ICS65.020.01

CCSB25

15

內蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T2690—2022

青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏

技術規(guī)程

Technicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacid

bacteriastrainsinsilage

2022-07-15發(fā)布2022-08-15實施

內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2690—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內蒙古農業(yè)大學提出。

本文件由內蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內蒙古農業(yè)大學、內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院、中國農業(yè)科學院草原研究所、白

城師范學院、巴林左旗林業(yè)和草原局、內蒙古伊禾綠錦農業(yè)發(fā)展有限公司。

本文件主要起草人：格根圖、包健、賈玉山、王志軍、孫林、尤思涵、都帥、降曉偉、侯美玲、丁

霞、盧強、馬千鵬、王瑞峰、趙牧其爾、李宇宇、劉明健、王宇、張佳偉。

I

DB15/T2690—2022

青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了青貯飼料中乳酸菌菌種分離與保藏的基本原則、設備、試劑、菌種分離、菌種保藏方

法。

本文件適用于青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB20287農用微生物菌劑

SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制備質量保證通則

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4基本原則

應針對菌種的生物學性狀選擇分離與保藏方法。

應使分離和保藏的菌種不染雜菌，使退化和死亡降到最低限度。

應保證菌種分離和保藏的安全性，不能對周圍環(huán)境造成污染和危害。

5設備

恒溫培養(yǎng)箱：5℃～60℃。

厭氧培養(yǎng)裝置：5℃～60℃。

振蕩器：往復式。

冰箱：4℃冰箱、超低溫冰箱（-50℃～-86℃）。

分析天平：感量0.001g。

光學顯微鏡：4×～100×。

均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳缽。

水浴鍋：0℃～100℃。

超凈工作臺。

1

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6試劑

乳酸菌培養(yǎng)基：MRS瓊脂，見附錄A。

稀釋液：稱取氯化鈉8.5g，溶于1000mL蒸餾水中，分裝后，121℃高壓滅菌30min。

所用試劑均為分析純，水符合GB/T6682三級水規(guī)格。

7乳酸菌菌種分離

菌液制備

以無菌操作稱取10g樣品置于盛有90mL無菌生理鹽水的聚乙烯均質袋內，用拍打式無菌均質器拍

打2min，制成1：10的樣品菌液。

菌液稀釋

用1mL無菌吸管（移液槍）吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于裝有9mL無菌水的無菌試管

中，振搖試管或利用小型試管振蕩器使其混合均勻，按1→10進行系列稀釋，分別得到1→1×101、1→1

×102、1→1×103、1→1×104，1→1×105稀釋的樣品菌液（每個稀釋度應更換移液管或槍頭）。

菌種培養(yǎng)

按照GB20287規(guī)定制備瓊脂培養(yǎng)基，于高壓滅菌鍋滅菌后備用。選擇2～3個適宜稀釋度的樣品菌液

（可包括原液），吸取20μL樣品菌液于制備好的無菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿內，利用無菌涂布棒涂抹均勻，

每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。同時，分別吸取20μL空白稀釋液加入兩個無菌培養(yǎng)皿內作空白對照。將培

養(yǎng)皿翻轉，倒置于恒溫培養(yǎng)箱（乳酸菌：30℃厭氧條件下培養(yǎng)72h）。

乳酸菌的分離與純化

觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色和光澤，選擇典型的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢和過氧化氫試驗。經

過革蘭氏染色（呈陽性）和過氧化氫（呈陰性）試驗，初步判斷乳酸菌種類。用接種環(huán)挑取典型菌落1～

2于MRS瓊脂斜面培養(yǎng)基上，用接種環(huán)從底部自下而上劃密“之”字形線，在30℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培

養(yǎng)48h～72h，重復劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株。乳酸菌菌種分離及篩選程序見圖1。

乳酸菌的篩選

7.5.1生長繁殖能力

將分離純化的乳酸菌菌液混勻并提取其懸液以6%的濃度接種至MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)（37℃）

24h，期間每2h用紫外可見分光光度計測其在波長620nm的OD值，每個菌種均重復3次，最終將測定結

果繪制生長曲線。

7.5.2產酸能力

將乳酸菌菌液混勻，提取其懸液以3.0%的濃度接種于pH=6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，恒溫（37℃）培

養(yǎng)24h，期間每2h用pH計測發(fā)酵液的pH值，每個菌種均重復3次，最終將測定結果繪制產酸速率曲線。

7.5.3生理生化特性

將乳酸菌菌株以3%的濃度接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別在4℃，10℃，30℃，45℃條件下進行

培養(yǎng)，其中4℃培養(yǎng)10d，10℃與30℃培養(yǎng)3d，45℃培養(yǎng)7d，培養(yǎng)結束后觀察乳酸菌菌株對溫度

2

DB15/T2690—2022

的響應情況。分別在pH值為3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0以及濃度為3.0%和6.5%NaCl的

MRS液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48h，觀察乳酸菌菌株對酸堿與鹽的耐受能力。采用紫外可見分光光度計測

定乳酸菌在波長620nm的OD值，以判斷乳酸菌在不同環(huán)境下的生長情況（弱生長：0.2小于OD值小于0.5，

生長：0.5小于OD值小于0.1，不生長：OD值小于0.2，生長好：OD值大于1.0）。用細菌微量生化鑒

定管檢測乳酸菌菌株對49種碳源的利用情況，均重復測定3次。

圖1菌種分離及篩選程序

8菌種保藏方法

定期移植保藏法

按附錄B的規(guī)定。

低溫冷凍保藏法

按附錄C的規(guī)定。

3

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

乳酸菌培養(yǎng)基

A.1MRS培養(yǎng)基

乳酸菌培養(yǎng)基見表A.1。

表A.1乳酸菌培養(yǎng)基

成分組成稱取量

蛋白胨10.0g

牛肉粉5.0g

酵母粉4.0g

葡萄糖20.0g

吐溫801.0mL

K2HPO4?7H2O2.0g

醋酸鈉?3H2O5.0g

檸檬酸三銨2.0g

MgSO4?7H2O0.2g

MnSO4?4H2O0.05g

A.2制法

將上述成分加入到1000mL蒸餾水中，加熱溶解，調節(jié)pH至6.2±0.2，分裝后121℃高壓滅菌15min。

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

定期移植保藏法

B.1適用范圍

本方法廣泛適用于細菌、放線菌、真菌等的短期保藏。

B.2原料

保藏培養(yǎng)基一般含有機氮多，糖分總量不超過2%，既能滿足菌種培養(yǎng)時生長繁殖的需要，又可防止

因產酸過多而影響菌種性能。大多數(shù)在低溫條件下保藏可大大減緩菌種的代謝活動，抑制繁殖速度，降

低突變頻率，延長菌種保藏時間。

B.3技術要求

B.3.1不同菌種應根據(jù)要求選擇合適的培養(yǎng)基。

B.3.2接種時要求無菌操作，避免污染。

B.3.3保藏期間要定期檢查菌種存放的房間、冰箱、冷庫等的溫度、濕度，不可使培養(yǎng)基干枯，如發(fā)

現(xiàn)異常應重新移植培養(yǎng)。

B.3.4在傳代過程中，將保藏菌種在營養(yǎng)貧乏和豐富的新鮮培養(yǎng)基中作交替培養(yǎng)，有利于保持菌種的

優(yōu)良特性。

B.3.5每次移植培養(yǎng)后，應于原保藏菌株及其登記卡片（包含菌株名稱、編號、所用培養(yǎng)基等信息）

逐個對照，檢查無誤后再存放。

B.3.6保藏菌種的移植不宜頻繁，每次移植時，數(shù)量可以多一些，以延長使用期。

B.4方法與步驟

B.4.1培養(yǎng)基制備

按照GB/T4789.28和SN/T1538.1執(zhí)行。

B.4.2接種

B.4.2.1斜面接種

B.4.2.1.1點接

用接種環(huán)把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如：毛霉、

根霉等）。

B.4.2.1.2中央劃線

用接種環(huán)從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。

B.4.2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法

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用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃稀“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。

B.4.2.1.4密波狀蜿蜒劃線法

用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和

酵母菌等。

B.4.2.1.5挖塊接種法

用接種鏟挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。

B.4.2.2穿刺接種

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌苔，從平固體培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿

到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢伸出接種針。適用于細菌和酵母菌等。

B.4.2.3液體菌種

挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。

B.4.3培養(yǎng)

將接種后的培養(yǎng)基放入30℃～38℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至良好狀態(tài)，根據(jù)菌種類別確定設定溫

度。

B.4.4保藏

B.4.4.1保藏溫度

培養(yǎng)好的菌種于4℃～6℃保藏，有些菌種（如：部分弧菌、假單胞菌等）4℃～6℃容易死亡，

適于25℃室溫保藏。

B.4.4.2保藏濕度

通常相對濕度為50%～70%。

B.4.5定期移植

定期移植的間隔時間，因微生物種類不同而異。一般不產生芽孢的細菌間隔較短，需1～2周，最長

一個月移植一次。放線菌、酵母菌和絲狀真菌間隔時間較長，每4～6個月移植一次即可。對于某些菌種

（如：芽裂酵母，棉病囊霉等），應1～3個月移植一次。按相應的間隔時間將保藏菌種轉接到新鮮培養(yǎng)

基中，在30℃～38℃培養(yǎng)，根據(jù)菌種類別確定設定溫度。

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C

C

附錄C

（規(guī)范性）

低溫冷凍保藏法

C.1適用范圍

本方法適用于大多數(shù)需要長期保藏的細菌、真菌、放線菌、病毒等。

C.2原理

大多數(shù)微生物可在-60℃及以下的低溫中保藏。通過低溫，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷

凍溫度愈低，效果愈好。

C.3技術要求

C.3.1為了獲得滿意的冷凍效果，應在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。

C.3.2冷凍保藏時，要掌握好冷凍速度和解凍速度。

C.3.3注意低溫冰箱的故障和停電事故，可以在低溫槽內留有一定的空間，如果發(fā)生使低溫冰箱溫度

變化的情況，可加入干冰以防止培養(yǎng)融化。

C.3.4融化后的菌種不能再用低溫保藏，應重新接種后再冷凍保藏。

C.4方法與步驟