ICS65.020.20DB6111楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)地方標準DetectionofLivingPseudomonassyringaepv.actinidiaefromKiwifruitpoLLen楊凌示范區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB6111/T149—2020本文件是依據(jù)GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)提出。本文件由楊凌農(nóng)業(yè)標準化專業(yè)技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)、陜西省獼猴桃工程技術(shù)研究中心、楊凌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)標準化研究推廣服務(wù)中心。本文件主要起草人：黃麗麗、徐亮勝、雷玉山、高小寧、馮浩、王娜娜。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)負責解釋。本文件為首次發(fā)布。單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)電話址：陜西省楊凌區(qū)邰成路西北農(nóng)林科技大學(xué)郵編：712100DB6111/T149—20201獼猴桃花粉潰瘍病菌活菌檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了獼猴桃花粉中活性潰瘍病菌（Pseudomonassyringaepv.Actinidiae，Psa）檢測方法的原理、檢測方法、檢測樣品與菌株保存、結(jié)果記錄與資料保存的要求和內(nèi)容。本文件適用于活性潰瘍病菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T23621-2009農(nóng)業(yè)植物檢疫實驗室基礎(chǔ)條件SN/T0168-2015進出口食品中菌落總數(shù)計數(shù)方法SN/T0800.1-2016進出口糧油、飼料檢驗抽樣和制樣方法3原理獼猴桃為雌雄異株植物，雌雄株之間必須通過授粉才能坐果，花粉中可以攜帶活性潰瘍病菌。本文件利用常規(guī)生物學(xué)鑒定方法和菌落PCR檢測方法對花粉中潰瘍病菌進行檢測，為阻止獼猴桃細菌性潰瘍病菌的傳播提供技術(shù)支撐。4檢測方法4.1實驗室要求獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢測所用實驗室的設(shè)置與管理符合GB/T23621—2009要求。除另有規(guī)定外，本標準中的所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水應(yīng)符合GB6682中一級水的規(guī)格。病原菌培養(yǎng)及鑒定所需試劑見附錄B。4.2檢驗程序及鑒定方法獼猴桃花粉Psa活菌檢驗程序見圖1。4.2.1操作步驟4.2.1.1檢測樣品抽取見SN/T0800.1-2016。4.2.1.2抽樣數(shù)量2DB6111/T149—202010瓶（件）以下，逐瓶抽取，10瓶～100瓶，隨機選10瓶抽取樣品；100瓶以上，按照一批花粉總瓶數(shù)的平方根數(shù)抽取，見公式（1）。每瓶（件）抽取2g花粉。...................................................................................式中：N—一批花粉總瓶(件)數(shù)。n—應(yīng)抽取瓶（件）數(shù)（取整數(shù)，小數(shù)部分向上約）。檢檢樣稀釋 平板接種總菌落計數(shù)PCR確認試驗 檢測報告圖1獼猴桃花粉Psa活菌檢驗程序4.2.2抽樣方法無菌條件下將裝花粉的容器充分震蕩，使容器內(nèi)花粉充分混勻；容器表面用75%乙醇在包裝口擦拭消毒，待10min～15min后，用無菌藥匙取2g花粉于無菌的10mL離心管中，每瓶（件）花粉需換用1把藥匙。-20℃~40℃保存?zhèn)溆谩?.2.3樣品制備4.2.3.1制備樣品勻液無菌操作稱取1g樣品，加入裝有9mL的滅菌雙蒸水的和適量玻璃珠的50mL稀釋瓶中，迅速振搖，將樣品混勻，制成1:10的樣品勻漿液。振搖時振幅為30cm，7s內(nèi)振搖25次，也可以用機械振蕩器振蕩15s代替手搖。4.2.3.2稀釋樣品勻液無菌條件下取樣品勻液1mL加到9mL稀釋劑中，并以此類推，分別制成10-2、10-3、10-4連續(xù)稀釋度或其它合適稀釋度的樣品勻液。4.2.4選擇性培養(yǎng)基平板接種和培養(yǎng)DB6111/T149—202034.2.4.1無菌條件下各取1mL不同稀釋度的樣品勻液，均勻涂布在KBA+萘啶酮酸（終濃度為10μg/mL）平板培養(yǎng)基上。放入培養(yǎng)箱在25℃培養(yǎng)1h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)47h。觀察菌落形態(tài)和病原菌形態(tài)特征。獼猴桃細菌性潰瘍病菌落和病原菌形態(tài)特征見附錄A第A.6章，根據(jù)菌落特征選取可疑菌落做進一步鑒定。4.2.4.2KBA培養(yǎng)基的配制方法為：在培養(yǎng)基中加入蛋白胨20.0g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1.5g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.5g、甘油10mL、瓊脂粉15.0g，并用滅菌雙蒸水補充至1000mL，將pH值調(diào)整到6.8～7.0。4.2.5菌落計數(shù)選擇菌落數(shù)在25個～250個的平板進行計數(shù)，計數(shù)所有菌落形成單位（CFU），包括極微小的菌落。記錄菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)。如果不能立即計數(shù)，平板在0℃~4℃存放時間不得超過24h。4.2.6PCR檢測4.2.6.1從已計數(shù)的平板中挑取單菌落進行PCR確認試驗平板菌落數(shù)小于30個，需全部進行PCR確認；菌落數(shù)介于31個～250個時，隨機挑取30個菌落進行PCR確認試驗。4.2.6.2熱裂解法制備DNA模板用無菌牙簽挑取平板上培養(yǎng)36h～48h的單菌落，置于200μL的0.85%無菌生理鹽水中，充分混勻；在13000r/min離心3min，棄掉上清液；再加入1mL滅菌雙蒸水，充分混勻；置于100℃水浴或金屬浴中10min；冰浴冷卻后，13000r/min離心3min，收集上清液；按1:10的比例用滅菌雙蒸水稀釋上清液即為DNA模板；取2μLDNA模板進行PCR檢測。所有DNA模板可直接用于PCR反應(yīng)或在4℃保存1天。否則，應(yīng)在-20℃以下保存?zhèn)溆?1周內(nèi))。4.2.6.3陽性對照與陰性對照。用已知的Psa標準菌株（M228）作為陽性對照；用丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pst）或等效標準菌株作為陰性對照。滅菌雙蒸水作為空白對照。PCR制樣及檢測方法見附錄B的結(jié)果判定。4.2.7平板培養(yǎng)結(jié)果判定平板培養(yǎng)放置6d以上,如未發(fā)現(xiàn)疑似細菌菌落，判定為不帶有Psa。如發(fā)現(xiàn)疑似細菌菌落，進行菌落計數(shù)，并做進一步PCR鑒定。4.2.8PCR結(jié)果判定若待測樣品和陽性對照存在243bp條帶，陰性對照和空白對照無此條帶，則判定待測樣品為陽性，其攜帶有Psa；否則為陰性。5樣品與菌株保存?zhèn)浞輼悠芳皬臉悠分蟹蛛x到并鑒定為Psa菌株，應(yīng)妥善保存。備份樣品菌株可接種于KBA培養(yǎng)基斜面上，25℃恒溫培養(yǎng)2d～3d后置于4℃冰箱保存，或加入10%體積的甘油制成甘油菌液，置于-80℃冰DB6111/T149—20204箱長期保存。其它不需要保存的樣品及檢測過程中產(chǎn)生的廢物、廢水等應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后集中銷毀，用具也應(yīng)進行滅菌處理。6結(jié)果記錄與資料保存實驗記錄應(yīng)包括：樣品來源、種類（品種）、采集時間、檢測時間、地點和結(jié)果等，并要有檢測人員、審核人員簽字。PCR檢測需要有電泳結(jié)果照片等，上述材料應(yīng)歸檔并妥善保存。DB6111/T149—20205（資料性附錄）獼猴桃細菌性潰瘍病菌（psa）相關(guān)資料A.1英文名稱KiwifruitBacteriaLCankerA.2學(xué)名Pseudomonassyringaepv.actinidiaeA.3分布地區(qū)中國、日本、韓國、新西蘭、意大利、美國、法國、葡萄牙、土爾其、西班牙、伊朗、希臘。A.4寄主范圍該病原菌自然侵染的寄主主要為獼猴桃屬（ActinidiaLindL）；人工接種可侵染桃（PrunusescuLentum）等。A.5病害癥狀A(yù).5.1枝潰瘍癥狀多從莖蔓幼芽、皮孔、葉痕、果柄痕及枝條分叉部位開始發(fā)病，初期呈水漬狀，后擴大，顏色加深，皮層組織變軟隆起，與木質(zhì)部分離，后期病部皮層縱向線狀龜裂，傷口、皮孔、芽眼、葉痕等部位流出白色黏液，傷流期與植株傷流液混合后變?yōu)榧t褐色或鐵銹紅色，剝開皮層后可見木質(zhì)部呈黑褐色，韌皮部潰瘍腐爛，病斑繞莖擴展到新梢后影響營養(yǎng)和水分的吸收與輸送導(dǎo)致新梢枝葉萎蔫枯死。A.5.2葉斑癥狀新生葉片上呈現(xiàn)紅色小點，后形成2mm～3mm不規(guī)則褐色或暗褐色病斑，病斑周圍有2mm～5mm的明顯水漬狀黃色暈圈，潮濕條件下病斑擴大，導(dǎo)致整個葉片焦枯、卷曲。A.5.3花腐癥狀花蕾受害后嚴重的不能張開，變褐死后脫落；受害較輕的花蕾雖能開放，但開放速度慢或不能完全開放，這種花可能脫落也可能座果，通常果實較小，易落果或發(fā)育成畸形果。A.6病原菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀DB6111/T149—20206Psa為好氧細菌，病原菌菌體直桿狀，有的稍彎曲，單細胞，菌體大小為（1.4μm～2.3μm）×（0.4μm～0.5μm），多數(shù)具1根極生鞭毛，少數(shù)為2根～3根。革蘭氏染色陰性，不具莢膜，不產(chǎn)生芽孢。在KBA培養(yǎng)基上菌落呈白色或淺黃色、表面光滑、有黃綠色熒光；在牛肉蛋白胨培養(yǎng)基上呈圓形、乳白色、表面光滑、全緣。病原菌生長最適溫度為25℃~28℃,生長最高溫度為35℃,生長最低溫度為-12℃以下，致死溫度為55℃、10min。A.7傳播途徑該病原菌的遠距離傳播主要靠帶菌苗木、接穗、花粉和昆蟲。在田間，該病原菌主要通過雨水、灌溉水、農(nóng)具、昆蟲等傳播，由傷口、自然孔口等侵入寄主組織。DB6111/T149—20207（資料性附錄）獼猴桃細菌性潰瘍病菌（psa）PCR檢測方法B.1試劑及配制——TE緩沖液：10mMTris·HCL,1mMEDTA,pH8.0?！狿CR試劑：特異引物對（10μmoL/L）、2×MasterMix、TempLate(0.1ng/mL～1ng/mL)——2000bpDNAMarker、5moL/LNaCL、70%乙醇、核酸染料——電泳緩沖液TBE（5×)（pH8.0）：每升溶液中含54gTris，27.5g硼酸，10mMEDTA。電泳時稀釋成1×濃度使用?！傊悄z（1%稱取0.1g瓊脂糖加入到10mL1×TBE溶液中，微波爐煮沸后加入1‰體積核酸染料，混勻后制膠。B.2PCR檢測B.2.1PCR檢測引物引物對1：Psa-F1/Psa-R1（引物序列為正向引物P0F:5`-CTGCAACAGGCGACGGCGAGGC-3`、反向引物P6R:5`-CATAGGCTTCTGGTTTTCTTCCTGATCC-3`，擴增片段長度為243bp），使用TE溶液（pH8.0）將合成的引物干粉稀釋成10μmoL/L儲存液。B.2.2PCR反應(yīng)體系及擴增條件B.2.2.1PCR反應(yīng)體系2×MasterMix10μL、TempLate(0.1ng/mL～1ng/mL)1μL、正反引物各1μL、補滅菌雙蒸水至反應(yīng)體系總體積為20μL。B.2.2.2PCR擴增條件將配制完成的反應(yīng)管放入PCR儀中，啟動反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，66℃退火30s，72℃延伸1min，35cycLes；72℃5min，4℃保溫。在進行PCR檢測時，需同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。B.3凝膠電泳稱量2.0g瓊脂糖，加入至200mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右時，加入GeLRed（膠體體積與染料體積比為20:1），充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于10cm，厚度為3mm～5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，如果有，則用一次性吸頭小心排掉氣泡。當瓊脂糖凝膠完全凝結(jié)后，輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔朝向陰極端。向電泳槽中加入1×TAEDB6111/T149—20208電泳緩沖液，液面高于膠面1mm～2mm。用微量移液器吸5μLPCR產(chǎn)物加入上樣孔中；其中，第1個泳道中加入2μLDNAMarker，陽性對照的PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后1個泳道。接通電源,根據(jù)公式:電壓=電泳槽正負極間的距離(cm)×5V/cm計算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動電壓開關(guān),電泳開始以正負極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準，電泳時間為30min～45min。B.4成像觀察與記錄電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀下，根據(jù)DNAMarker判斷擴增產(chǎn)物條帶的大小，記錄結(jié)果，并將電子文件存檔備查。B.5結(jié)果判定如果待測樣品和陽性對照同時出現(xiàn)243bp大小的目的條帶，而陰性對照、空白對照均沒有該條帶，則判定待測樣品為陽性；如果陽性對照出現(xiàn)目的條帶，而陰性對照、空白對照、