免疫學(xué)常見問題應(yīng)對對策###一、免疫學(xué)常見問題概述

免疫學(xué)是研究機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、機(jī)制及其相關(guān)疾病的科學(xué)。在日常學(xué)習(xí)、研究和臨床應(yīng)用中，常會遇到各種免疫學(xué)相關(guān)問題。本指南旨在系統(tǒng)梳理免疫學(xué)常見問題，并提供相應(yīng)的應(yīng)對對策，幫助讀者更高效地理解和應(yīng)用免疫學(xué)知識。

###二、免疫學(xué)基礎(chǔ)知識要點(diǎn)

####（一）免疫系統(tǒng)組成與功能

1.**免疫系統(tǒng)組成**

-**中樞免疫器官**：骨髓、胸腺，負(fù)責(zé)免疫細(xì)胞的生成和成熟。

-**外周免疫器官**：淋巴結(jié)、脾臟、黏膜相關(guān)淋巴組織，負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)。

-**免疫細(xì)胞**：T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等。

-**免疫分子**：抗體、細(xì)胞因子、補(bǔ)體系統(tǒng)等。

2.**免疫系統(tǒng)功能**

-**免疫防御**：清除病原體和異常細(xì)胞。

-**免疫自穩(wěn)**：維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

-**免疫監(jiān)視**：檢測和清除早期腫瘤細(xì)胞。

####（二）免疫應(yīng)答機(jī)制

1.**固有免疫應(yīng)答**

-**識別**：通過模式識別受體（PRRs）識別病原體通用分子模式（PAMPs）。

-**反應(yīng)**：快速啟動炎癥反應(yīng)，招募免疫細(xì)胞至感染部位。

2.**適應(yīng)性免疫應(yīng)答**

-**T細(xì)胞應(yīng)答**：

-**識別**：CD4+輔助T細(xì)胞（Th）和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）通過T細(xì)胞受體（TCR）識別抗原。

-**活化**：需抗原提呈細(xì)胞（APC）提呈抗原并協(xié)同刺激信號。

-**B細(xì)胞應(yīng)答**：

-**識別**：B細(xì)胞受體（BCR）識別抗原。

-**活化**：需T輔助細(xì)胞（Th）提供幫助，分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。

###三、免疫學(xué)常見問題及應(yīng)對策略

####（一）免疫缺陷病的診斷與治療

1.**診斷方法**

-**臨床評估**：觀察反復(fù)感染、自身免疫病等癥狀。

-**免疫功能檢測**：

-**細(xì)胞計(jì)數(shù)**：外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板等。

-**功能實(shí)驗(yàn)**：遲發(fā)型超敏試驗(yàn)（DTH）、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（LST）。

2.**治療策略**

-**替代療法**：如靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）。

-**免疫重建**：骨髓移植、基因治療。

-**感染預(yù)防**：疫苗接種、抗生素預(yù)防性使用。

####（二）過敏性疾病的管理

1.**病因識別**

-**過敏原檢測**：皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、血清特異性IgE檢測。

2.**治療措施**

-**避免過敏原**：環(huán)境控制、飲食調(diào)整。

-**藥物治療**：

-**抗組胺藥**：第一代（如氯苯那敏）和第二代（如西替利嗪）。

-**糖皮質(zhì)激素**：局部或吸入給藥。

-**免疫療法**：脫敏治療，逐步提高對過敏原的耐受性。

####（三）自身免疫病的應(yīng)對

1.**疾病監(jiān)測**

-**自身抗體檢測**：如抗核抗體（ANA）、類風(fēng)濕因子（RF）。

-**影像學(xué)檢查**：關(guān)節(jié)超聲、MRI等。

2.**治療原則**

-**控制免疫應(yīng)答**：

-**非甾體抗炎藥**：如布洛芬。

-**免疫抑制劑**：小劑量糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤。

-**靶向治療**：生物制劑如TNF-α抑制劑、JAK抑制劑。

###四、免疫學(xué)研究方法與實(shí)驗(yàn)技巧

####（一）免疫細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.**分離方法**

-**密度梯度離心**：利用Ficoll-Paque分離液分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）。

-**磁珠分選**：利用抗細(xì)胞表面標(biāo)志物的磁珠（如CD3+T細(xì)胞）分離目標(biāo)細(xì)胞。

2.**體外培養(yǎng)步驟**

-**準(zhǔn)備**：細(xì)胞培養(yǎng)基（如RPMI-1640）、血清、細(xì)胞因子。

-**操作**：

-步驟1：細(xì)胞洗滌，重懸于培養(yǎng)皿。

-步驟2：加入刺激物（如LPS、抗原肽），37°C、5%CO2培養(yǎng)48-72小時。

-步驟3：收集上清液檢測細(xì)胞因子水平或觀察細(xì)胞增殖。

####（二）抗體檢測技術(shù)

1.**酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）**

-**原理**：雙抗體夾心法檢測目標(biāo)蛋白。

-**步驟**：

-步驟1：包被抗體，4°C過夜。

-步驟2：洗滌，加入樣本。

-步驟3：洗滌，加入酶標(biāo)二抗，顯色檢測。

2.**流式細(xì)胞術(shù)（FCM）**

-**應(yīng)用**：檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD4+/CD8+比例）、細(xì)胞凋亡等。

-**關(guān)鍵點(diǎn)**：優(yōu)化抗體濃度（如CD3-PE0.5μg/mL）、設(shè)置同型對照排除非特異性結(jié)合。

###五、免疫學(xué)學(xué)習(xí)與研究方向建議

1.**學(xué)習(xí)資源**

-**經(jīng)典教材**：《免疫學(xué)原理》（Kuby）、《免疫學(xué)》（Pryer）。

-**數(shù)據(jù)庫**：PubMed、ImmPort（免疫學(xué)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫）。

2.**研究前沿**

-**免疫治療**：CAR-T細(xì)胞療法、免疫檢查點(diǎn)抑制劑。

-**微生物組與免疫**：腸道菌群對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

本指南系統(tǒng)總結(jié)了免疫學(xué)常見問題的應(yīng)對策略，涵蓋了基礎(chǔ)知識、臨床應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)技術(shù)及研究方向。通過掌握這些內(nèi)容，讀者可更深入地理解和應(yīng)用免疫學(xué)知識，提升相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)踐能力。

###四、免疫學(xué)研究方法與實(shí)驗(yàn)技巧（續(xù)）

####（一）免疫細(xì)胞分離與培養(yǎng)（續(xù)）

1.**分離方法（續(xù)）**

-**細(xì)胞粘附分離**：

-**原理**：利用某些免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）在特定培養(yǎng)表面（如塑料）上的粘附特性進(jìn)行分離。

-**操作**：

-步驟1：收集外周血或組織樣本，制成單細(xì)胞懸液。

-步驟2：將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿或特異性粘附柱（如塑料柱）。

-步驟3：非粘附細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞）流出，粘附細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）保留。

-步驟4：用酶（如胰蛋白酶）消化去除粘附細(xì)胞，收集流出液即得非粘附細(xì)胞。

-**免疫磁珠分選（MACS）優(yōu)化**：

-**關(guān)鍵參數(shù)**：

-抗體用量：根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)整（如CD19+B細(xì)胞需0.5-1μg/mLCD19抗體）。

-磁場強(qiáng)度：確保細(xì)胞充分通過磁場區(qū)域（如8特斯拉磁鐵）。

-洗滌次數(shù)：通常3-4次，避免抗體殘留影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.**體外培養(yǎng)步驟（續(xù)）**

-**T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)**：

-**目的**：評估T細(xì)胞活化狀態(tài)或藥物抑制效果。

-**詳細(xì)步驟**：

-步驟1：分離PBMCs，用流式細(xì)胞術(shù)篩選純度≥95%的CD3+T細(xì)胞。

-步驟2：調(diào)整細(xì)胞密度（如1×106/mL）接種于96孔板。

-步驟3：加入刺激物：

-刺激組：抗CD3抗體（如OKT3，5μg/mL）+抗CD28抗體（2μg/mL）。

-對照組：僅培養(yǎng)基或抗CD3抗體。

-步驟4：37°C、5%CO2培養(yǎng)，每日計(jì)數(shù)細(xì)胞或第4天加入3H-TdR（比活度≥30Ci/mmol）培養(yǎng)18小時。

-步驟5：收獲培養(yǎng)液，液氮凍存待測。

-步驟6：用液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測3H-TdR摻入量。

-**B細(xì)胞分化的條件優(yōu)化**：

-**IgM分泌誘導(dǎo)**：

-步驟1：分離CD19+B細(xì)胞，用CD3-decoy抗體（阻斷T細(xì)胞干擾）。

-步驟2：加入LPS（100ng/mL）+IL-4（10ng/mL），培養(yǎng)7天。

-步驟3：收集上清，用ELISA檢測IgM水平（抗體效價(jià)≥1:1000）。

-**類別轉(zhuǎn)換條件**：

-Th2輔助：IL-4（10ng/mL）+anti-CD40L（1μg/mL）。

-Th1輔助：IFN-γ（10ng/mL）+PMA（50ng/mL）+離子霉素（1μg/mL）。

####（二）抗體檢測技術(shù)（續(xù)）

1.**WesternBlot優(yōu)化**

-**原理**：檢測細(xì)胞裂解物中目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

-**關(guān)鍵步驟**：

-**樣本處理**：

-步驟1：細(xì)胞用RIPA裂解液（含PMSF1mM）冰上裂解30分鐘。

-步驟2：BCA法測定蛋白濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線r2≥0.99）。

-步驟3：變性后行SDS（分離度≥1.5cm）。

-**膜封閉**：

-步驟1：轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉TBST封閉2小時（TBST含0.05%Tween-20）。

-步驟2：更換封閉液（1%BSA）延長至4°C過夜。

-**抗體孵育**：

-步驟1：一抗（如兔抗β-actin，1:1000）4°C孵育12小時。

-步驟2：TBST洗滌3次×10分鐘，二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔，1:5000）室溫1小時。

-**信號檢測**：

-步驟1：化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）避光孵育5分鐘。

-步驟2：用成像系統(tǒng)（曝光時間1-3秒）采集圖像。

-**數(shù)據(jù)分析**：

-步驟1：用ImageJ軟件灰度值標(biāo)準(zhǔn)化（以β-actin為內(nèi)參）。

-步驟2：計(jì)算靶蛋白相對表達(dá)量（變化倍數(shù)±SEM，n≥3）。

2.**細(xì)胞因子流式多色檢測**

-**應(yīng)用場景**：同時檢測多種細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-10）。

-**操作要點(diǎn)**：

-**抗體組合**：

-CD3-FITC（輔助分選T細(xì)胞）。

-IL-6-PE（黃色）、TNF-α-APC（紅色）、IL-10-PerCP-Cy5.5（紫色）。

-**對照設(shè)置**：

-同型對照（IgG同型抗體）：排除非特異性結(jié)合（如CD3-IgG2a-PE）。

-空白對照：未染色細(xì)胞（用于背景校正）。

-**數(shù)據(jù)采集**：

-設(shè)定門區(qū)：CD3+T細(xì)胞（≥1%門選）。

-用10,000個事件采集，PFL閾值調(diào)整至低于5%陽性細(xì)胞。

-**結(jié)果解讀**：

-計(jì)算百分比陽性細(xì)胞（如IL-6陽性細(xì)胞占比35%）。

-比較刺激組與對照組的平均熒光強(qiáng)度（MFI，如TNF-αMFI1200vs300）。

####（三）免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)

1.**染色流程標(biāo)準(zhǔn)化**

-**步驟1：樣本固定與包埋**

-新鮮組織立即用4%多聚甲醛（pH7.4）固定24小時，石蠟包埋。

-切片厚度：4-5μm，烤片后脫蠟至水。

-**步驟2：抗原修復(fù)**

-冷修復(fù)：0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），微波加熱9分鐘。

-熱修復(fù)：EDTA緩沖液（pH8.0），98°C孵育20分鐘。

-**步驟3：阻斷內(nèi)源性過氧化物酶**

-3%H2O2甲醇溶液，室溫孵育10分鐘。

-**步驟4：血清封閉**

-10%正常山羊血清（BSA），室溫孵育30分鐘，防止非特異性結(jié)合。

-**步驟5：一抗孵育**

-鼠抗人CD8（1:100稀釋），4°C過夜，濕盒保存。

-**步驟6：生物素化二抗**

-生物素化羊抗鼠IgG（1:200），37°C孵育60分鐘。

-**步驟7：SABC孵育**

-SABC工作液（即用型），37°C孵育30分鐘。

-**步驟8：DAB顯色**

-DAB顯色液（含H2O2），顯微鏡下觀察至陽性細(xì)胞呈棕褐色。

-控制顯色時間（如5-10分鐘），避免背景過深。

-**步驟9：復(fù)染與封片**

-蘇木素復(fù)染細(xì)胞核（1分鐘），脫水透明，中性樹膠封片。

2.**質(zhì)量控制要點(diǎn)**

-**陰性對照**：用PBS代替一抗，排除非特異性染色。

-**陽性對照**：已知表達(dá)該抗原的細(xì)胞系切片（如SP2/0細(xì)胞CD8染色）。

-**抗體優(yōu)化**：測試不同稀釋度（1:50-1:500），選擇最佳結(jié)合度（陽性細(xì)胞清晰，背景低）。

-**系統(tǒng)性偏倚評估**：使用Image-ProPlus軟件分析染色強(qiáng)度（0-255分）和分布（平均光密度MAD≤15）。

###五、免疫學(xué)學(xué)習(xí)與研究方向建議（續(xù)）

1.**學(xué)習(xí)資源（續(xù)）**

-**實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊**：

-《CurrentProtocolsinImmunology》（Wiley）。

-《MethodsinMolecularBiology:ImmunologyMethodsChapter》（HumanaPress）。

-**在線課程**：

-Coursera（如"Immunology"byHarvardUniversity）。

-NatureEducation（Scitable免疫學(xué)專題）。

2.**研究前沿（續(xù)）**

-**腫瘤免疫治療新策略**：

-腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）療法：優(yōu)化體外擴(kuò)增條件（如IL-2、IL-7、IL-15組合）。

-腫瘤相關(guān)抗原（TAA）肽疫苗設(shè)計(jì)：基于MHC-I類/II類預(yù)測算法篩選高免疫原性肽段。

-**微生物-免疫互作機(jī)制**：

-**方法**：

-16SrRNA測序分析腸道菌群組成（如厚壁菌門占比≥60%）。

-代謝組學(xué)檢測短鏈脂肪酸（SCFA，如丁酸濃度≥10μM）。

-命中分析篩選菌群代謝物靶點(diǎn)（如丁酸酯酶B4活性≥50%）。

-**模型**：構(gòu)建無菌小鼠定植實(shí)驗(yàn)，比較不同菌群對免疫細(xì)胞（如CD4+T細(xì)胞分化）的影響。

本部分進(jìn)一步擴(kuò)展了免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的操作細(xì)節(jié)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并補(bǔ)充了前沿研究方向的具體技術(shù)路徑。通過系統(tǒng)學(xué)習(xí)這些內(nèi)容，讀者可更高效地開展免疫學(xué)研究，并緊跟領(lǐng)域最新進(jìn)展。

###一、免疫學(xué)常見問題概述

免疫學(xué)是研究機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、機(jī)制及其相關(guān)疾病的科學(xué)。在日常學(xué)習(xí)、研究和臨床應(yīng)用中，常會遇到各種免疫學(xué)相關(guān)問題。本指南旨在系統(tǒng)梳理免疫學(xué)常見問題，并提供相應(yīng)的應(yīng)對對策，幫助讀者更高效地理解和應(yīng)用免疫學(xué)知識。

###二、免疫學(xué)基礎(chǔ)知識要點(diǎn)

####（一）免疫系統(tǒng)組成與功能

1.**免疫系統(tǒng)組成**

-**中樞免疫器官**：骨髓、胸腺，負(fù)責(zé)免疫細(xì)胞的生成和成熟。

-**外周免疫器官**：淋巴結(jié)、脾臟、黏膜相關(guān)淋巴組織，負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)。

-**免疫細(xì)胞**：T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等。

-**免疫分子**：抗體、細(xì)胞因子、補(bǔ)體系統(tǒng)等。

2.**免疫系統(tǒng)功能**

-**免疫防御**：清除病原體和異常細(xì)胞。

-**免疫自穩(wěn)**：維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

-**免疫監(jiān)視**：檢測和清除早期腫瘤細(xì)胞。

####（二）免疫應(yīng)答機(jī)制

1.**固有免疫應(yīng)答**

-**識別**：通過模式識別受體（PRRs）識別病原體通用分子模式（PAMPs）。

-**反應(yīng)**：快速啟動炎癥反應(yīng)，招募免疫細(xì)胞至感染部位。

2.**適應(yīng)性免疫應(yīng)答**

-**T細(xì)胞應(yīng)答**：

-**識別**：CD4+輔助T細(xì)胞（Th）和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）通過T細(xì)胞受體（TCR）識別抗原。

-**活化**：需抗原提呈細(xì)胞（APC）提呈抗原并協(xié)同刺激信號。

-**B細(xì)胞應(yīng)答**：

-**識別**：B細(xì)胞受體（BCR）識別抗原。

-**活化**：需T輔助細(xì)胞（Th）提供幫助，分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。

###三、免疫學(xué)常見問題及應(yīng)對策略

####（一）免疫缺陷病的診斷與治療

1.**診斷方法**

-**臨床評估**：觀察反復(fù)感染、自身免疫病等癥狀。

-**免疫功能檢測**：

-**細(xì)胞計(jì)數(shù)**：外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板等。

-**功能實(shí)驗(yàn)**：遲發(fā)型超敏試驗(yàn)（DTH）、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（LST）。

2.**治療策略**

-**替代療法**：如靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）。

-**免疫重建**：骨髓移植、基因治療。

-**感染預(yù)防**：疫苗接種、抗生素預(yù)防性使用。

####（二）過敏性疾病的管理

1.**病因識別**

-**過敏原檢測**：皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、血清特異性IgE檢測。

2.**治療措施**

-**避免過敏原**：環(huán)境控制、飲食調(diào)整。

-**藥物治療**：

-**抗組胺藥**：第一代（如氯苯那敏）和第二代（如西替利嗪）。

-**糖皮質(zhì)激素**：局部或吸入給藥。

-**免疫療法**：脫敏治療，逐步提高對過敏原的耐受性。

####（三）自身免疫病的應(yīng)對

1.**疾病監(jiān)測**

-**自身抗體檢測**：如抗核抗體（ANA）、類風(fēng)濕因子（RF）。

-**影像學(xué)檢查**：關(guān)節(jié)超聲、MRI等。

2.**治療原則**

-**控制免疫應(yīng)答**：

-**非甾體抗炎藥**：如布洛芬。

-**免疫抑制劑**：小劑量糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤。

-**靶向治療**：生物制劑如TNF-α抑制劑、JAK抑制劑。

###四、免疫學(xué)研究方法與實(shí)驗(yàn)技巧

####（一）免疫細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.**分離方法**

-**密度梯度離心**：利用Ficoll-Paque分離液分離外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）。

-**磁珠分選**：利用抗細(xì)胞表面標(biāo)志物的磁珠（如CD3+T細(xì)胞）分離目標(biāo)細(xì)胞。

2.**體外培養(yǎng)步驟**

-**準(zhǔn)備**：細(xì)胞培養(yǎng)基（如RPMI-1640）、血清、細(xì)胞因子。

-**操作**：

-步驟1：細(xì)胞洗滌，重懸于培養(yǎng)皿。

-步驟2：加入刺激物（如LPS、抗原肽），37°C、5%CO2培養(yǎng)48-72小時。

-步驟3：收集上清液檢測細(xì)胞因子水平或觀察細(xì)胞增殖。

####（二）抗體檢測技術(shù)

1.**酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）**

-**原理**：雙抗體夾心法檢測目標(biāo)蛋白。

-**步驟**：

-步驟1：包被抗體，4°C過夜。

-步驟2：洗滌，加入樣本。

-步驟3：洗滌，加入酶標(biāo)二抗，顯色檢測。

2.**流式細(xì)胞術(shù)（FCM）**

-**應(yīng)用**：檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD4+/CD8+比例）、細(xì)胞凋亡等。

-**關(guān)鍵點(diǎn)**：優(yōu)化抗體濃度（如CD3-PE0.5μg/mL）、設(shè)置同型對照排除非特異性結(jié)合。

###五、免疫學(xué)學(xué)習(xí)與研究方向建議

1.**學(xué)習(xí)資源**

-**經(jīng)典教材**：《免疫學(xué)原理》（Kuby）、《免疫學(xué)》（Pryer）。

-**數(shù)據(jù)庫**：PubMed、ImmPort（免疫學(xué)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫）。

2.**研究前沿**

-**免疫治療**：CAR-T細(xì)胞療法、免疫檢查點(diǎn)抑制劑。

-**微生物組與免疫**：腸道菌群對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

本指南系統(tǒng)總結(jié)了免疫學(xué)常見問題的應(yīng)對策略，涵蓋了基礎(chǔ)知識、臨床應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)技術(shù)及研究方向。通過掌握這些內(nèi)容，讀者可更深入地理解和應(yīng)用免疫學(xué)知識，提升相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)踐能力。

###四、免疫學(xué)研究方法與實(shí)驗(yàn)技巧（續(xù)）

####（一）免疫細(xì)胞分離與培養(yǎng)（續(xù)）

1.**分離方法（續(xù)）**

-**細(xì)胞粘附分離**：

-**原理**：利用某些免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）在特定培養(yǎng)表面（如塑料）上的粘附特性進(jìn)行分離。

-**操作**：

-步驟1：收集外周血或組織樣本，制成單細(xì)胞懸液。

-步驟2：將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿或特異性粘附柱（如塑料柱）。

-步驟3：非粘附細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞）流出，粘附細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）保留。

-步驟4：用酶（如胰蛋白酶）消化去除粘附細(xì)胞，收集流出液即得非粘附細(xì)胞。

-**免疫磁珠分選（MACS）優(yōu)化**：

-**關(guān)鍵參數(shù)**：

-抗體用量：根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)整（如CD19+B細(xì)胞需0.5-1μg/mLCD19抗體）。

-磁場強(qiáng)度：確保細(xì)胞充分通過磁場區(qū)域（如8特斯拉磁鐵）。

-洗滌次數(shù)：通常3-4次，避免抗體殘留影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.**體外培養(yǎng)步驟（續(xù)）**

-**T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)**：

-**目的**：評估T細(xì)胞活化狀態(tài)或藥物抑制效果。

-**詳細(xì)步驟**：

-步驟1：分離PBMCs，用流式細(xì)胞術(shù)篩選純度≥95%的CD3+T細(xì)胞。

-步驟2：調(diào)整細(xì)胞密度（如1×106/mL）接種于96孔板。

-步驟3：加入刺激物：

-刺激組：抗CD3抗體（如OKT3，5μg/mL）+抗CD28抗體（2μg/mL）。

-對照組：僅培養(yǎng)基或抗CD3抗體。

-步驟4：37°C、5%CO2培養(yǎng)，每日計(jì)數(shù)細(xì)胞或第4天加入3H-TdR（比活度≥30Ci/mmol）培養(yǎng)18小時。

-步驟5：收獲培養(yǎng)液，液氮凍存待測。

-步驟6：用液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測3H-TdR摻入量。

-**B細(xì)胞分化的條件優(yōu)化**：

-**IgM分泌誘導(dǎo)**：

-步驟1：分離CD19+B細(xì)胞，用CD3-decoy抗體（阻斷T細(xì)胞干擾）。

-步驟2：加入LPS（100ng/mL）+IL-4（10ng/mL），培養(yǎng)7天。

-步驟3：收集上清，用ELISA檢測IgM水平（抗體效價(jià)≥1:1000）。

-**類別轉(zhuǎn)換條件**：

-Th2輔助：IL-4（10ng/mL）+anti-CD40L（1μg/mL）。

-Th1輔助：IFN-γ（10ng/mL）+PMA（50ng/mL）+離子霉素（1μg/mL）。

####（二）抗體檢測技術(shù)（續(xù)）

1.**WesternBlot優(yōu)化**

-**原理**：檢測細(xì)胞裂解物中目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

-**關(guān)鍵步驟**：

-**樣本處理**：

-步驟1：細(xì)胞用RIPA裂解液（含PMSF1mM）冰上裂解30分鐘。

-步驟2：BCA法測定蛋白濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線r2≥0.99）。

-步驟3：變性后行SDS（分離度≥1.5cm）。

-**膜封閉**：

-步驟1：轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉TBST封閉2小時（TBST含0.05%Tween-20）。

-步驟2：更換封閉液（1%BSA）延長至4°C過夜。

-**抗體孵育**：

-步驟1：一抗（如兔抗β-actin，1:1000）4°C孵育12小時。

-步驟2：TBST洗滌3次×10分鐘，二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔，1:5000）室溫1小時。

-**信號檢測**：

-步驟1：化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）避光孵育5分鐘。

-步驟2：用成像系統(tǒng)（曝光時間1-3秒）采集圖像。

-**數(shù)據(jù)分析**：

-步驟1：用ImageJ軟件灰度值標(biāo)準(zhǔn)化（以β-actin為內(nèi)參）。

-步驟2：計(jì)算靶蛋白相對表達(dá)量（變化倍數(shù)±SEM，n≥3）。

2.**細(xì)胞因子流式多色檢測**

-**應(yīng)用場景**：同時檢測多種細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-10）。

-**操作要點(diǎn)**：

-**抗體組合**：

-CD3-FITC（輔助分選T細(xì)胞）。

-IL-6-PE（黃色）、TNF-α-APC（紅色）、IL-10-PerCP-Cy5.5（紫色）。

-**對照設(shè)置**：

-同型對照（IgG同型抗體）：排除非特異性結(jié)合（如CD3-IgG2a-PE）。

-空白對照：未染色細(xì)胞（用于背景校正）。

-**數(shù)據(jù)采集**：

-設(shè)定門區(qū)：CD3+T細(xì)胞（≥1%門選）。

-用10,000個事件采集，PFL閾值調(diào)整至低于5%陽性細(xì)胞。

-**結(jié)果解讀**：

-計(jì)算百分比陽性細(xì)胞（如IL-6陽性細(xì)胞占比35%）。

-比較刺激組與對照組的平均熒光強(qiáng)度（MFI，如TNF-αMFI1200vs300）。

####（三）免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)

1.**染色流程標(biāo)準(zhǔn)化**

-**步驟1：樣本固定與包埋**

-新鮮組織立即用4%多聚甲醛（pH7.4）固定24小時，石蠟包埋。

-切片厚度：4-5μm，烤片后脫蠟至水。

-**步驟2：抗原修復(fù)**

-冷修復(fù)：0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），微波加熱9分鐘。

-熱修復(fù)：EDTA緩沖液（pH8.0），98°C孵育20分鐘。

-**步驟3：阻斷內(nèi)源性過氧化物酶**

-3%H2O2甲醇溶液，室溫孵育10分鐘。

-**步驟4：血清封閉**

-10%正常山羊血清（BSA），室溫孵育30分鐘，防止非特異性結(jié)合。

-**步驟5：一抗孵育**

-鼠抗人CD8（1:100稀