演講人：日期:RNA提取方法與原理CATALOGUE目錄01基本原理02常用提取方法03關(guān)鍵操作步驟04質(zhì)量控制要點(diǎn)05應(yīng)用場景分析06注意事項01基本原理RNA的生物學(xué)特性單鏈結(jié)構(gòu)易降解RNA分子為單鏈結(jié)構(gòu)，極易受到環(huán)境中RNase的降解，因此在提取過程中需嚴(yán)格防止RNase污染，操作環(huán)境需保持無RNase狀態(tài)。堿基配對與二級結(jié)構(gòu)RNA分子可通過自身堿基配對形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)），影響提取效率，需通過變性劑（如硫氰酸胍）破壞其結(jié)構(gòu)以提高得率。組織特異性表達(dá)不同組織或細(xì)胞中RNA的種類和豐度差異顯著（如mRNA僅占總RNA的1-5%），需根據(jù)樣本類型優(yōu)化提取方案以捕獲目標(biāo)RNA。動態(tài)代謝特性RNA半衰期短（從幾分鐘到數(shù)小時），需快速處理樣本以保持RNA完整性，尤其對轉(zhuǎn)錄組研究至關(guān)重要。提取的核心目標(biāo)高純度與完整性提取的RNA需滿足A260/A280比值在1.8-2.0之間，且28S/18SrRNA比值接近2:1，確保無蛋白質(zhì)、基因組DNA及有機(jī)溶劑殘留。01高得率與廣譜性方法需適配多種樣本（如血液、植物、真菌），并能同時高效提取不同RNA亞型（mRNA、miRNA、lncRNA等）。保持天然狀態(tài)避免提取過程中RNA修飾（如甲基化）的破壞，尤其對表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究需采用溫和裂解條件。操作標(biāo)準(zhǔn)化建立可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)化流程，減少批次差異，滿足高通量測序或臨床診斷的穩(wěn)定性要求。020304RNase污染的防控多糖/多酚干擾需全程使用DEPC水處理耗材，添加RNase抑制劑（如異硫氰酸胍），并在低溫環(huán)境下操作以抑制RNase活性。植物樣本中多糖多酚易與RNA共沉淀，需通過CTAB法或硅膠膜柱特殊處理去除干擾物。關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)小RNA的捕獲傳統(tǒng)Trizol法對<200nt的小RNA回收率低，需采用特異性吸附柱或PEG沉淀優(yōu)化小RNA富集。微量樣本處理單細(xì)胞RNA提取需結(jié)合微流控技術(shù)或線性擴(kuò)增，解決起始量不足導(dǎo)致的丟失和偏差問題。02常用提取方法酚氯仿萃取法原理與步驟利用酚-氯仿-異戊醇混合液破壞細(xì)胞膜和核蛋白復(fù)合物，使RNA釋放到水相中，通過離心分層后收集上清液，再用異丙醇或乙醇沉淀RNA。此方法適用于大規(guī)模樣本處理，但操作需嚴(yán)格避免RNase污染。優(yōu)缺點(diǎn)分析成本低且適用于多種樣本類型（如組織、細(xì)胞），但有機(jī)溶劑具有毒性且步驟繁瑣，易導(dǎo)致RNA降解或蛋白質(zhì)殘留，需配合DNase處理去除基因組DNA污染。關(guān)鍵注意事項需在低溫環(huán)境下操作以減少RNA降解，水相吸取時應(yīng)避免觸及有機(jī)相，沉淀后需用75%乙醇充分洗滌以去除鹽分和雜質(zhì)。離心柱純化法工作原理應(yīng)用場景流程優(yōu)化基于硅膠膜特異性吸附RNA的特性，裂解液中的RNA在高鹽條件下結(jié)合至離心柱膜，通過漂洗去除雜質(zhì)后，用無RNase水洗脫獲得高純度RNA。適用于小量樣本快速提取，兼容后續(xù)qPCR等實驗。裂解液配方需根據(jù)樣本類型調(diào)整（如植物樣本需添加β-巰基乙醇），漂洗步驟中乙醇?xì)埩魰种葡掠畏磻?yīng)，建議離心后開蓋晾干1-2分鐘。廣泛用于臨床樣本（血液、FFPE組織）和微量RNA提取，部分試劑盒可同步去除基因組DNA，適合自動化高通量操作。磁珠分離技術(shù)技術(shù)核心表面修飾的磁珠（如硅羥基或寡核苷酸探針）在緩沖液中特異性捕獲RNA，通過磁場分離并洗滌后，改變緩沖液條件釋放RNA。該方法無需離心，適合整合至全自動提取儀。特殊應(yīng)用適用于困難樣本（如體液、土壤），配合超聲破碎可提升革蘭氏陽性菌RNA提取效率，但磁珠批次差異可能影響實驗結(jié)果一致性。性能優(yōu)勢回收率高（尤其對微小RNA）、重復(fù)性好，且可并行處理多個樣本，磁珠表面化學(xué)修飾可定向富集特定RNA（如mRNA或病毒RNA）。03關(guān)鍵操作步驟確保采集的生物樣本（如組織、細(xì)胞或體液）在低溫條件下快速保存，使用RNase-free容器和凍存液，避免RNA降解。樣本運(yùn)輸過程中需保持穩(wěn)定低溫環(huán)境，防止反復(fù)凍融。樣品預(yù)處理規(guī)范樣品采集與保存根據(jù)樣本類型選擇機(jī)械研磨、超聲破碎或酶消化法，使組織或細(xì)胞充分破碎釋放RNA。操作需在低溫環(huán)境下進(jìn)行，并添加RNase抑制劑以維持RNA完整性。樣本均質(zhì)化處理在裂解前使用DNaseI處理樣本，或在裂解緩沖液中加入DNA結(jié)合抑制劑，避免后續(xù)提取過程中DNA對RNA定量及下游應(yīng)用的干擾。去除基因組DNA污染細(xì)胞裂解策略化學(xué)裂解法采用含強(qiáng)變性劑（如異硫氰酸胍或SDS）的裂解緩沖液破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，同時使核蛋白變性失活，釋放RNA并抑制RNase活性。此方法適用于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞和軟組織。物理裂解法通過液氮研磨、珠磨震蕩或高壓勻漿等方式機(jī)械破碎細(xì)胞壁/膜，適用于植物組織、真菌或細(xì)菌等具有堅韌細(xì)胞壁的樣本，需配合化學(xué)裂解劑提高效率。酶消化輔助裂解對特定樣本（如富含纖維素的植物或革蘭氏陽性菌）添加纖維素酶、溶菌酶等，溫和降解細(xì)胞壁成分后再進(jìn)行化學(xué)裂解，可顯著提高RNA得率。雜質(zhì)去除技術(shù)有機(jī)溶劑抽提法磁珠分離技術(shù)硅膠膜吸附純化利用酚-氯仿混合液選擇性沉淀蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，通過離心分離獲得含RNA的水相。需嚴(yán)格控制pH值（酸性條件利于DNA去除，中性條件保留RNA），并避免界面污染物轉(zhuǎn)移。在高鹽條件下使RNA特異性結(jié)合硅膠膜，通過離心洗脫去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)。優(yōu)化結(jié)合/洗滌緩沖液離子濃度可提高小RNA（如miRNA）的回收效率。包被寡核苷酸探針的磁珠與目標(biāo)RNA雜交結(jié)合，在外加磁場中快速分離雜質(zhì)。該方法適用于高通量自動化提取，尤其對低豐度RNA具有高捕獲特異性。04質(zhì)量控制要點(diǎn)紫外分光光度法測定采用高靈敏度熒光染料（如RiboGreen）進(jìn)行定量，可檢測低濃度RNA樣本，并有效區(qū)分RNA與污染物，適用于微量樣本的精準(zhǔn)檢測。熒光染料定量技術(shù)毛細(xì)管電泳分析通過微流控芯片電泳系統(tǒng)分離RNA分子，實時監(jiān)測峰形和熒光信號，同時獲得濃度、純度及片段分布信息，實現(xiàn)多參數(shù)同步檢測。通過測定260nm和280nm吸光度比值（A260/A280）評估RNA純度，理想值應(yīng)在1.8-2.0之間，同時計算260nm處吸光度確定RNA濃度，確保樣本符合后續(xù)實驗要求。濃度與純度檢測完整性評估方法瓊脂糖凝膠電泳通過觀察28S和18SrRNA條帶清晰度及比例（正常約為2:1），判斷RNA是否降解，同時檢測5SrRNA和tRNA條帶評估提取效果。生物分析儀檢測使用自動化電泳平臺（如AgilentBioanalyzer）生成RNA完整性數(shù)值（RIN），通過算法分析電泳圖譜特征峰，量化評估RNA降解程度，RIN＞7為合格樣本。實時熒光定量PCR驗證設(shè)計跨外顯子引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過Ct值差異分析RNA完整性，尤其適用于微量樣本或難以通過電泳判斷的特殊樣本類型。降解風(fēng)險控制操作環(huán)境RNase滅活實驗前用RNase清除劑處理臺面及器材，佩戴口罩手套防止人體RNase污染，所有溶液均需使用DEPC水配制并高壓滅菌。低溫快速處理流程樣本采集后立即液氮速凍，提取過程保持低溫環(huán)境（冰上操作），縮短室溫暴露時間，離心機(jī)預(yù)冷至4℃以減少RNA酶活性。穩(wěn)定劑應(yīng)用策略對于無法立即處理的樣本，采用專用RNA穩(wěn)定試劑（如RNAlater）滲透組織，抑制內(nèi)源性RNase活性，保持RNA穩(wěn)定性長達(dá)數(shù)周。分裝儲存規(guī)范純化后RNA按需分裝，避免反復(fù)凍融，長期保存應(yīng)置于-80℃超低溫冰箱，短期使用可存放于-20℃含RNA穩(wěn)定劑的緩沖體系中。05應(yīng)用場景分析轉(zhuǎn)錄組測序準(zhǔn)備高質(zhì)量RNA提取要求轉(zhuǎn)錄組測序?qū)NA完整性要求極高，需采用無RNase污染的試劑和耗材，避免RNA降解，確保后續(xù)文庫構(gòu)建的準(zhǔn)確性。富集特定RNA類型根據(jù)研究需求，可通過寡核苷酸探針或磁珠分選技術(shù)富集mRNA、lncRNA等特定RNA分子，提高測序效率和數(shù)據(jù)利用率。去除基因組DNA干擾在提取過程中需使用DNase處理，消除基因組DNA殘留，防止測序數(shù)據(jù)中出現(xiàn)非目標(biāo)序列干擾分析結(jié)果?；虮磉_(dá)分析定量PCR（qPCR）前處理提取的RNA需通過反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，要求RNA純度（A260/A280比值）在1.8-2.0之間，避免蛋白質(zhì)或鹽類殘留抑制酶活性。差異表達(dá)基因篩選需保證RNA樣本來自相同處理條件，避免批次效應(yīng)，同時采用標(biāo)準(zhǔn)化方法（如RPKM、TPM）校正數(shù)據(jù)，提高可比性。低豐度RNA捕獲針對低表達(dá)基因，可通過線性擴(kuò)增技術(shù)（如T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄）增加模板量，提升檢測靈敏度。病原體檢測在臨床樣本（如血液、咽拭子）中需結(jié)合裂解緩沖液快速釋放RNA，同時滅活病原體，確保操作安全性?？焖偬崛∨c滅活高靈敏度檢測多重檢測兼容性采用硅膠膜柱或磁珠法富集微量病原體RNA，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（RT-LAMP）技術(shù)，實現(xiàn)快速診斷。針對混合感染樣本，需優(yōu)化提取流程以兼容多種病原體RNA的同步提取，避免交叉抑制。06注意事項避免RNase污染使用無RNase耗材所有接觸樣品的離心管、槍頭、容器等必須經(jīng)過高溫高壓處理或直接購買無RNase認(rèn)證產(chǎn)品，確保無外源性RNase殘留。操作環(huán)境消毒分裝試劑與專用器具實驗臺面需用含DEPC水或?qū)Ｓ肦Nase清除劑擦拭，實驗人員應(yīng)佩戴手套并頻繁更換，避免皮膚RNase污染樣本。提取試劑應(yīng)分裝使用，避免反復(fù)凍融；移液器、電泳槽等設(shè)備需專用并定期用乙醇或RNase去污劑清潔。123操作時效性要求快速裂解細(xì)胞組織樣本采集后需立即投入裂解液或液氮速凍，防止內(nèi)源性RNase降解RNA，尤其對高RNase活性的胰腺、脾臟等組織更需嚴(yán)格把控時間。縮短常溫暴露時長裂解后的樣本應(yīng)盡快完成離心、分相步驟，減少RNA在室溫下的暴露時間，建議全程在冰上操作以降低降解風(fēng)險。分階段保存中間產(chǎn)物若流程需暫停，應(yīng)將樣本置于-80℃超低溫環(huán)境或加入RNA穩(wěn)定劑