免疫學診療操作安排一、免疫學診療操作概述

免疫學診療是指通過一系列檢測手段，評估個體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)，為疾病診斷、治療監(jiān)測及健康評估提供依據(jù)。規(guī)范的診療操作是確保結(jié)果準確性和臨床應用價值的關(guān)鍵。本操作安排旨在提供一套系統(tǒng)化、標準化的流程，涵蓋從樣本采集到結(jié)果解讀的全過程。

（一）免疫學診療的目的與意義

1.疾病診斷輔助：通過檢測特定免疫指標，協(xié)助醫(yī)生對自身免疫性疾病、感染性疾病等進行初步判斷。

2.治療效果監(jiān)測：動態(tài)跟蹤患者免疫狀態(tài)變化，評估治療方案的有效性。

3.風險評估：識別個體感染、腫瘤等風險，為預防性干預提供參考。

（二）免疫學診療的操作原則

1.標準化流程：所有操作均需遵循既定規(guī)程，確保一致性。

2.質(zhì)量控制：設立多重質(zhì)控點，減少誤差可能。

3.安全規(guī)范：嚴格遵守生物安全要求，保護患者隱私。

二、樣本采集與處理

規(guī)范的樣本采集和處理是保證免疫學檢測結(jié)果準確性的基礎環(huán)節(jié)。

（一）樣本類型與采集要求

1.血液樣本：

(1)采集量：通常需3-5ml，根據(jù)具體檢測項目調(diào)整。

(2)抗凝劑選擇：EDTA-K2為常用，需避免肝素等干擾物質(zhì)。

(3)采集時間：建議空腹，晨起6-8小時后采集。

2.組織樣本：

(1)取材部位：需根據(jù)臨床需求選擇，如淋巴結(jié)、皮膚等。

(2)保存條件：立即置于4℃保存，超過2小時需采用RNAlater固定。

（二）樣本處理流程

1.血液樣本處理：

(1)充分混勻：采集后立即顛倒混勻8-10次。

(2)離心分離：3000rpm離心5分鐘，分離血清或血漿。

(3)分裝保存：-80℃保存，長期檢測建議分裝。

2.組織樣本處理：

(1)固定：10%中性緩沖甲醛溶液浸泡24小時。

(2)石蠟包埋：常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。

(3)切片：4μm厚度切片，HE染色備用。

三、免疫學檢測方法與操作

根據(jù)檢測需求選擇合適的免疫學方法，以下列舉幾種常見操作。

（一）流式細胞術(shù)檢測

1.儀器準備：

(1)預熱儀器：開機后需預熱30分鐘以上。

(2)校準設置：使用標準品校準熒光通道和閾值。

2.試劑配制：

(1)單克隆抗體：按說明書比例稀釋，避光保存。

(2)FACS溶血劑：新鮮配制，避免反復凍融。

3.樣本染色步驟：

(1)固定：冰凍固定10分鐘。

(2)染色：加入抗體，4℃孵育30分鐘。

(3)清洗：PBS清洗2次，每次5分鐘。

4.數(shù)據(jù)采集與分析：

(1)設門：根據(jù)細胞特征設立分析區(qū)域。

(2)參數(shù)設置：CD3+/CD4+/CD8+等常規(guī)指標。

(3)統(tǒng)計處理：使用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

（二）ELISA檢測

1.試劑盒準備：

(1)檢測標準：使用標準曲線計算濃度。

(2)試劑平衡：室溫放置30分鐘。

2.加樣操作：

(1)底物孵育：37℃避光孵育30分鐘。

(2)終止反應：加入硫酸終止液，混勻。

3.結(jié)果判讀：

(1)定性檢測：顏色變化判斷陽性陰性。

(2)定量檢測：酶標儀測定OD值，繪制標準曲線。

四、質(zhì)量控制與結(jié)果報告

嚴格的質(zhì)量控制體系是確保免疫學診療結(jié)果可靠性的保障。

（一）室內(nèi)質(zhì)量控制

1.日間質(zhì)控：每日檢測質(zhì)控品，監(jiān)控波動范圍。

(1)質(zhì)控限：設定±10%的允許偏差。

(2)異常處理：超出范圍需重新檢測。

2.室間質(zhì)評：參與第三方組織的比對檢測。

(1)參評頻率：每季度參與一次。

(2)結(jié)果分析：評估實驗室準確性。

（二）結(jié)果報告規(guī)范

1.報告內(nèi)容：

(1)基本信息：樣本編號、檢測項目、參考值。

(2)結(jié)果數(shù)值：列出原始數(shù)據(jù)和計算值。

(3)臨床意義：提供簡要解讀建議。

2.報告發(fā)放：

(1)電子版?zhèn)鬏敚和ㄟ^LIS系統(tǒng)自動推送。

(2)紙質(zhì)版簽發(fā)：實驗室負責人審核簽字。

五、安全防護與廢棄物處理

在操作過程中需嚴格遵守生物安全規(guī)范。

（一）個人防護

1.試劑防護：配置化學防護眼鏡和手套。

2.污染防護：穿戴一次性工作服和口罩。

3.侵入性操作：使用無菌針頭和注射器。

（二）廢棄物處理

1.化學廢棄物：收集后交由專業(yè)機構(gòu)處理。

2.生物廢棄物：高壓滅菌后焚燒處理。

3.廢棄樣本：滅活處理后按醫(yī)療廢物處置。

一、免疫學診療操作概述

免疫學診療是指通過一系列檢測手段，評估個體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)，為疾病診斷、治療監(jiān)測及健康評估提供依據(jù)。規(guī)范的診療操作是確保結(jié)果準確性和臨床應用價值的關(guān)鍵。本操作安排旨在提供一套系統(tǒng)化、標準化的流程，涵蓋從樣本采集到結(jié)果解讀的全過程。

（一）免疫學診療的目的與意義

1.疾病診斷輔助：通過檢測特定免疫指標，協(xié)助醫(yī)生對自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡）、感染性疾?。ㄈ缃Y(jié)核病、艾滋病窗口期檢測）、過敏性疾病等進行初步判斷或鑒別診斷。例如，檢測血清中的類風濕因子（RF）和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP）有助于類風濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷；CD4+T淋巴細胞計數(shù)是評估HIV感染者免疫狀態(tài)和指導抗病毒治療的重要指標。

2.治療效果監(jiān)測：動態(tài)跟蹤患者免疫狀態(tài)變化，評估治療方案（如化療、免疫抑制劑、疫苗）的有效性。例如，在自身免疫性疾病患者中，監(jiān)測治療前后血清中自身抗體滴度或炎癥因子的變化；在腫瘤患者接受免疫治療（如PD-1抑制劑）后，可通過檢測腫瘤相關(guān)抗原、免疫細胞浸潤情況等指標來評估療效。

3.風險評估：識別個體感染、腫瘤等風險，為預防性干預提供參考。例如，檢測細胞免疫功能（如NK細胞活性）可評估個體對病毒感染的風險；某些腫瘤標志物（如癌胚抗原CEA，盡管其特異性不高，但仍可作為某些癌癥的輔助監(jiān)測指標）的動態(tài)變化有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和復發(fā)監(jiān)測。

（二）免疫學診療的操作原則

1.標準化流程：所有操作均需遵循既定規(guī)程，確保一致性。這意味著從樣本接收、處理、檢測到結(jié)果報告的每一個環(huán)節(jié)都應有明確的SOP（標準操作程序），并使用經(jīng)過驗證的試劑和儀器。例如，流式細胞術(shù)檢測中抗體濃度、孵育時間、固定劑使用等參數(shù)均需標準化。

2.質(zhì)量控制：設立多重質(zhì)控點，減少誤差可能。這包括使用質(zhì)控品（內(nèi)控）、參加室間質(zhì)量評價（外控），以及進行方法學驗證和儀器校準。質(zhì)控品的頻率（如每日、每周）和判定標準（如可接受誤差范圍）需明確規(guī)定。

3.安全規(guī)范：嚴格遵守生物安全要求，保護患者隱私。所有涉及人類樣本的操作必須在符合生物安全等級（通常為BSL-2）的實驗室進行，操作人員需穿戴適當?shù)膫€人防護裝備（PPE），如實驗服、手套、護目鏡等。樣本標識清晰、唯一，并嚴格保密患者信息。

二、樣本采集與處理

規(guī)范的樣本采集和處理是保證免疫學檢測結(jié)果準確性的基礎環(huán)節(jié)。不規(guī)范的采集和處理可能導致樣本溶血、細胞破壞、污染或降解，從而影響檢測結(jié)果。

（一）樣本類型與采集要求

1.血液樣本：

(1)采集量：通常需3-5ml，根據(jù)具體檢測項目調(diào)整。例如，流式細胞術(shù)通常需要2-3ml全血，而血清學檢測（如ELISA）可能需要3-5ml，以便分離出足夠的血清或血漿。特殊項目（如細胞因子檢測）可能需要更大體積或特殊處理。

(2)抗凝劑選擇：EDTA-K2為常用，適用于大多數(shù)細胞計數(shù)和分選項目；肝素適用于凝血功能檢查和某些細胞因子檢測，但可能干擾某些化學發(fā)光檢測；檸檬酸鈉適用于凝血功能檢測（PT,APTT）。需根據(jù)檢測目的選擇合適的抗凝劑，并確保其濃度準確無誤。避免使用肝素等可能干擾后續(xù)檢測的試劑。

(3)采集時間：建議空腹，晨起6-8小時后采集。避免進食高脂食物、飲酒，以免影響某些指標（如血脂、C反應蛋白）。部分檢測項目對采集時間有特殊要求，如糖化血紅蛋白需在持續(xù)血糖控制狀態(tài)下采集。

(4)采集方法：使用無菌干燥注射器抽取，避免震蕩，防止紅細胞破壞。首次穿刺失敗后不宜立即再次嘗試，應更換部位或重新采集。

(5)標記要求：樣本采集后立即在管壁上清晰、牢固地標記患者信息（包括姓名、ID號、采集日期和時間、抗凝劑類型），與樣本標簽一一對應，防止混淆。

2.組織樣本：

(1)取材部位：需根據(jù)臨床需求選擇，如淋巴結(jié)（superficial,deep）、皮膚（病變部位、正常皮膚）、骨髓（穿刺部位）、腫瘤組織（新鮮或石蠟）等。取材應包含足夠的目標細胞或組織量。

(2)保存條件：立即置于4℃保存，超過2小時需采用RNAlater固定。對于需要長期保存或進行分子生物學檢測的組織，應立即置于RNAlater溶液或液氮中。對于石蠟包埋，需盡快完成固定、脫水、透明、浸蠟、包埋全過程，一般不超過24小時。

（二）樣本處理流程

1.血液樣本處理：

(1)充分混勻：采集后立即顛倒混勻8-10次，確?？鼓齽┡c血液充分作用，防止血液凝固或細胞聚集。

(2)離心分離：3000rpm離心5分鐘，分離血清或血漿。離心速度和時間需根據(jù)樣本量和抗凝劑類型調(diào)整，避免過度離心導致細胞破壞。血清通常用于大多數(shù)化學發(fā)光和ELISA檢測；血漿（經(jīng)抗凝劑滅活處理后）用于某些蛋白檢測。

(3)分裝保存：-80℃保存，長期檢測建議分裝，避免反復凍融對樣本造成損傷。首次凍存前可進行快速冷凍（如真空冷凍干燥），減少冰晶形成。記錄凍存日期和位置。

2.組織樣本處理：

(1)固定：10%中性緩沖甲醛溶液（pH7.4）浸泡24小時。固定是組織學檢測的關(guān)鍵步驟，需確保固定劑完全滲透組織。固定時間一般不超過24-48小時，過長可能導致組織變硬、染色困難。

(2)石蠟包埋：常規(guī)脫水（梯度乙醇）、透明（二甲苯）、浸蠟（石蠟）、包埋。脫水步驟需逐步增加乙醇濃度，避免組織損傷。包埋塊應大小適中，便于切片。

(3)切片：4μm厚度切片，HE染色備用。切片厚度影響觀察效果，4μm是常用厚度。切片機需定期維護，確保切片平整。HE染色是基礎染色方法，用于觀察組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)。

三、免疫學檢測方法與操作

根據(jù)檢測需求選擇合適的免疫學方法，以下列舉幾種常見操作。

（一）流式細胞術(shù)檢測

1.儀器準備：

(1)預熱儀器：開機后需預熱30分鐘以上，使激光器、檢測器和流體系統(tǒng)達到穩(wěn)定工作狀態(tài)。

(2)校準設置：使用標準品校準熒光通道和閾值。熒光校準確保不同顏色熒光信號的準確測量；閾值校準防止細胞被錯誤判讀。校準通常每日或每周進行一次，根據(jù)儀器使用頻率和穩(wěn)定性調(diào)整。

2.試劑配制：

(1)單克隆抗體：按說明書比例稀釋，避光保存?？贵w稀釋應在無菌條件下進行，使用預溫的稀釋液（如PBS含0.1%疊氮鈉）。不同抗體的最佳工作濃度需通過預實驗確定。

(2)FACS溶血劑：新鮮配制，避免反復凍融。溶血劑用于去除紅細胞，避免其干擾白細胞檢測。使用前需確認其有效性和穩(wěn)定性。

3.樣本染色步驟：

(1)固定：冰凍固定10分鐘。使用固定液（如多聚甲醛）使細胞膜穩(wěn)定，防止細胞變形或細胞內(nèi)成分泄漏。

(2)染色：加入抗體，4℃孵育30分鐘。孵育溫度和時間需根據(jù)抗體說明書優(yōu)化。4℃孵育有助于抗體與細胞表面抗原結(jié)合更充分。避免光照。

(3)清洗：PBS清洗2次，每次5分鐘。清洗去除未結(jié)合的抗體，減少非特異性結(jié)合帶來的背景干擾。每次清洗后需充分離心（如1000rpm,5分鐘）去除上清。

(4)細胞permeabilization(如需)：對于檢測細胞內(nèi)抗原（如胞內(nèi)細胞因子、磷酸化蛋白），需使用破膜劑（如Paraformaldehyde/permeabilizationbuffer）處理細胞，使抗體能夠進入細胞內(nèi)部。

4.數(shù)據(jù)采集與分析：

(1)設門：根據(jù)細胞特征設立分析區(qū)域。通過FSC/SSC散點圖初步篩選目標細胞群體（如淋巴細胞群），設立合理的分析窗口，排除死細胞、細胞碎片等干擾。

(2)參數(shù)設置：CD3+/CD4+/CD8+等常規(guī)指標。根據(jù)檢測目的選擇合適的熒光標記抗體組合，設置相應的檢測參數(shù)（如激發(fā)波長、發(fā)射波長）。

(3)統(tǒng)計處理：使用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。對Gates的有效性進行評估，計算各亞群細胞的百分比和絕對數(shù)值（需結(jié)合樣本量計算）。進行統(tǒng)計學分析，比較不同組間差異。

（二）ELISA檢測

1.試劑盒準備：

(1)檢測標準：使用標準品繪制標準曲線。標準品的濃度需準確，且在檢測范圍內(nèi)。至少使用5個濃度梯度繪制標準曲線。

(2)試劑平衡：室溫放置30分鐘。所有試劑（洗滌液、底物等）需與室溫平衡，避免因溫差導致反應條件不一致。

2.加樣操作：

(1)加樣：嚴格按照說明書加入樣本、標準品、酶標抗體（如適用）、生物素標記物（如適用）和底物。使用移液器，確保加樣準確。建議使用多孔移液器，提高加樣效率。

(2)底物孵育：37℃避光孵育30分鐘。孵育溫度和時間需根據(jù)說明書優(yōu)化。避光是為了防止酶促反應過快，得到線性關(guān)系較好的標準曲線。

(3)終止反應：加入硫酸終止液，混勻。終止液的作用是使酶促反應停止，并使反應產(chǎn)物顏色穩(wěn)定，便于在酶標儀上讀取?；靹虼_保溶液顏色均勻。

3.結(jié)果判讀：

(1)定性檢測：顏色變化判斷陽性陰性。通過肉眼觀察或設置閾值進行判斷。適用于快速篩查。

(2)定量檢測：酶標儀測定OD值，繪制標準曲線，計算樣本濃度。使用酶標儀在規(guī)定的波長下測定吸光度值（OD值）。根據(jù)標準曲線方程（Y=AX+B）計算樣本濃度（X）。注意OD值應在酶標儀的線性范圍內(nèi)。

（三）WesternBlotting檢測

1.樣本制備：

(1)蛋白提?。菏褂昧呀饩彌_液（含去垢劑、蛋白酶抑制劑）提取組織或細胞總蛋白。確保裂解充分，避免細胞聚集。

(2)蛋白定量：使用BCA或Bradford法測定樣本蛋白濃度。精確的蛋白濃度是后續(xù)電泳加載量準確的前提。

2.SDS電泳：

(1)凝膠制備：根據(jù)目標蛋白分子量選擇合適的百分比聚丙烯酰胺凝膠。

(2)樣本加載：根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，通常20-50μg/泳道。

(3)電泳：設定合適的電壓和時間進行電泳，使蛋白按分子量大小分離。

3.轉(zhuǎn)膜：

(1)轉(zhuǎn)膜條件：設置合適的電壓和濕轉(zhuǎn)時間，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上。

(2)封閉：用封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA）封閉膜上殘留的蛋白結(jié)合位點，通常4℃過夜或室溫1小時。

4.抗體孵育：

(1)一抗孵育：用稀釋后的特異性一抗（如兔抗人EGFR抗體）孵育，通常4℃過夜。

(2)二抗孵育：用稀釋后的酶標二抗（如辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG）孵育，室溫1小時。

5.化學發(fā)光檢測：

(1)底物添加：加入化學發(fā)光底物（如ECL），立即在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。

(2)圖像采集：控制曝光時間，避免信號過強或過弱。

6.結(jié)果分析：

(1)條帶灰度分析：使用軟件對目標條帶進行灰度積分，定量分析蛋白表達水平變化。

四、質(zhì)量控制與結(jié)果報告

嚴格的質(zhì)量控制體系是確保免疫學診療結(jié)果可靠性的保障。

（一）室內(nèi)質(zhì)量控制

1.日間質(zhì)控：每日檢測質(zhì)控品，監(jiān)控波動范圍。

(1)質(zhì)控品選擇：使用水平明確的質(zhì)控品（如低、中、高濃度），覆蓋臨床診斷區(qū)間。

(2)質(zhì)控限：設定±10%的允許偏差?？筛鶕?jù)實際情況（如檢測項目、儀器穩(wěn)定性）調(diào)整。

(3)異常處理：超出范圍需重新檢測，分析原因（如試劑、環(huán)境、儀器），直至結(jié)果穩(wěn)定后方可發(fā)出報告。

2.室間質(zhì)評：參與第三方組織的比對檢測。

(1)參評頻率：每季度參與一次，或根據(jù)需要增加頻率。

(2)結(jié)果分析：評估實驗室準確性，與其他實驗室進行比較，發(fā)現(xiàn)自身操作中的問題并進行改進。

（二）結(jié)果報告規(guī)范

1.報告內(nèi)容：

(1)基本信息：樣本編號、患者姓名（或代號）、檢測項目、檢測日期、參考范圍（需注明是批內(nèi)參考值還是文獻參考值）、檢測方法。

(2)結(jié)果數(shù)值：列出原始數(shù)據(jù)和計算值。對于定量項目，給出具體數(shù)值和單位（如ng/mL,U/mL,%）；對于半定量或分類項目，給出具體結(jié)果（如陽性/陰性,強陽性/弱陽性）。

(3)臨床意義：提供簡要解讀建議，但避免給出具體的診斷結(jié)論。例如，“CD4+T淋巴細胞計數(shù)偏低，提示免疫功能可能受影響，建議結(jié)合其他指標和臨床癥狀綜合判斷”。

2.報告發(fā)放：

(1)電子版?zhèn)鬏敚和ㄟ^LIS（實驗室信息系統(tǒng)）系統(tǒng)自動推送至臨床科室或患者信息系統(tǒng)。

(2)紙質(zhì)版簽發(fā)：實驗室負責人審核簽字，確保報告準確無誤后發(fā)出。紙質(zhì)報告需存檔備查。

五、安全防護與廢棄物處理

在操作過程中需嚴格遵守生物安全規(guī)范。

（一）個人防護

1.試劑防護：配置化學防護眼鏡和手套。處理強酸、強堿、有毒試劑時，需佩戴耐化學腐蝕的手套和面罩。

2.污染防護：穿戴一次性工作服和口罩。在生物安全柜內(nèi)進行開放性操作時，應佩戴口罩。

3.侵入性操作：使用無菌針頭和注射器。操作過程中注意防止針刺傷。

4.人體工學：注意操作姿勢，避免長時間重復性勞動導致肌肉骨骼損傷。

（二）廢棄物處理

1.化學廢棄物：收集后交由專業(yè)機構(gòu)處理。分類收集，如酸性廢液、堿性廢液、有機溶劑廢液等，貼上標簽，不得隨意傾倒。

2.生物廢棄物：高壓滅菌后焚燒處理。所有含有或可能含有病原體的樣本（如血液、組織、培養(yǎng)液）及被污染的物品（如針頭、手套、棉簽）均需視為生物廢棄物。高壓滅菌參數(shù)需符合規(guī)定（如121℃，15分鐘）。

3.廢棄樣本：滅活處理后按醫(yī)療廢物處置。如需保留樣本，應先進行滅活處理（如高壓滅菌、甲醛固定），然后按照醫(yī)療廢物規(guī)定進行分類收集和處置。

4.廢棄試劑和耗材：過期或廢棄的試劑需按照其性質(zhì)進行分類處理。一次性耗材（如移液器吸頭、試管）需統(tǒng)一收集到指定容器中，作為醫(yī)療廢物處理。

一、免疫學診療操作概述

免疫學診療是指通過一系列檢測手段，評估個體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)，為疾病診斷、治療監(jiān)測及健康評估提供依據(jù)。規(guī)范的診療操作是確保結(jié)果準確性和臨床應用價值的關(guān)鍵。本操作安排旨在提供一套系統(tǒng)化、標準化的流程，涵蓋從樣本采集到結(jié)果解讀的全過程。

（一）免疫學診療的目的與意義

1.疾病診斷輔助：通過檢測特定免疫指標，協(xié)助醫(yī)生對自身免疫性疾病、感染性疾病等進行初步判斷。

2.治療效果監(jiān)測：動態(tài)跟蹤患者免疫狀態(tài)變化，評估治療方案的有效性。

3.風險評估：識別個體感染、腫瘤等風險，為預防性干預提供參考。

（二）免疫學診療的操作原則

1.標準化流程：所有操作均需遵循既定規(guī)程，確保一致性。

2.質(zhì)量控制：設立多重質(zhì)控點，減少誤差可能。

3.安全規(guī)范：嚴格遵守生物安全要求，保護患者隱私。

二、樣本采集與處理

規(guī)范的樣本采集和處理是保證免疫學檢測結(jié)果準確性的基礎環(huán)節(jié)。

（一）樣本類型與采集要求

1.血液樣本：

(1)采集量：通常需3-5ml，根據(jù)具體檢測項目調(diào)整。

(2)抗凝劑選擇：EDTA-K2為常用，需避免肝素等干擾物質(zhì)。

(3)采集時間：建議空腹，晨起6-8小時后采集。

2.組織樣本：

(1)取材部位：需根據(jù)臨床需求選擇，如淋巴結(jié)、皮膚等。

(2)保存條件：立即置于4℃保存，超過2小時需采用RNAlater固定。

（二）樣本處理流程

1.血液樣本處理：

(1)充分混勻：采集后立即顛倒混勻8-10次。

(2)離心分離：3000rpm離心5分鐘，分離血清或血漿。

(3)分裝保存：-80℃保存，長期檢測建議分裝。

2.組織樣本處理：

(1)固定：10%中性緩沖甲醛溶液浸泡24小時。

(2)石蠟包埋：常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。

(3)切片：4μm厚度切片，HE染色備用。

三、免疫學檢測方法與操作

根據(jù)檢測需求選擇合適的免疫學方法，以下列舉幾種常見操作。

（一）流式細胞術(shù)檢測

1.儀器準備：

(1)預熱儀器：開機后需預熱30分鐘以上。

(2)校準設置：使用標準品校準熒光通道和閾值。

2.試劑配制：

(1)單克隆抗體：按說明書比例稀釋，避光保存。

(2)FACS溶血劑：新鮮配制，避免反復凍融。

3.樣本染色步驟：

(1)固定：冰凍固定10分鐘。

(2)染色：加入抗體，4℃孵育30分鐘。

(3)清洗：PBS清洗2次，每次5分鐘。

4.數(shù)據(jù)采集與分析：

(1)設門：根據(jù)細胞特征設立分析區(qū)域。

(2)參數(shù)設置：CD3+/CD4+/CD8+等常規(guī)指標。

(3)統(tǒng)計處理：使用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

（二）ELISA檢測

1.試劑盒準備：

(1)檢測標準：使用標準曲線計算濃度。

(2)試劑平衡：室溫放置30分鐘。

2.加樣操作：

(1)底物孵育：37℃避光孵育30分鐘。

(2)終止反應：加入硫酸終止液，混勻。

3.結(jié)果判讀：

(1)定性檢測：顏色變化判斷陽性陰性。

(2)定量檢測：酶標儀測定OD值，繪制標準曲線。

四、質(zhì)量控制與結(jié)果報告

嚴格的質(zhì)量控制體系是確保免疫學診療結(jié)果可靠性的保障。

（一）室內(nèi)質(zhì)量控制

1.日間質(zhì)控：每日檢測質(zhì)控品，監(jiān)控波動范圍。

(1)質(zhì)控限：設定±10%的允許偏差。

(2)異常處理：超出范圍需重新檢測。

2.室間質(zhì)評：參與第三方組織的比對檢測。

(1)參評頻率：每季度參與一次。

(2)結(jié)果分析：評估實驗室準確性。

（二）結(jié)果報告規(guī)范

1.報告內(nèi)容：

(1)基本信息：樣本編號、檢測項目、參考值。

(2)結(jié)果數(shù)值：列出原始數(shù)據(jù)和計算值。

(3)臨床意義：提供簡要解讀建議。

2.報告發(fā)放：

(1)電子版?zhèn)鬏敚和ㄟ^LIS系統(tǒng)自動推送。

(2)紙質(zhì)版簽發(fā)：實驗室負責人審核簽字。

五、安全防護與廢棄物處理

在操作過程中需嚴格遵守生物安全規(guī)范。

（一）個人防護

1.試劑防護：配置化學防護眼鏡和手套。

2.污染防護：穿戴一次性工作服和口罩。

3.侵入性操作：使用無菌針頭和注射器。

（二）廢棄物處理

1.化學廢棄物：收集后交由專業(yè)機構(gòu)處理。

2.生物廢棄物：高壓滅菌后焚燒處理。

3.廢棄樣本：滅活處理后按醫(yī)療廢物處置。

一、免疫學診療操作概述

免疫學診療是指通過一系列檢測手段，評估個體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)，為疾病診斷、治療監(jiān)測及健康評估提供依據(jù)。規(guī)范的診療操作是確保結(jié)果準確性和臨床應用價值的關(guān)鍵。本操作安排旨在提供一套系統(tǒng)化、標準化的流程，涵蓋從樣本采集到結(jié)果解讀的全過程。

（一）免疫學診療的目的與意義

1.疾病診斷輔助：通過檢測特定免疫指標，協(xié)助醫(yī)生對自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡）、感染性疾?。ㄈ缃Y(jié)核病、艾滋病窗口期檢測）、過敏性疾病等進行初步判斷或鑒別診斷。例如，檢測血清中的類風濕因子（RF）和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP）有助于類風濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷；CD4+T淋巴細胞計數(shù)是評估HIV感染者免疫狀態(tài)和指導抗病毒治療的重要指標。

2.治療效果監(jiān)測：動態(tài)跟蹤患者免疫狀態(tài)變化，評估治療方案（如化療、免疫抑制劑、疫苗）的有效性。例如，在自身免疫性疾病患者中，監(jiān)測治療前后血清中自身抗體滴度或炎癥因子的變化；在腫瘤患者接受免疫治療（如PD-1抑制劑）后，可通過檢測腫瘤相關(guān)抗原、免疫細胞浸潤情況等指標來評估療效。

3.風險評估：識別個體感染、腫瘤等風險，為預防性干預提供參考。例如，檢測細胞免疫功能（如NK細胞活性）可評估個體對病毒感染的風險；某些腫瘤標志物（如癌胚抗原CEA，盡管其特異性不高，但仍可作為某些癌癥的輔助監(jiān)測指標）的動態(tài)變化有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和復發(fā)監(jiān)測。

（二）免疫學診療的操作原則

1.標準化流程：所有操作均需遵循既定規(guī)程，確保一致性。這意味著從樣本接收、處理、檢測到結(jié)果報告的每一個環(huán)節(jié)都應有明確的SOP（標準操作程序），并使用經(jīng)過驗證的試劑和儀器。例如，流式細胞術(shù)檢測中抗體濃度、孵育時間、固定劑使用等參數(shù)均需標準化。

2.質(zhì)量控制：設立多重質(zhì)控點，減少誤差可能。這包括使用質(zhì)控品（內(nèi)控）、參加室間質(zhì)量評價（外控），以及進行方法學驗證和儀器校準。質(zhì)控品的頻率（如每日、每周）和判定標準（如可接受誤差范圍）需明確規(guī)定。

3.安全規(guī)范：嚴格遵守生物安全要求，保護患者隱私。所有涉及人類樣本的操作必須在符合生物安全等級（通常為BSL-2）的實驗室進行，操作人員需穿戴適當?shù)膫€人防護裝備（PPE），如實驗服、手套、護目鏡等。樣本標識清晰、唯一，并嚴格保密患者信息。

二、樣本采集與處理

規(guī)范的樣本采集和處理是保證免疫學檢測結(jié)果準確性的基礎環(huán)節(jié)。不規(guī)范的采集和處理可能導致樣本溶血、細胞破壞、污染或降解，從而影響檢測結(jié)果。

（一）樣本類型與采集要求

1.血液樣本：

(1)采集量：通常需3-5ml，根據(jù)具體檢測項目調(diào)整。例如，流式細胞術(shù)通常需要2-3ml全血，而血清學檢測（如ELISA）可能需要3-5ml，以便分離出足夠的血清或血漿。特殊項目（如細胞因子檢測）可能需要更大體積或特殊處理。

(2)抗凝劑選擇：EDTA-K2為常用，適用于大多數(shù)細胞計數(shù)和分選項目；肝素適用于凝血功能檢查和某些細胞因子檢測，但可能干擾某些化學發(fā)光檢測；檸檬酸鈉適用于凝血功能檢測（PT,APTT）。需根據(jù)檢測目的選擇合適的抗凝劑，并確保其濃度準確無誤。避免使用肝素等可能干擾后續(xù)檢測的試劑。

(3)采集時間：建議空腹，晨起6-8小時后采集。避免進食高脂食物、飲酒，以免影響某些指標（如血脂、C反應蛋白）。部分檢測項目對采集時間有特殊要求，如糖化血紅蛋白需在持續(xù)血糖控制狀態(tài)下采集。

(4)采集方法：使用無菌干燥注射器抽取，避免震蕩，防止紅細胞破壞。首次穿刺失敗后不宜立即再次嘗試，應更換部位或重新采集。

(5)標記要求：樣本采集后立即在管壁上清晰、牢固地標記患者信息（包括姓名、ID號、采集日期和時間、抗凝劑類型），與樣本標簽一一對應，防止混淆。

2.組織樣本：

(1)取材部位：需根據(jù)臨床需求選擇，如淋巴結(jié)（superficial,deep）、皮膚（病變部位、正常皮膚）、骨髓（穿刺部位）、腫瘤組織（新鮮或石蠟）等。取材應包含足夠的目標細胞或組織量。

(2)保存條件：立即置于4℃保存，超過2小時需采用RNAlater固定。對于需要長期保存或進行分子生物學檢測的組織，應立即置于RNAlater溶液或液氮中。對于石蠟包埋，需盡快完成固定、脫水、透明、浸蠟、包埋全過程，一般不超過24小時。

（二）樣本處理流程

1.血液樣本處理：

(1)充分混勻：采集后立即顛倒混勻8-10次，確?？鼓齽┡c血液充分作用，防止血液凝固或細胞聚集。

(2)離心分離：3000rpm離心5分鐘，分離血清或血漿。離心速度和時間需根據(jù)樣本量和抗凝劑類型調(diào)整，避免過度離心導致細胞破壞。血清通常用于大多數(shù)化學發(fā)光和ELISA檢測；血漿（經(jīng)抗凝劑滅活處理后）用于某些蛋白檢測。

(3)分裝保存：-80℃保存，長期檢測建議分裝，避免反復凍融對樣本造成損傷。首次凍存前可進行快速冷凍（如真空冷凍干燥），減少冰晶形成。記錄凍存日期和位置。

2.組織樣本處理：

(1)固定：10%中性緩沖甲醛溶液（pH7.4）浸泡24小時。固定是組織學檢測的關(guān)鍵步驟，需確保固定劑完全滲透組織。固定時間一般不超過24-48小時，過長可能導致組織變硬、染色困難。

(2)石蠟包埋：常規(guī)脫水（梯度乙醇）、透明（二甲苯）、浸蠟（石蠟）、包埋。脫水步驟需逐步增加乙醇濃度，避免組織損傷。包埋塊應大小適中，便于切片。

(3)切片：4μm厚度切片，HE染色備用。切片厚度影響觀察效果，4μm是常用厚度。切片機需定期維護，確保切片平整。HE染色是基礎染色方法，用于觀察組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)。

三、免疫學檢測方法與操作

根據(jù)檢測需求選擇合適的免疫學方法，以下列舉幾種常見操作。

（一）流式細胞術(shù)檢測

1.儀器準備：

(1)預熱儀器：開機后需預熱30分鐘以上，使激光器、檢測器和流體系統(tǒng)達到穩(wěn)定工作狀態(tài)。

(2)校準設置：使用標準品校準熒光通道和閾值。熒光校準確保不同顏色熒光信號的準確測量；閾值校準防止細胞被錯誤判讀。校準通常每日或每周進行一次，根據(jù)儀器使用頻率和穩(wěn)定性調(diào)整。

2.試劑配制：

(1)單克隆抗體：按說明書比例稀釋，避光保存?？贵w稀釋應在無菌條件下進行，使用預溫的稀釋液（如PBS含0.1%疊氮鈉）。不同抗體的最佳工作濃度需通過預實驗確定。

(2)FACS溶血劑：新鮮配制，避免反復凍融。溶血劑用于去除紅細胞，避免其干擾白細胞檢測。使用前需確認其有效性和穩(wěn)定性。

3.樣本染色步驟：

(1)固定：冰凍固定10分鐘。使用固定液（如多聚甲醛）使細胞膜穩(wěn)定，防止細胞變形或細胞內(nèi)成分泄漏。

(2)染色：加入抗體，4℃孵育30分鐘。孵育溫度和時間需根據(jù)抗體說明書優(yōu)化。4℃孵育有助于抗體與細胞表面抗原結(jié)合更充分。避免光照。

(3)清洗：PBS清洗2次，每次5分鐘。清洗去除未結(jié)合的抗體，減少非特異性結(jié)合帶來的背景干擾。每次清洗后需充分離心（如1000rpm,5分鐘）去除上清。

(4)細胞permeabilization(如需)：對于檢測細胞內(nèi)抗原（如胞內(nèi)細胞因子、磷酸化蛋白），需使用破膜劑（如Paraformaldehyde/permeabilizationbuffer）處理細胞，使抗體能夠進入細胞內(nèi)部。

4.數(shù)據(jù)采集與分析：

(1)設門：根據(jù)細胞特征設立分析區(qū)域。通過FSC/SSC散點圖初步篩選目標細胞群體（如淋巴細胞群），設立合理的分析窗口，排除死細胞、細胞碎片等干擾。

(2)參數(shù)設置：CD3+/CD4+/CD8+等常規(guī)指標。根據(jù)檢測目的選擇合適的熒光標記抗體組合，設置相應的檢測參數(shù)（如激發(fā)波長、發(fā)射波長）。

(3)統(tǒng)計處理：使用FlowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。對Gates的有效性進行評估，計算各亞群細胞的百分比和絕對數(shù)值（需結(jié)合樣本量計算）。進行統(tǒng)計學分析，比較不同組間差異。

（二）ELISA檢測

1.試劑盒準備：

(1)檢測標準：使用標準品繪制標準曲線。標準品的濃度需準確，且在檢測范圍內(nèi)。至少使用5個濃度梯度繪制標準曲線。

(2)試劑平衡：室溫放置30分鐘。所有試劑（洗滌液、底物等）需與室溫平衡，避免因溫差導致反應條件不一致。

2.加樣操作：

(1)加樣：嚴格按照說明書加入樣本、標準品、酶標抗體（如適用）、生物素標記物（如適用）和底物。使用移液器，確保加樣準確。建議使用多孔移液器，提高加樣效率。

(2)底物孵育：37℃避光孵育30分鐘。孵育溫度和時間需根據(jù)說明書優(yōu)化。避光是為了防止酶促反應過快，得到線性關(guān)系較好的標準曲線。

(3)終止反應：加入硫酸終止液，混勻。終止液的作用是使酶促反應停止，并使反應產(chǎn)物顏色穩(wěn)定，便于在酶標儀上讀取?；靹虼_保溶液顏色均勻。

3.結(jié)果判讀：

(1)定性檢測：顏色變化判斷陽性陰性。通過肉眼觀察或設置閾值進行判斷。適用于快速篩查。

(2)定量檢測：酶標儀測定OD值，繪制標準曲線，計算樣本濃度。使用酶標儀在規(guī)定的波長下測定吸光度值（OD值）。根據(jù)標準曲線方程（Y=AX+B）計算樣本濃度（X）。注意OD值應在酶標儀的線性范圍內(nèi)。

（三）WesternBlotting檢測

1.樣本制備：

(1)蛋白提?。菏褂昧呀饩彌_液（含去垢劑、蛋白酶抑制劑）提取組織或細胞總蛋白。確保裂解充分，避免細胞聚集。

(2)蛋白定量：使用BCA或Bradford法測定樣本蛋白濃度。精確的蛋白濃度是后續(xù)電泳加載量準確的前提。

2.SDS電泳：

(1)凝膠制備：根據(jù)目標蛋白分子量選擇合適的百分比聚丙烯酰胺凝膠。

(2)樣本加載：根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，通常20-50μg/泳道。

(3)電泳：設定合適的電壓和時間進行電泳，使蛋白按分子量大小分離。

3.轉(zhuǎn)膜：

(1)轉(zhuǎn)膜條件：設置合適的電壓和濕轉(zhuǎn)時間，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF或N