免疫學(xué)診療操作細(xì)則一、概述

免疫學(xué)診療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要組成部分，通過檢測人體免疫系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)，輔助診斷疾病、評(píng)估病情和監(jiān)測治療效果。本細(xì)則旨在規(guī)范免疫學(xué)診療操作流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，提高診療效率。操作流程涵蓋樣本采集、處理、檢測、結(jié)果解讀及報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

二、樣本采集與處理

（一）樣本采集要求

1.采集前準(zhǔn)備：

(1)向受檢者說明采集目的和注意事項(xiàng)；

(2)檢查采集工具是否清潔、無菌；

(3)確認(rèn)受檢者處于空腹或按要求準(zhǔn)備狀態(tài)（如特定檢測需禁食）。

2.常用樣本類型及采集方法：

(1)全血樣本：采用靜脈穿刺法，采血量5-10ml，使用肝素抗凝管；

(2)血清樣本：采集后立即離心（3000rpm，5分鐘），分離血清置于EP管保存；

(3)體液樣本：如腦脊液、胸水等，使用無菌注射器抽取，避免污染。

3.樣本標(biāo)識(shí)：

(1)標(biāo)注受檢者姓名、ID、采集時(shí)間；

(2)使用條形碼或RFID標(biāo)簽減少錯(cuò)誤。

（二）樣本處理規(guī)范

1.全血樣本處理：

(1)立即混勻抗凝管，避免血細(xì)胞聚集；

(2)4℃保存，24小時(shí)內(nèi)完成檢測。

2.血清樣本處理：

(1)離心后取上清，避免溶血；

(2)-20℃凍存，避免反復(fù)凍融。

3.其他樣本處理：

(1)腦脊液樣本需立即檢測，避免細(xì)胞沉淀；

(2)泌尿系統(tǒng)樣本需在2小時(shí)內(nèi)完成培養(yǎng)或生化檢測。

三、檢測方法與流程

（一）常用檢測技術(shù)

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：

(1)試劑準(zhǔn)備：檢查酶標(biāo)板、抗體、底物是否在有效期內(nèi)；

(2)加樣順序：依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、酶標(biāo)抗體；

(3)結(jié)果判讀：使用酶標(biāo)儀測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

2.流式細(xì)胞術(shù)：

(1)設(shè)定門區(qū)：根據(jù)細(xì)胞特征劃分淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等亞群；

(2)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)：CD4+/CD8+比例、細(xì)胞因子分泌量等。

3.免疫印跡法：

(1)蛋白電泳分離；

(2)轉(zhuǎn)膜后雜交，化學(xué)發(fā)光顯色。

（二）操作步驟（以ELISA為例）

1.試劑與樣本準(zhǔn)備：

(1)檢測前用37℃水浴復(fù)溶試劑；

(2)樣本用移液器精確稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

2.加樣與孵育：

(1)依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、酶標(biāo)抗體；

(2)37℃孵育60分鐘，洗板3次（3000rpm，30秒/次）。

3.顯色與檢測：

(1)加入TMB底物，避光反應(yīng)30分鐘；

(2)用酶標(biāo)儀讀取450nm波長吸光度值。

四、結(jié)果解讀與報(bào)告

（一）結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.定量檢測：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，與參考范圍對(duì)比；

(1)正常值范圍（示例）：CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)300-1000個(gè)/μl，IgG水平7-16g/L。

2.半定量檢測：通過灰度值評(píng)估抗體強(qiáng)弱；

(1)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性。

（二）報(bào)告規(guī)范

1.報(bào)告內(nèi)容：受檢者信息、檢測項(xiàng)目、結(jié)果數(shù)值、參考范圍；

2.異常結(jié)果提示：標(biāo)注顯著偏離參考值的指標(biāo)，并建議復(fù)查或進(jìn)一步檢測。

五、質(zhì)量控制與安全

（一）質(zhì)量控制措施

1.日常質(zhì)控：每日使用質(zhì)控品，確保CV（變異系數(shù)）<5%；

2.定期校準(zhǔn)：每季度校準(zhǔn)儀器，記錄校準(zhǔn)參數(shù)。

（二）生物安全要求

1.操作人員需佩戴手套、口罩，避免樣本交叉污染；

2.化學(xué)廢棄物按規(guī)范處理，廢棄樣本高溫高壓滅菌。

**一、概述**

免疫學(xué)診療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要組成部分，通過檢測人體免疫系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)，輔助診斷疾病、評(píng)估病情和監(jiān)測治療效果。本細(xì)則旨在規(guī)范免疫學(xué)診療操作流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，提高診療效率。操作流程涵蓋樣本采集、處理、檢測、結(jié)果解讀及報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。熟悉并嚴(yán)格執(zhí)行本細(xì)則，有助于減少操作誤差，保障受檢者安全和檢測質(zhì)量。

**二、樣本采集與處理**

（一）樣本采集要求

1.采集前準(zhǔn)備：

(1)**核對(duì)受檢者信息**：確認(rèn)身份標(biāo)識(shí)（如姓名、出生日期、ID號(hào)），確保與樣本管標(biāo)簽一致，防止混淆。

(2)**解釋告知**：向受檢者或其家屬說明采集目的、流程、注意事項(xiàng)及可能的不適感，獲取知情同意。提醒受檢者按要求準(zhǔn)備（例如，某些檢測需空腹、停用特定藥物等）。

(3)**環(huán)境與工具檢查**：確保采集環(huán)境清潔、整潔，符合生物安全要求。檢查所有采集工具（注射器、針頭、采血管、試管架等）是否在有效期內(nèi)、包裝是否完好、無破損，并處于無菌狀態(tài)。采血管應(yīng)符合相應(yīng)檢測要求（如含肝素、EDTA、檸檬酸鈉等抗凝劑或促凝劑）。

(4)**手衛(wèi)生**：操作者必須進(jìn)行手衛(wèi)生，穿戴合規(guī)的個(gè)人防護(hù)用品（手套、口罩、帽子）。

2.常用樣本類型及采集方法：

(1)**全血樣本**：

-**采集方法**：通常采用靜脈穿刺法。選擇合適部位（如肘正中靜脈），消毒皮膚（通常使用70-75%乙醇棉簽，待干燥），按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程穿刺采血。采血量根據(jù)檢測項(xiàng)目要求而定，一般5-10ml，確保首次成功采足量。

-**抗凝選擇**：根據(jù)后續(xù)檢測方法選擇合適的抗凝管。常用如肝素鋰（適用于流式細(xì)胞術(shù)、某些化學(xué)發(fā)光檢測）、乙二胺四乙酸（EDTA）鉀（適用于血常規(guī)、免疫分型）、檸檬酸鈉（適用于凝血功能檢測，若免疫學(xué)檢測需凝血相關(guān)指標(biāo)則需注意）。

-**注意事項(xiàng)**：避免過度擠壓血管，防止組織液污染；采血后立即輕柔混勻血液與抗凝劑。

(2)**血清樣本**：

-**采集方法**：多采用靜脈采血法。采血后，將血液樣本置于室溫下靜置15-30分鐘（促凝管），或直接放入37℃水浴/恒溫箱孵育10-30分鐘（根據(jù)管材和檢測要求）。待充分凝固后，于3000-3500rpm離心5-10分鐘，分離血清。

-**處理**：小心吸取上層血清至無菌EP管中，避免吸到管底的紅細(xì)胞。可加入防腐劑（如疊氮鈉，若后續(xù)檢測需避光保存）。

-**保存**：血清樣本通常建議-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融，以減少蛋白變性。記錄凍存條件。

(3)**血漿樣本**：

-**采集方法**：靜脈采血后，立即加入相應(yīng)抗凝劑（如EDTA、肝素），充分混勻。無需孵育，立即高速離心（3000-3500rpm，10-15分鐘），分離血漿。

-**處理**：吸取上層血漿至無菌EP管，可加入防腐劑。血漿對(duì)溫度敏感，需根據(jù)檢測要求及時(shí)處理或凍存（通常-20℃）。

(4)**體液樣本**（如腦脊液、胸水、腹水、關(guān)節(jié)液等）：

-**采集方法**：使用無菌注射器和無菌穿刺針，按照臨床常規(guī)操作進(jìn)行采集。腦脊液通常采集3-5ml，胸水、腹水根據(jù)需要采集，關(guān)節(jié)液需嚴(yán)格無菌操作。

-**處理**：采集后應(yīng)立即送檢，或根據(jù)檢測項(xiàng)目要求進(jìn)行離心、保存處理。避免樣本凝固或污染。

3.樣本標(biāo)識(shí)與傳遞：

(1)**唯一標(biāo)識(shí)**：每個(gè)樣本必須使用唯一的標(biāo)識(shí)系統(tǒng)（如條形碼、RFID標(biāo)簽），標(biāo)識(shí)應(yīng)包含受檢者姓名、ID、樣本類型、采集時(shí)間等信息。確保樣本標(biāo)識(shí)與申請(qǐng)單信息完全一致。

(2)**清晰標(biāo)注**：在樣本管和外部容器上清晰、牢固地粘貼標(biāo)識(shí)，避免脫落或模糊。

(3)**記錄核對(duì)**：在樣本采集記錄單上詳細(xì)記錄樣本信息，并在傳遞過程中進(jìn)行核對(duì)。建立樣本追蹤系統(tǒng)，確保樣本從采集到檢測的全程可追溯。

(4)**安全傳遞**：樣本傳遞應(yīng)使用專用樣本車或傳遞箱，保持適宜的溫度（如血清/血漿需冷藏，細(xì)胞學(xué)樣本需室溫或特定條件），防止樣本在傳遞過程中變質(zhì)或發(fā)生意外。

（二）樣本處理規(guī)范

1.**全血樣本處理**：

(1)**抗凝管混勻**：采血后立即顛倒混勻5-10次（或按要求混勻），確?？鼓齽┡c血液充分接觸，防止血凝塊形成。

(2)**及時(shí)處理**：全血樣本（尤其是肝素抗凝管）需盡快處理。若無法立即檢測，應(yīng)置于4℃冰箱保存，但通常建議在4小時(shí)內(nèi)完成，避免白細(xì)胞活化等因素影響檢測結(jié)果。

(3)**白細(xì)胞裂解（如需）**：若后續(xù)檢測需分離血漿或DNA，而抗凝劑干擾，需進(jìn)行白細(xì)胞裂解處理，嚴(yán)格按照裂解劑說明書操作。

2.**血清/血漿樣本處理**：

(1)**離心條件**：確保離心速度和時(shí)間足夠，以完全分離血清/血漿。離心后應(yīng)靜置，避免上清液再次混入沉淀物。

(2)**分裝凍存**：對(duì)于需要長期保存的樣本，建議將血清/血漿分裝至小體積EP管中，減少反復(fù)凍融的次數(shù)。凍存管需標(biāo)注清晰。

(3)**避免反復(fù)凍融**：凍融過程可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、降解或溶血，影響檢測結(jié)果。樣本應(yīng)盡量一次性凍融使用。

3.**特殊樣本處理**：

(1)**細(xì)胞學(xué)樣本（如胸水、腦脊液）**：若需做細(xì)胞學(xué)檢查，應(yīng)立即涂片，固定（如95%乙醇或甲醇固定），或制備細(xì)胞塊進(jìn)行保存。

(2)**微生物培養(yǎng)樣本（如體液）**：需立即接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，并按微生物學(xué)規(guī)范處理和保存。

**三、檢測方法與流程**

（一）常用檢測技術(shù)

1.**酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）**：

(1)**原理**：基于抗原抗體特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記的抗體/抗原與底物反應(yīng)產(chǎn)生顯色，用酶標(biāo)儀測定吸光度，計(jì)算樣本中目標(biāo)物質(zhì)含量。

(2)**主要類型**：

-**競爭性ELISA**：樣本與標(biāo)準(zhǔn)品競爭結(jié)合有限量的酶標(biāo)抗體，適用于小分子抗原檢測。

-**雙抗體夾心ELISA**：最常用的格式，樣本中的抗原被兩層抗體捕獲，再與酶標(biāo)抗體結(jié)合，適用于大分子抗原檢測。

-**間接ELISA**：用于檢測抗體，樣本中的抗體與固相抗原結(jié)合，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合。

(3)**關(guān)鍵試劑**：酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體/抗原、酶底物（TMB、ABTS等）、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、洗滌液（通常是含有去離子水的洗滌緩沖液）、封閉液、阻斷劑。

(4)**操作要點(diǎn)**：

-**試劑準(zhǔn)備**：使用前檢查所有試劑是否在有效期內(nèi)，是否凍存/復(fù)溶正確。洗滌液需用蒸餾水或去離子水新鮮配制并過濾除菌。

-**板條處理**：仔細(xì)檢查酶標(biāo)板是否有破損、滲漏，必要時(shí)更換。按需進(jìn)行包被（加入抗原或抗體，4℃過夜或室溫2小時(shí)）、封閉（加入封閉液，室溫1-2小時(shí)），封閉液應(yīng)無色透明。

-**洗滌**：每次加樣前后及加完最后一道試劑后，均需用洗滌液充分洗滌（通常洗滌5-6次，每次300-500ml/min，每次靜置15-30秒后棄液，吸水紙邊緣輕拍去除殘留液體）。確保洗滌徹底，減少背景干擾。

-**加樣**：按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、酶標(biāo)抗體。加樣量需精確，避免氣泡。樣本需按說明書要求進(jìn)行稀釋。

-**孵育**：標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孵育時(shí)間通常為60-120分鐘，酶標(biāo)抗體孵育時(shí)間通常為30-60分鐘。孵育溫度通常為37℃，需避光。

-**顯色與終止**：加入酶底物，室溫避光孵育15-30分鐘（TMB顯色）。加入終止液（如H2SO4或HCl），終止反應(yīng)，使顏色變化穩(wěn)定。注意終止液顏色通常為黃色。

-**檢測**：立即用酶標(biāo)儀在指定波長（如TMB為450nm，參考波長為600-650nm）讀取吸光度值。確保樣品孔和空白孔讀數(shù)在酶標(biāo)儀的線性范圍內(nèi)。

2.**流式細(xì)胞術(shù)（FCM）**：

(1)**原理**：利用熒光標(biāo)記的抗體識(shí)別細(xì)胞表面的特定分子，通過激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)，結(jié)合液流系統(tǒng)，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速分析。

(2)**關(guān)鍵試劑與設(shè)置**：

-**熒光標(biāo)記抗體**：根據(jù)檢測目標(biāo)選擇合適的熒光標(biāo)記單抗，注意抗體濃度、熒光素種類（如PE,FITC,PerCP-Cy5.5,APC-Cy7）及對(duì)應(yīng)通道。

-**流式設(shè)置**：設(shè)定合適的門區(qū)（GatingStrategy）以排除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等干擾，準(zhǔn)確分析目標(biāo)細(xì)胞群。例如，在免疫分型中，可設(shè)置淋巴細(xì)胞門，再分別分析CD3+T細(xì)胞，其中進(jìn)一步分CD4+和CD8+亞群。

-**補(bǔ)償設(shè)置**：若使用多種熒光素標(biāo)記，需進(jìn)行熒光補(bǔ)償，消除熒光串色干擾。

(3)**操作要點(diǎn)**：

(1)**細(xì)胞制備**：制備單細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊和粘附細(xì)胞。白細(xì)胞樣本需用特定裂解液（如Ficoll-Paque）進(jìn)行密度梯度離心分離。

(2)**染色**：冰上操作，避光。加入固定液（如多聚甲醛）固定細(xì)胞，再加入破膜劑（如透化劑）開放細(xì)胞膜。最后加入混合好的熒光標(biāo)記抗體，避光孵育（通常30-60分鐘）。

(3)**上樣與檢測**：用預(yù)充洗液（如FACSFlow）的槍將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管，設(shè)置流速和采集參數(shù)。確保鞘液壓力穩(wěn)定，防止細(xì)胞聚集。

(4)**數(shù)據(jù)獲取與分析**：收集細(xì)胞信號(hào)，使用流式軟件（如FlowJo）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算細(xì)胞百分比、平均熒光強(qiáng)度（MFI）、細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)。

3.**免疫印跡法（WesternBlot）**：

(1)**原理**：將蛋白質(zhì)通過電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移至固相膜（如PVDF膜或NC膜），與特異性抗體結(jié)合，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光或熒光檢測目標(biāo)蛋白。

(2)**關(guān)鍵試劑與步驟**：

-**主要試劑**：SDS凝膠電泳試劑盒、轉(zhuǎn)膜液及膜、一抗（特異性抗體）、二抗（酶標(biāo)抗體，如HRP或AP）、化學(xué)發(fā)光底物（ECL）、封閉液、洗滌液（TBS-T或TBST緩沖液）、蛋白Marker。

-**主要步驟**：

(1)**蛋白提取與定量**：提取樣本總蛋白，使用BCA或Bradford法進(jìn)行蛋白濃度定量。

(2)**SDS電泳**：根據(jù)蛋白大小選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白分離。

(3)**轉(zhuǎn)膜**：將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜上，使蛋白與膜結(jié)合。

(4)**封閉**：用封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA）室溫封閉1-2小時(shí)，阻斷非特異性結(jié)合。

(5)**一抗孵育**：加入稀釋后的一抗，4℃過夜孵育。

(6)**洗滌**：用洗滌液洗滌膜3-4次，每次10分鐘。

(7)**二抗孵育**：加入稀釋后的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1小時(shí)。

(8)**洗滌**：同上。

(9)**化學(xué)發(fā)光檢測**：滴加化學(xué)發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如ChemiDoc）拍照，或加入顯影液進(jìn)行熒光檢測。

(10)**結(jié)果分析**：使用軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，進(jìn)行半定量或相對(duì)定量分析。使用β-actin或內(nèi)參蛋白作為加載控制（LoadingControl）。

4.**免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence,IF）**：

(1)**原理**：利用熒光標(biāo)記的抗體直接或間接染色細(xì)胞或組織樣本中的目標(biāo)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。

(2)**關(guān)鍵試劑與步驟**：

-**主要試劑**：固定液（如甲醇、乙醇或多聚甲醛）、通透膜（如TritonX-100）、封閉液（如BSA、血清）、一抗/二抗（直接法僅需一抗，間接法需一抗和酶標(biāo)二抗）、熒光標(biāo)記抗體（直接法，或多聚甲醛固定的樣本需用熒光二抗）、DAPI（核染料，可選）、抗熒光淬滅封片劑。

-**主要步驟**：

(1)**樣本制備**：制備細(xì)胞爬片或組織切片，固定。

(2)**通透（如需）**：對(duì)于上皮細(xì)胞或組織樣本，需用通透劑處理，使抗體易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

(3)**封閉**：阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

(4)**染色**：直接法：加入熒光標(biāo)記的一抗，孵育；間接法：加入一抗孵育，洗滌，加入熒光標(biāo)記的二抗孵育。

(5)**核染（如需）**：加入DAPI等熒光染料，使細(xì)胞核顯色。

(6)**封片**：滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。

(7)**顯微鏡觀察**：使用熒光顯微鏡，在相應(yīng)激發(fā)和發(fā)射濾光片下觀察并拍照。

5.**淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（LymphocyteTransformationTest,LTT）**：

(1)**原理**：檢測T淋巴細(xì)胞在特定刺激物（如植物血凝素PHA、ConA或特定抗原）作用下發(fā)生的增殖反應(yīng)。

(2)**關(guān)鍵試劑與步驟**：

(1)**樣本準(zhǔn)備**：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用培養(yǎng)基（如RPMI-1640）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度。

(2)**細(xì)胞鋪板**：將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1x10^5細(xì)胞。

(3)**加入刺激物**：設(shè)立空白孔（僅培養(yǎng)基）、PHA陽性對(duì)照孔（加入PHA）、非特異性刺激物對(duì)照孔（如PWM）、待測樣本刺激孔（加入特定濃度刺激物）。

(4)**培養(yǎng)**：在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天（PHA通常3天，ConA可能需要5天）。

(5)**檢測增殖**：培養(yǎng)結(jié)束后，加入MTT溶液（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide），繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)。加入溶酶體裂解液，振蕩使結(jié)晶物溶解。

(6)**讀板**：用酶標(biāo)儀在570nm波長處讀取吸光度值（OD值）。計(jì)算刺激指數(shù)（SI）=待測樣本OD值/非特異性刺激物對(duì)照OD值。

（二）操作步驟（以流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD8+T細(xì)胞比例為例）

1.**樣本準(zhǔn)備**：

(1)收集新鮮全血樣本（肝素抗凝），避免溶血和細(xì)胞激活。

(2)根據(jù)樣本量加入預(yù)溫的Ficoll-Paque分離液，輕輕疊加于樣本表面。

(3)離心（1500rpm，20-30分鐘），吸取中間云霧狀的單核細(xì)胞層。

(4)用預(yù)充洗液洗滌細(xì)胞1-2次，每次離心后棄上清。

(5)重懸細(xì)胞于適量預(yù)充洗液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1x10^6-1x10^7cells/mL。

2.**設(shè)置對(duì)照**：

(1)**陰性對(duì)照**：加入同型IgG熒光標(biāo)記抗體，用于評(píng)估非特異性結(jié)合。

(2)**陽性對(duì)照**：若為間接法，可設(shè)陽性對(duì)照（已知表達(dá)該抗原的細(xì)胞或細(xì)胞系）。

3.**熒光標(biāo)記**：

(1)加入固定液，室溫避光孵育10分鐘。

(2)加入破膜劑，室溫避光孵育5分鐘。

(3)棄破膜劑，用預(yù)充洗液洗滌1次。

(4)加入CD3-PE抗體和CD4-FITC抗體混合液，避光孵育30分鐘。

(5)用預(yù)充洗液洗滌1-2次。

4.**上樣與設(shè)置**：

(1)將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管，確保無氣泡。

(2)設(shè)置流式參數(shù)：

-**鞘液壓力**：確保穩(wěn)定，防止細(xì)胞聚集。

-**流速**：根據(jù)細(xì)胞濃度和儀器性能選擇。

-**電平設(shè)置**：根據(jù)陰性對(duì)照信號(hào)設(shè)置熒光道電平，避免飽和。

-**門區(qū)設(shè)置**：先設(shè)淋巴細(xì)胞門（如基于FSC/SSC散點(diǎn)圖），再在淋巴細(xì)胞內(nèi)設(shè)CD3+T細(xì)胞門。

-**通道設(shè)置**：將PE設(shè)在高熒光通道，F(xiàn)ITC設(shè)在中低熒光通道。

5.**數(shù)據(jù)采集與分析**：

(1)開始采集數(shù)據(jù)，采集足夠數(shù)量的細(xì)胞（如1x10^5-1x10^6events）。

(2)使用流式軟件（如FlowJo）導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

(3)在CD3+T細(xì)胞門內(nèi)，根據(jù)CD4-FITC和CD8-PE的散點(diǎn)圖，設(shè)置門區(qū)分別計(jì)數(shù)CD4+和CD8+細(xì)胞。

(4)計(jì)算CD4+/CD8+比例=CD4+細(xì)胞百分比/CD8+細(xì)胞百分比。

6.**結(jié)果報(bào)告**：記錄CD4+、CD8+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比例，與參考范圍對(duì)比，評(píng)估免疫狀態(tài)。

**四、結(jié)果解讀與報(bào)告**

（一）結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.**定量檢測**：

(1)**參考范圍**：每個(gè)檢測項(xiàng)目均應(yīng)有經(jīng)過驗(yàn)證的參考范圍（正常值范圍），通?；诮】等巳航y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。示例：血清IgG參考范圍約為7-16g/L，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)參考范圍成人約為300-1000cells/μl。

(2)**結(jié)果解釋**：將樣本檢測結(jié)果與參考范圍進(jìn)行比較。顯著高于或低于參考范圍的上限或下限，通常提示異常。

(3)**趨勢分析**：對(duì)于多次檢測的樣本，應(yīng)結(jié)合歷史結(jié)果進(jìn)行趨勢分析，判斷變化方向和幅度。

(4)**統(tǒng)計(jì)學(xué)方法**：可使用ROC曲線確定診斷閾值，或進(jìn)行相關(guān)性分析等。

2.**半定量檢測**：

(1)**灰度/吸光度分級(jí)**：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照的信號(hào)強(qiáng)度，設(shè)定不同灰度等級(jí)，對(duì)應(yīng)陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性等結(jié)果。

(2)**圖像分析**：在免疫印跡或免疫熒光圖像中，通過目視或軟件分析條帶/細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。

3.**功能性檢測**：

(1)**細(xì)胞增殖（LTT）**：刺激指數(shù)（SI）>1.5-2.0通常認(rèn)為有增殖反應(yīng)。SI越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈。

(2)**細(xì)胞因子檢測**：根據(jù)細(xì)胞因子濃度，結(jié)合臨床癥狀和參考范圍，判斷是否存在異常表達(dá)或失衡。

（二）報(bào)告規(guī)范

1.**報(bào)告內(nèi)容**：

(1)**基本信息**：受檢者姓名、ID號(hào)、樣本類型（血清、全血等）、樣本接收日期、檢測項(xiàng)目名稱。

(2)**檢測結(jié)果**：以明確的數(shù)值和單位呈現(xiàn)每個(gè)檢測項(xiàng)目的結(jié)果。如：“CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)：650cells/μl”。

(3)**參考范圍**：列出每個(gè)檢測項(xiàng)目對(duì)應(yīng)的參考范圍。格式如：“參考范圍：300-1000cells/μl”。

(4)**單位**：所有結(jié)果和參考范圍必須注明單位。

(5)**異常結(jié)果標(biāo)注**：對(duì)于顯著偏離參考范圍的結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行特殊標(biāo)注（如“↑”表示高于參考值，“↓”表示低于參考值），并可提供具體數(shù)值與參考范圍上下限的差距。

(6)**備注信息**：記錄樣本狀態(tài)（如溶血、黃疸）、檢測過程中的特殊情況、以及需要特別說明的事項(xiàng)。

2.**報(bào)告解讀與建議**：

(1)**綜合分析**：對(duì)單個(gè)結(jié)果進(jìn)行解讀的同時(shí)，應(yīng)結(jié)合多個(gè)檢測結(jié)果和臨床信息，進(jìn)行綜合評(píng)估。

(2)**臨床意義**：簡述檢測結(jié)果的潛在臨床意義，例如，CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低可能提示免疫抑制狀態(tài)。

(3)**建議**：根據(jù)結(jié)果，提出進(jìn)一步檢測、治療調(diào)整或臨床關(guān)注的建議。例如，“建議復(fù)查，并咨詢免疫科醫(yī)生”。

3.**報(bào)告發(fā)放**：

(1)**審核簽發(fā)**：檢測操作人員完成檢測后，由專業(yè)技術(shù)人員（如檢驗(yàn)醫(yī)師或授權(quán)技師）審核結(jié)果，確認(rèn)無誤后簽發(fā)報(bào)告。

(2)**及時(shí)性**：確保報(bào)告在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成并發(fā)放給臨床醫(yī)生。

(3)**電子與紙質(zhì)**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求，提供電子版報(bào)告或紙質(zhì)版報(bào)告，并確保信息準(zhǔn)確無誤。

**五、質(zhì)量控制與安全**

（一）質(zhì)量控制措施

1.**室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）**：

(1)**質(zhì)控品使用**：每日或每次檢測時(shí)，使用至少2-3個(gè)水平不同的定值質(zhì)控品進(jìn)行檢測。質(zhì)控品應(yīng)覆蓋整個(gè)參考范圍。

(2)**結(jié)果評(píng)估**：觀察質(zhì)控品結(jié)果是否在允許范圍內(nèi)（通常要求CV<5%-10%，具體依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)）。若超出范圍，必須查找原因并糾正后重新檢測，直至所有質(zhì)控品結(jié)果合格。

(3)**趨勢監(jiān)控**：使用Levey-Jennings圖或Westgard多規(guī)則監(jiān)控質(zhì)控品結(jié)果趨勢，及時(shí)發(fā)現(xiàn)漂移。

2.**室間質(zhì)量評(píng)估（EQA）**：

(1)**參加計(jì)劃**：定期參加國家或機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃，與其他實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果。

(2)**結(jié)果分析**：分析EQA樣本結(jié)果，評(píng)估自身檢測水平，若結(jié)果不理想，需進(jìn)行內(nèi)部審核和改進(jìn)。

3.**方法學(xué)驗(yàn)證與確認(rèn)**：

(1)**新方法引入**：引入新的檢測方法或試劑前，必須進(jìn)行驗(yàn)證，包括靈敏度、特異性、線性范圍、準(zhǔn)確性、精密度等指標(biāo)的評(píng)估。

(2)**定期復(fù)核**：對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行定期復(fù)核，確保證照持續(xù)有效。

4.**儀器與試劑管理**：

(1)**儀器校準(zhǔn)**：按照說明書要求，定期對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)（如酶標(biāo)儀波長、流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償?shù)龋?/p>

(2)**試劑管理**：試劑的接收、儲(chǔ)存、復(fù)溶、效期管理必須規(guī)范。確保試劑配制準(zhǔn)確，使用前進(jìn)行驗(yàn)證。

（二）生物安全要求

1.**個(gè)人防護(hù)**：

(1)**基本防護(hù)**：所有操作人員必須穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套、口罩。處理潛在污染樣本時(shí)，應(yīng)佩戴護(hù)目鏡或面屏。

(2)**高級(jí)防護(hù)**：根據(jù)樣本風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)（如血液、體液），可能需要佩戴防滲透實(shí)驗(yàn)服、防水透性手套。

2.**環(huán)境控制**：

(1)**操作區(qū)域**：樣本采集和處理應(yīng)在生物安全柜或指定的潔凈區(qū)域進(jìn)行。流式細(xì)胞術(shù)等高風(fēng)險(xiǎn)操作建議在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

(2)**通風(fēng)**：確保實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，空氣流向合理（通常由清潔區(qū)流向污染區(qū)）。

3.**樣本處理**：

(1)**防污染**：嚴(yán)格區(qū)分清潔區(qū)和污染區(qū)。使用無色或匹配顏色的耗材，避免樣本交叉污染。

(2)**銳器處理**：廢棄針頭、刀片等銳器必須放入符合標(biāo)準(zhǔn)的銳器盒中，定期由專業(yè)機(jī)構(gòu)回收處理。

4.**廢棄物處理**：

(1)**分類處理**：實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物（如樣本、培養(yǎng)基、化學(xué)試劑）必須按照生物危險(xiǎn)廢棄物進(jìn)行分類處理。含病原體的樣本需經(jīng)高壓蒸汽滅菌或化學(xué)消毒后處理。

(2)**合規(guī)處置**：確保廢棄物處理符合當(dāng)?shù)丨h(huán)保和安全規(guī)定，交由有資質(zhì)的單位進(jìn)行處置。

5.**清潔與消毒**：

(1)**日常清潔**：每天工作結(jié)束后，對(duì)工作臺(tái)面、設(shè)備表面進(jìn)行清潔消毒。

(2)**終末消毒**：定期（如每周或每月）對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行徹底清潔和消毒，特別是高使用頻率的設(shè)備和表面。

6.**應(yīng)急預(yù)案**：

(1)**標(biāo)本溢出**：制定標(biāo)本溢出處理流程，包括立即隔離污染區(qū)域、穿戴防護(hù)用品、使用適當(dāng)消毒劑（如70-75%乙醇或含氯消毒劑）消毒，必要時(shí)進(jìn)行環(huán)境采樣檢測。

(2)**針刺傷**：制定針刺傷處理流程，包括立即沖洗傷口、評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)、報(bào)告事件、尋求醫(yī)療救助，并記錄事件。

一、概述

免疫學(xué)診療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要組成部分，通過檢測人體免疫系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)，輔助診斷疾病、評(píng)估病情和監(jiān)測治療效果。本細(xì)則旨在規(guī)范免疫學(xué)診療操作流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，提高診療效率。操作流程涵蓋樣本采集、處理、檢測、結(jié)果解讀及報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

二、樣本采集與處理

（一）樣本采集要求

1.采集前準(zhǔn)備：

(1)向受檢者說明采集目的和注意事項(xiàng)；

(2)檢查采集工具是否清潔、無菌；

(3)確認(rèn)受檢者處于空腹或按要求準(zhǔn)備狀態(tài)（如特定檢測需禁食）。

2.常用樣本類型及采集方法：

(1)全血樣本：采用靜脈穿刺法，采血量5-10ml，使用肝素抗凝管；

(2)血清樣本：采集后立即離心（3000rpm，5分鐘），分離血清置于EP管保存；

(3)體液樣本：如腦脊液、胸水等，使用無菌注射器抽取，避免污染。

3.樣本標(biāo)識(shí)：

(1)標(biāo)注受檢者姓名、ID、采集時(shí)間；

(2)使用條形碼或RFID標(biāo)簽減少錯(cuò)誤。

（二）樣本處理規(guī)范

1.全血樣本處理：

(1)立即混勻抗凝管，避免血細(xì)胞聚集；

(2)4℃保存，24小時(shí)內(nèi)完成檢測。

2.血清樣本處理：

(1)離心后取上清，避免溶血；

(2)-20℃凍存，避免反復(fù)凍融。

3.其他樣本處理：

(1)腦脊液樣本需立即檢測，避免細(xì)胞沉淀；

(2)泌尿系統(tǒng)樣本需在2小時(shí)內(nèi)完成培養(yǎng)或生化檢測。

三、檢測方法與流程

（一）常用檢測技術(shù)

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：

(1)試劑準(zhǔn)備：檢查酶標(biāo)板、抗體、底物是否在有效期內(nèi)；

(2)加樣順序：依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、酶標(biāo)抗體；

(3)結(jié)果判讀：使用酶標(biāo)儀測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

2.流式細(xì)胞術(shù)：

(1)設(shè)定門區(qū)：根據(jù)細(xì)胞特征劃分淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等亞群；

(2)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)：CD4+/CD8+比例、細(xì)胞因子分泌量等。

3.免疫印跡法：

(1)蛋白電泳分離；

(2)轉(zhuǎn)膜后雜交，化學(xué)發(fā)光顯色。

（二）操作步驟（以ELISA為例）

1.試劑與樣本準(zhǔn)備：

(1)檢測前用37℃水浴復(fù)溶試劑；

(2)樣本用移液器精確稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

2.加樣與孵育：

(1)依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、酶標(biāo)抗體；

(2)37℃孵育60分鐘，洗板3次（3000rpm，30秒/次）。

3.顯色與檢測：

(1)加入TMB底物，避光反應(yīng)30分鐘；

(2)用酶標(biāo)儀讀取450nm波長吸光度值。

四、結(jié)果解讀與報(bào)告

（一）結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.定量檢測：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，與參考范圍對(duì)比；

(1)正常值范圍（示例）：CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)300-1000個(gè)/μl，IgG水平7-16g/L。

2.半定量檢測：通過灰度值評(píng)估抗體強(qiáng)弱；

(1)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性。

（二）報(bào)告規(guī)范

1.報(bào)告內(nèi)容：受檢者信息、檢測項(xiàng)目、結(jié)果數(shù)值、參考范圍；

2.異常結(jié)果提示：標(biāo)注顯著偏離參考值的指標(biāo)，并建議復(fù)查或進(jìn)一步檢測。

五、質(zhì)量控制與安全

（一）質(zhì)量控制措施

1.日常質(zhì)控：每日使用質(zhì)控品，確保CV（變異系數(shù)）<5%；

2.定期校準(zhǔn)：每季度校準(zhǔn)儀器，記錄校準(zhǔn)參數(shù)。

（二）生物安全要求

1.操作人員需佩戴手套、口罩，避免樣本交叉污染；

2.化學(xué)廢棄物按規(guī)范處理，廢棄樣本高溫高壓滅菌。

**一、概述**

免疫學(xué)診療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要組成部分，通過檢測人體免疫系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)，輔助診斷疾病、評(píng)估病情和監(jiān)測治療效果。本細(xì)則旨在規(guī)范免疫學(xué)診療操作流程，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，提高診療效率。操作流程涵蓋樣本采集、處理、檢測、結(jié)果解讀及報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。熟悉并嚴(yán)格執(zhí)行本細(xì)則，有助于減少操作誤差，保障受檢者安全和檢測質(zhì)量。

**二、樣本采集與處理**

（一）樣本采集要求

1.采集前準(zhǔn)備：

(1)**核對(duì)受檢者信息**：確認(rèn)身份標(biāo)識(shí)（如姓名、出生日期、ID號(hào)），確保與樣本管標(biāo)簽一致，防止混淆。

(2)**解釋告知**：向受檢者或其家屬說明采集目的、流程、注意事項(xiàng)及可能的不適感，獲取知情同意。提醒受檢者按要求準(zhǔn)備（例如，某些檢測需空腹、停用特定藥物等）。

(3)**環(huán)境與工具檢查**：確保采集環(huán)境清潔、整潔，符合生物安全要求。檢查所有采集工具（注射器、針頭、采血管、試管架等）是否在有效期內(nèi)、包裝是否完好、無破損，并處于無菌狀態(tài)。采血管應(yīng)符合相應(yīng)檢測要求（如含肝素、EDTA、檸檬酸鈉等抗凝劑或促凝劑）。

(4)**手衛(wèi)生**：操作者必須進(jìn)行手衛(wèi)生，穿戴合規(guī)的個(gè)人防護(hù)用品（手套、口罩、帽子）。

2.常用樣本類型及采集方法：

(1)**全血樣本**：

-**采集方法**：通常采用靜脈穿刺法。選擇合適部位（如肘正中靜脈），消毒皮膚（通常使用70-75%乙醇棉簽，待干燥），按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程穿刺采血。采血量根據(jù)檢測項(xiàng)目要求而定，一般5-10ml，確保首次成功采足量。

-**抗凝選擇**：根據(jù)后續(xù)檢測方法選擇合適的抗凝管。常用如肝素鋰（適用于流式細(xì)胞術(shù)、某些化學(xué)發(fā)光檢測）、乙二胺四乙酸（EDTA）鉀（適用于血常規(guī)、免疫分型）、檸檬酸鈉（適用于凝血功能檢測，若免疫學(xué)檢測需凝血相關(guān)指標(biāo)則需注意）。

-**注意事項(xiàng)**：避免過度擠壓血管，防止組織液污染；采血后立即輕柔混勻血液與抗凝劑。

(2)**血清樣本**：

-**采集方法**：多采用靜脈采血法。采血后，將血液樣本置于室溫下靜置15-30分鐘（促凝管），或直接放入37℃水浴/恒溫箱孵育10-30分鐘（根據(jù)管材和檢測要求）。待充分凝固后，于3000-3500rpm離心5-10分鐘，分離血清。

-**處理**：小心吸取上層血清至無菌EP管中，避免吸到管底的紅細(xì)胞?？杉尤敕栏瘎ㄈ绡B氮鈉，若后續(xù)檢測需避光保存）。

-**保存**：血清樣本通常建議-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融，以減少蛋白變性。記錄凍存條件。

(3)**血漿樣本**：

-**采集方法**：靜脈采血后，立即加入相應(yīng)抗凝劑（如EDTA、肝素），充分混勻。無需孵育，立即高速離心（3000-3500rpm，10-15分鐘），分離血漿。

-**處理**：吸取上層血漿至無菌EP管，可加入防腐劑。血漿對(duì)溫度敏感，需根據(jù)檢測要求及時(shí)處理或凍存（通常-20℃）。

(4)**體液樣本**（如腦脊液、胸水、腹水、關(guān)節(jié)液等）：

-**采集方法**：使用無菌注射器和無菌穿刺針，按照臨床常規(guī)操作進(jìn)行采集。腦脊液通常采集3-5ml，胸水、腹水根據(jù)需要采集，關(guān)節(jié)液需嚴(yán)格無菌操作。

-**處理**：采集后應(yīng)立即送檢，或根據(jù)檢測項(xiàng)目要求進(jìn)行離心、保存處理。避免樣本凝固或污染。

3.樣本標(biāo)識(shí)與傳遞：

(1)**唯一標(biāo)識(shí)**：每個(gè)樣本必須使用唯一的標(biāo)識(shí)系統(tǒng)（如條形碼、RFID標(biāo)簽），標(biāo)識(shí)應(yīng)包含受檢者姓名、ID、樣本類型、采集時(shí)間等信息。確保樣本標(biāo)識(shí)與申請(qǐng)單信息完全一致。

(2)**清晰標(biāo)注**：在樣本管和外部容器上清晰、牢固地粘貼標(biāo)識(shí)，避免脫落或模糊。

(3)**記錄核對(duì)**：在樣本采集記錄單上詳細(xì)記錄樣本信息，并在傳遞過程中進(jìn)行核對(duì)。建立樣本追蹤系統(tǒng)，確保樣本從采集到檢測的全程可追溯。

(4)**安全傳遞**：樣本傳遞應(yīng)使用專用樣本車或傳遞箱，保持適宜的溫度（如血清/血漿需冷藏，細(xì)胞學(xué)樣本需室溫或特定條件），防止樣本在傳遞過程中變質(zhì)或發(fā)生意外。

（二）樣本處理規(guī)范

1.**全血樣本處理**：

(1)**抗凝管混勻**：采血后立即顛倒混勻5-10次（或按要求混勻），確?？鼓齽┡c血液充分接觸，防止血凝塊形成。

(2)**及時(shí)處理**：全血樣本（尤其是肝素抗凝管）需盡快處理。若無法立即檢測，應(yīng)置于4℃冰箱保存，但通常建議在4小時(shí)內(nèi)完成，避免白細(xì)胞活化等因素影響檢測結(jié)果。

(3)**白細(xì)胞裂解（如需）**：若后續(xù)檢測需分離血漿或DNA，而抗凝劑干擾，需進(jìn)行白細(xì)胞裂解處理，嚴(yán)格按照裂解劑說明書操作。

2.**血清/血漿樣本處理**：

(1)**離心條件**：確保離心速度和時(shí)間足夠，以完全分離血清/血漿。離心后應(yīng)靜置，避免上清液再次混入沉淀物。

(2)**分裝凍存**：對(duì)于需要長期保存的樣本，建議將血清/血漿分裝至小體積EP管中，減少反復(fù)凍融的次數(shù)。凍存管需標(biāo)注清晰。

(3)**避免反復(fù)凍融**：凍融過程可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、降解或溶血，影響檢測結(jié)果。樣本應(yīng)盡量一次性凍融使用。

3.**特殊樣本處理**：

(1)**細(xì)胞學(xué)樣本（如胸水、腦脊液）**：若需做細(xì)胞學(xué)檢查，應(yīng)立即涂片，固定（如95%乙醇或甲醇固定），或制備細(xì)胞塊進(jìn)行保存。

(2)**微生物培養(yǎng)樣本（如體液）**：需立即接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，并按微生物學(xué)規(guī)范處理和保存。

**三、檢測方法與流程**

（一）常用檢測技術(shù)

1.**酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）**：

(1)**原理**：基于抗原抗體特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記的抗體/抗原與底物反應(yīng)產(chǎn)生顯色，用酶標(biāo)儀測定吸光度，計(jì)算樣本中目標(biāo)物質(zhì)含量。

(2)**主要類型**：

-**競爭性ELISA**：樣本與標(biāo)準(zhǔn)品競爭結(jié)合有限量的酶標(biāo)抗體，適用于小分子抗原檢測。

-**雙抗體夾心ELISA**：最常用的格式，樣本中的抗原被兩層抗體捕獲，再與酶標(biāo)抗體結(jié)合，適用于大分子抗原檢測。

-**間接ELISA**：用于檢測抗體，樣本中的抗體與固相抗原結(jié)合，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合。

(3)**關(guān)鍵試劑**：酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體/抗原、酶底物（TMB、ABTS等）、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、洗滌液（通常是含有去離子水的洗滌緩沖液）、封閉液、阻斷劑。

(4)**操作要點(diǎn)**：

-**試劑準(zhǔn)備**：使用前檢查所有試劑是否在有效期內(nèi)，是否凍存/復(fù)溶正確。洗滌液需用蒸餾水或去離子水新鮮配制并過濾除菌。

-**板條處理**：仔細(xì)檢查酶標(biāo)板是否有破損、滲漏，必要時(shí)更換。按需進(jìn)行包被（加入抗原或抗體，4℃過夜或室溫2小時(shí)）、封閉（加入封閉液，室溫1-2小時(shí)），封閉液應(yīng)無色透明。

-**洗滌**：每次加樣前后及加完最后一道試劑后，均需用洗滌液充分洗滌（通常洗滌5-6次，每次300-500ml/min，每次靜置15-30秒后棄液，吸水紙邊緣輕拍去除殘留液體）。確保洗滌徹底，減少背景干擾。

-**加樣**：按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、酶標(biāo)抗體。加樣量需精確，避免氣泡。樣本需按說明書要求進(jìn)行稀釋。

-**孵育**：標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孵育時(shí)間通常為60-120分鐘，酶標(biāo)抗體孵育時(shí)間通常為30-60分鐘。孵育溫度通常為37℃，需避光。

-**顯色與終止**：加入酶底物，室溫避光孵育15-30分鐘（TMB顯色）。加入終止液（如H2SO4或HCl），終止反應(yīng)，使顏色變化穩(wěn)定。注意終止液顏色通常為黃色。

-**檢測**：立即用酶標(biāo)儀在指定波長（如TMB為450nm，參考波長為600-650nm）讀取吸光度值。確保樣品孔和空白孔讀數(shù)在酶標(biāo)儀的線性范圍內(nèi)。

2.**流式細(xì)胞術(shù)（FCM）**：

(1)**原理**：利用熒光標(biāo)記的抗體識(shí)別細(xì)胞表面的特定分子，通過激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)，結(jié)合液流系統(tǒng)，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速分析。

(2)**關(guān)鍵試劑與設(shè)置**：

-**熒光標(biāo)記抗體**：根據(jù)檢測目標(biāo)選擇合適的熒光標(biāo)記單抗，注意抗體濃度、熒光素種類（如PE,FITC,PerCP-Cy5.5,APC-Cy7）及對(duì)應(yīng)通道。

-**流式設(shè)置**：設(shè)定合適的門區(qū)（GatingStrategy）以排除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等干擾，準(zhǔn)確分析目標(biāo)細(xì)胞群。例如，在免疫分型中，可設(shè)置淋巴細(xì)胞門，再分別分析CD3+T細(xì)胞，其中進(jìn)一步分CD4+和CD8+亞群。

-**補(bǔ)償設(shè)置**：若使用多種熒光素標(biāo)記，需進(jìn)行熒光補(bǔ)償，消除熒光串色干擾。

(3)**操作要點(diǎn)**：

(1)**細(xì)胞制備**：制備單細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊和粘附細(xì)胞。白細(xì)胞樣本需用特定裂解液（如Ficoll-Paque）進(jìn)行密度梯度離心分離。

(2)**染色**：冰上操作，避光。加入固定液（如多聚甲醛）固定細(xì)胞，再加入破膜劑（如透化劑）開放細(xì)胞膜。最后加入混合好的熒光標(biāo)記抗體，避光孵育（通常30-60分鐘）。

(3)**上樣與檢測**：用預(yù)充洗液（如FACSFlow）的槍將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管，設(shè)置流速和采集參數(shù)。確保鞘液壓力穩(wěn)定，防止細(xì)胞聚集。

(4)**數(shù)據(jù)獲取與分析**：收集細(xì)胞信號(hào)，使用流式軟件（如FlowJo）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算細(xì)胞百分比、平均熒光強(qiáng)度（MFI）、細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)。

3.**免疫印跡法（WesternBlot）**：

(1)**原理**：將蛋白質(zhì)通過電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移至固相膜（如PVDF膜或NC膜），與特異性抗體結(jié)合，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光或熒光檢測目標(biāo)蛋白。

(2)**關(guān)鍵試劑與步驟**：

-**主要試劑**：SDS凝膠電泳試劑盒、轉(zhuǎn)膜液及膜、一抗（特異性抗體）、二抗（酶標(biāo)抗體，如HRP或AP）、化學(xué)發(fā)光底物（ECL）、封閉液、洗滌液（TBS-T或TBST緩沖液）、蛋白Marker。

-**主要步驟**：

(1)**蛋白提取與定量**：提取樣本總蛋白，使用BCA或Bradford法進(jìn)行蛋白濃度定量。

(2)**SDS電泳**：根據(jù)蛋白大小選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白分離。

(3)**轉(zhuǎn)膜**：將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜上，使蛋白與膜結(jié)合。

(4)**封閉**：用封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA）室溫封閉1-2小時(shí)，阻斷非特異性結(jié)合。

(5)**一抗孵育**：加入稀釋后的一抗，4℃過夜孵育。

(6)**洗滌**：用洗滌液洗滌膜3-4次，每次10分鐘。

(7)**二抗孵育**：加入稀釋后的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1小時(shí)。

(8)**洗滌**：同上。

(9)**化學(xué)發(fā)光檢測**：滴加化學(xué)發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如ChemiDoc）拍照，或加入顯影液進(jìn)行熒光檢測。

(10)**結(jié)果分析**：使用軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，進(jìn)行半定量或相對(duì)定量分析。使用β-actin或內(nèi)參蛋白作為加載控制（LoadingControl）。

4.**免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence,IF）**：

(1)**原理**：利用熒光標(biāo)記的抗體直接或間接染色細(xì)胞或組織樣本中的目標(biāo)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。

(2)**關(guān)鍵試劑與步驟**：

-**主要試劑**：固定液（如甲醇、乙醇或多聚甲醛）、通透膜（如TritonX-100）、封閉液（如BSA、血清）、一抗/二抗（直接法僅需一抗，間接法需一抗和酶標(biāo)二抗）、熒光標(biāo)記抗體（直接法，或多聚甲醛固定的樣本需用熒光二抗）、DAPI（核染料，可選）、抗熒光淬滅封片劑。

-**主要步驟**：

(1)**樣本制備**：制備細(xì)胞爬片或組織切片，固定。

(2)**通透（如需）**：對(duì)于上皮細(xì)胞或組織樣本，需用通透劑處理，使抗體易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

(3)**封閉**：阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

(4)**染色**：直接法：加入熒光標(biāo)記的一抗，孵育；間接法：加入一抗孵育，洗滌，加入熒光標(biāo)記的二抗孵育。

(5)**核染（如需）**：加入DAPI等熒光染料，使細(xì)胞核顯色。

(6)**封片**：滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。

(7)**顯微鏡觀察**：使用熒光顯微鏡，在相應(yīng)激發(fā)和發(fā)射濾光片下觀察并拍照。

5.**淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（LymphocyteTransformationTest,LTT）**：

(1)**原理**：檢測T淋巴細(xì)胞在特定刺激物（如植物血凝素PHA、ConA或特定抗原）作用下發(fā)生的增殖反應(yīng)。

(2)**關(guān)鍵試劑與步驟**：

(1)**樣本準(zhǔn)備**：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用培養(yǎng)基（如RPMI-1640）重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度。

(2)**細(xì)胞鋪板**：將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1x10^5細(xì)胞。

(3)**加入刺激物**：設(shè)立空白孔（僅培養(yǎng)基）、PHA陽性對(duì)照孔（加入PHA）、非特異性刺激物對(duì)照孔（如PWM）、待測樣本刺激孔（加入特定濃度刺激物）。

(4)**培養(yǎng)**：在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天（PHA通常3天，ConA可能需要5天）。

(5)**檢測增殖**：培養(yǎng)結(jié)束后，加入MTT溶液（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide），繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)。加入溶酶體裂解液，振蕩使結(jié)晶物溶解。

(6)**讀板**：用酶標(biāo)儀在570nm波長處讀取吸光度值（OD值）。計(jì)算刺激指數(shù)（SI）=待測樣本OD值/非特異性刺激物對(duì)照OD值。

（二）操作步驟（以流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD8+T細(xì)胞比例為例）

1.**樣本準(zhǔn)備**：

(1)收集新鮮全血樣本（肝素抗凝），避免溶血和細(xì)胞激活。

(2)根據(jù)樣本量加入預(yù)溫的Ficoll-Paque分離液，輕輕疊加于樣本表面。

(3)離心（1500rpm，20-30分鐘），吸取中間云霧狀的單核細(xì)胞層。

(4)用預(yù)充洗液洗滌細(xì)胞1-2次，每次離心后棄上清。

(5)重懸細(xì)胞于適量預(yù)充洗液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1x10^6-1x10^7cells/mL。

2.**設(shè)置對(duì)照**：

(1)**陰性對(duì)照**：加入同型IgG熒光標(biāo)記抗體，用于評(píng)估非特異性結(jié)合。

(2)**陽性對(duì)照**：若為間接法，可設(shè)陽性對(duì)照（已知表達(dá)該抗原的細(xì)胞或細(xì)胞系）。

3.**熒光標(biāo)記**：

(1)加入固定液，室溫避光孵育10分鐘。

(2)加入破膜劑，室溫避光孵育5分鐘。

(3)棄破膜劑，用預(yù)充洗液洗滌1次。

(4)加入CD3-PE抗體和CD4-FITC抗體混合液，避光孵育30分鐘。

(5)用預(yù)充洗液洗滌1-2次。

4.**上樣與設(shè)置**：

(1)將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀樣品管，確保無氣泡。

(2)設(shè)置流式參數(shù)：

-**鞘液壓力**：確保穩(wěn)定，防止細(xì)胞聚集。

-**流速**：根據(jù)細(xì)胞濃度和儀器性能選擇。

-**電平設(shè)置**：根據(jù)陰性對(duì)照信號(hào)設(shè)置熒光道電平，避免飽和。

-**門區(qū)設(shè)置**：先設(shè)淋巴細(xì)胞門（如基于FSC/SSC散點(diǎn)圖），再在淋巴細(xì)胞內(nèi)設(shè)CD3+T細(xì)胞門。

-**通道設(shè)置**：將PE設(shè)在高熒光通道，F(xiàn)ITC設(shè)在中低熒光通道。

5.**數(shù)據(jù)采集與分析**：

(1)開始采集數(shù)據(jù)，采集足夠數(shù)量的細(xì)胞（如1x10^5-1x10^6events）。

(2)使用流式軟件（如FlowJo）導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

(3)在CD3+T細(xì)胞門內(nèi)，根據(jù)CD4-FITC和CD8-PE的散點(diǎn)圖，設(shè)置門區(qū)分別計(jì)數(shù)CD4+和CD8+細(xì)胞。

(4)計(jì)算CD4+/CD8+比例=CD4+細(xì)胞百分比/CD8+細(xì)胞百分比。

6.**結(jié)果報(bào)告**：記錄CD4+、CD8+細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比例，與參考范圍對(duì)比，評(píng)估免疫狀態(tài)。

**四、結(jié)果解讀與報(bào)告**

（一）結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.**定量檢測**：

(1)**參考范圍**：每個(gè)檢測項(xiàng)目均應(yīng)有經(jīng)過驗(yàn)證的參考范圍（正常值范圍），通?；诮】等巳航y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。示例：血清IgG參考范圍約為7-16g/L，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)參考范圍成人約為300-1000cells/μl。

(2)**結(jié)果解釋**：將樣本檢測結(jié)果與參考范圍進(jìn)行比較。顯著高于或低于參考范圍的上限或下限，通常提示異常。

(3)**趨勢分析**：對(duì)于多次檢測的樣本，應(yīng)結(jié)合歷史結(jié)果進(jìn)行趨勢分析，判斷變化方向和幅度。

(4)**統(tǒng)計(jì)學(xué)方法**：可使用ROC曲線確定診斷閾值，或進(jìn)行相關(guān)性分析等。

2.**半定量檢測**：

(1)**灰度/吸光度分級(jí)**：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照的信號(hào)強(qiáng)度，設(shè)定不同灰度等級(jí)，對(duì)應(yīng)陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性等結(jié)果。

(2)**圖像分析**：在免疫印跡或免疫熒光圖像中，通過目視或軟件分析條帶/細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。

3.**功能性檢測**：

(1)**細(xì)胞增殖（LTT）**：刺激指數(shù)（SI）>1.5-2.0通常認(rèn)為有增殖反應(yīng)。SI越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈。

(2)**細(xì)胞