次。答案：358.在qPCR中，Ct值標準差>________需重復實驗。答案：0.559.用于凍干PCR試劑的賦形劑常用________。答案：海藻糖60.在數(shù)字PCR中，微滴體積通常為________nL。答案：0.85四、簡答題（每題6分，共30分）61.簡述臨床PCR實驗室發(fā)生假陽性常見原因及預防措施。答案：原因：1.氣溶膠污染；2.試劑污染；3.操作交叉；4.設(shè)備污染。預防：1.嚴格三區(qū)隔離；2.UNG體系；3.陰性對照；4.定期清潔；5.獨立器具；6.正壓通風。62.說明數(shù)字PCR與qPCR在定量原理上的本質(zhì)區(qū)別。答案：qPCR依賴標準曲線與Ct值間接推算，受擴增效率影響；數(shù)字PCR將樣本分割至單分子水平，通過終點陽性比例直接計數(shù)，無需標準曲線，絕對定量且不受抑制物影響。63.列舉三種RNA提取后質(zhì)量評估方法并說明其標準。答案：1.Nanodrop：A260/A280=1.8–2.1；2.Agilent2100：RIN≥7；3.qRT-PCR：內(nèi)參Ct<30；4.凝膠：28S/18S≈2；5.Qubit：濃度≥50ng/μL。64.簡述CRISPR-Cas12a檢測臨床樣本的步驟。答案：1.樣本裂解免提取；2.RPA等溫擴增；3.Cas12a-crRNA與靶DNA結(jié)合；4.反式切割熒光報告分子；5.試紙條或熒光讀?。?min完成，靈敏度達10拷貝。65.說明多重PCR引物設(shè)計的關(guān)鍵原則。答案：1.各引物Tm差<2℃；2.產(chǎn)物長度差>50bp；3.避免引物間互補；4.優(yōu)化濃度平衡效率；5.探針染料通道無串擾；6.共用熱循環(huán)條件；7.軟件驗證二聚體。五、案例分析題（每題10分，共30分）66.患者男，58歲，CML，服用伊馬替尼3個月，BCR-ABL1定量結(jié)果：外周血IS值1.2%，ABL1內(nèi)參拷貝數(shù)32000，實驗室轉(zhuǎn)換系數(shù)0.89。分析是否達到治療里程碑并給出建議。答案：IS值1.2%高于早期分子學反應（EMR）≤10%，但高于最佳≤0.1%，提示療效不佳。建議：1.依從性評估；2.突變檢測（T315I）；3.考慮換用二代TKI；4.1個月后復查。67.某實驗室新開發(fā)HPV16/18E6mRNA檢測，驗證時發(fā)現(xiàn)陰性對照多次Ct35–36，陽性對