免疫學免疫組織操作規(guī)程###一、免疫學免疫組織操作規(guī)程概述

免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）是一種在組織切片上檢測特定蛋白質或其他分子的技術，廣泛應用于基礎醫(yī)學研究和臨床診斷。本規(guī)程旨在提供一套標準化的操作流程，以確保實驗結果的準確性和可重復性。操作流程包括樣本準備、抗原修復、封閉、抗體孵育、顯色、復染和封片等關鍵步驟。以下將詳細闡述各步驟的操作要點和注意事項。

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###二、免疫組織化學操作規(guī)程

####（一）樣本準備

1.**樣本采集**

-選擇新鮮組織樣本，避免壞死或自溶。

-樣本尺寸應足夠進行切片（通?！?0mm×10mm×5mm）。

-立即固定，常用固定液為4%多聚甲醛（pH7.4）。

2.**樣本固定**

-將組織放入固定液中，確保完全浸沒。

-固定時間：4-24小時，根據(jù)組織類型調整。

-固定后用蒸餾水沖洗3次，每次10分鐘。

3.**樣本脫水與透明**

-依次放入梯度乙醇溶液（70%,80%,95%,100%）脫水，每次15分鐘。

-放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15分鐘，更換兩次。

-脫水步驟需避光操作，防止標本變色。

4.**包埋**

-將組織塊置于石蠟包埋盒中，加入適量石蠟。

-置于包埋機上，45-55°C恒溫包埋，時間約1小時。

-冷卻后切取4-5μm厚切片。

####（二）切片與染色

1.**切片**

-使用切片機切取組織切片，厚度均勻。

-將切片貼附于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上。

-60°C干燥30分鐘，增強附著力。

2.**抗原修復**

-將切片放入抗原修復液中（如檸檬酸鹽緩沖液或EDTA緩沖液）。

-高壓鍋加熱至120°C，維持10-20分鐘。

-自然冷卻后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘。

3.**封閉**

-加入封閉液（如5%脫脂奶粉或10%正常血清）。

-37°C孵育1小時，封閉非特異性結合位點。

-吸去封閉液，用PBS沖洗3次。

4.**一抗孵育**

-用稀釋后的一抗（濃度參考說明書，常用1:100-1:500）。

-4°C過夜孵育，或37°C孵育1-2小時。

-用PBS沖洗3次，每次10分鐘。

5.**二抗孵育**

-加入相應種類的二抗（如山羊抗兔IgG）。

-37°C孵育1小時，或4°C過夜。

-用PBS沖洗3次，每次10分鐘。

6.**顯色**

-選擇合適的顯色劑（如DAB或BCIP/NBT）。

-滴加顯色液，室溫避光孵育10-30分鐘。

-觀察染色結果，適時終止反應（可用PBS或甲醇終止）。

7.**復染與封片**

-用蘇木精進行復染，增強組織對比度。

-蒸餾水沖洗，脫水至100%乙醇。

-用中性樹膠封片，蓋片，防止標本脫落。

####（三）結果觀察與記錄

1.**顯微鏡觀察**

-在光學顯微鏡下觀察染色結果，記錄陽性信號分布和強度。

-使用不同放大倍數(shù)（如100×和400×）拍照記錄。

2.**結果分析**

-陽性信號表現(xiàn)為棕色或藍紫色顆粒。

-定量分析時，可使用圖像分析軟件進行積分光密度（IOD）測定。

3.**質量控制**

-每批實驗設置陰性對照（不加一抗）和陽性對照。

-檢查切片厚度、封片質量，確保實驗一致性。

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###三、注意事項

1.**試劑配制**

-所有試劑需使用無菌水或雙蒸水配制。

-嚴格遵循說明書比例，避免濃度偏差。

2.**溫度控制**

-孵育溫度需精確控制，過高或過低影響抗體結合。

3.**避光操作**

-顯色步驟需避光，防止氧化影響結果。

4.**安全防護**

-操作時佩戴手套和護目鏡，避免化學試劑接觸皮膚。

5.**實驗記錄**

-詳細記錄實驗條件、試劑批號等信息，便于結果追溯。

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本規(guī)程涵蓋了免疫組織化學操作的主要步驟，實際應用中可根據(jù)實驗需求調整細節(jié)。規(guī)范操作是獲得可靠實驗結果的基礎，操作者需嚴格遵守并不斷優(yōu)化流程。

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###三、注意事項(續(xù))

1.**試劑配制(續(xù))**

***溶劑選擇：**除特殊說明外，所有溶液均需使用超純水或雙蒸水（電導率<1μS/cm）配制，以確保無離子干擾。顯色液（如DAB）配制需特別注意，避免使用含金屬離子的容器或蒸餾水，以防催化氧化。

***抗體稀釋：**一抗和二抗稀釋應使用特定緩沖液（通常是含0.1%吐溫-20的PBS或Tris緩沖液）。稀釋時需在冰浴中操作，并充分混勻（如使用旋轉混勻器或溫和搖晃），確?？贵w濃度均勻。建議分裝成小份使用，避免反復凍融對抗體活性造成影響，一般可凍存4°C備用，或-20°C長期保存（注意查閱抗體說明書推薦保存條件）。

***緩沖液準備：**PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）或TBS（Tris緩沖鹽水）是常用稀釋和沖洗緩沖液。配制時需精確調節(jié)pH值（通常PBS為7.4±0.2），并使用磁力攪拌器充分溶解鹽類。緩沖液可過濾除菌后4°C保存，有效期約1個月。

2.**溫度控制(續(xù))**

***抗原修復：**高壓鍋加熱時需確保壓力和溫度穩(wěn)定達到設定值。自然冷卻過程同樣重要，不可用冷水沖淋，以免熱沖擊導致切片脫落或組織結構破壞。修復時間需根據(jù)組織類型和目標抗原決定，例如，石蠟切片的抗原修復時間通常為10-20分鐘，而冰凍切片可能需要更短時間（如5-10分鐘）。

***孵育溫度：**一抗孵育通常在4°C（適用于需要長時間孵育或信號較弱的場合）或37°C（適用于大多數(shù)一抗，可加速反應）進行。二抗孵育一般在37°C進行，有利于二抗與一抗結合。顯色反應通常在室溫（約22-25°C）進行，需避光，并嚴格控制時間，過長可能導致背景過高或染色過度。

***溫度梯度：**使用水浴鍋或恒溫搖床進行孵育時，確保溫度均勻，避免邊緣效應?？墒褂脺囟忍筋^監(jiān)測孵育液實際溫度。

3.**避光操作(續(xù))**

***顯色階段：**DAB等酶促顯色反應對光敏感，會產生光氧化副產物，導致背景染色增強，特異性信號減弱。因此，顯色過程必須在避光環(huán)境下進行，可使用避光箱或黑色布罩覆蓋實驗臺。

***其他環(huán)節(jié)：**雖然不如顯色階段嚴格，但某些熒光標記的免疫組化或免疫熒光實驗中，封閉和一抗孵育也建議在黑暗環(huán)境下進行，以減少熒光淬滅。

4.**安全防護(續(xù))**

***個人防護：**全程佩戴一次性手套，實驗結束后徹底脫掉并丟棄。如需接觸眼睛或面部，應佩戴護目鏡。操作化學試劑（如二甲苯、乙醇、固定液）時，應在通風良好的實驗臺或通風柜中進行，并佩戴口罩。

***試劑處理：**廢棄的固定液、二甲苯、顯色液等需按實驗室規(guī)定分類收集，不可直接倒入下水道。用過的切片載玻片應統(tǒng)一收集處理。

***儀器安全：**使用切片機、包埋機、高壓鍋等設備時，需嚴格遵守操作規(guī)程，注意用電安全和設備維護。

5.**實驗記錄(續(xù))**

***詳細記錄：**每一步操作的關鍵參數(shù)（如溫度、時間、緩沖液pH、抗體稀釋倍數(shù)、試劑批號）都應詳細記錄在實驗記錄本或電子實驗記錄系統(tǒng)中。記錄陽性對照和陰性對照的設置及結果至關重要，用于判斷實驗是否成功及結果的有效性。

***圖像存檔：**對代表性切片進行拍照時，應使用相同的顯微鏡設置（放大倍數(shù)、曝光時間、白平衡等），并標注清晰的實驗信息和圖注。圖像文件應妥善保存，便于后續(xù)分析和分享。

***問題記錄：**實驗過程中遇到的問題（如背景高、信號弱、切片脆裂等）及其解決方法也應記錄下來，有助于優(yōu)化后續(xù)實驗。

###四、試劑與耗材清單

進行一次標準的免疫組化實驗，通常需要準備以下試劑和耗材：

（一）**樣本處理相關**

1.(1)多聚甲醛（40%或4%溶液）

2.(2)乙醇（70%,80%,95%,100%）

3.(3)二甲苯（Ⅰ型，Ⅱ型）

4.(4)石蠟（熔點范圍根據(jù)需要選擇，如52-56°C）

5.(5)多聚賴氨酸溶液（或處理過的載玻片）

（二）**染色前準備**

1.(1)磷酸鹽緩沖液（PBS,pH7.4，含0.01M磷酸氫二鈉、0.01M磷酸二氫鈉、0.137M氯化鈉，可含0.1%吐溫-20）

2.(2)切片機（手動或自動）

3.(3)包埋機

4.(4)載玻片、蓋玻片

（三）**免疫反應相關**

1.(1)抗原修復液（如檸檬酸鹽緩沖液、EDTA緩沖液，pH6.0-8.0）

2.(2)封閉液（如5%牛血清白蛋白BSA、10%正常血清，根據(jù)一抗來源選擇）

3.(1)一抗（特異性抗體，按說明書稀釋）

4.(2)二抗（與一抗物種對應的二抗，如山羊抗兔IgG，按說明書稀釋）

5.(3)抗體稀釋液（如0.1MTris-HClpH7.6含0.15MNaCl，或含0.1%吐溫-20的PBS）

（四）**顯色與復染**

1.(1)顯色劑（如DAB溶液，含底物、增強劑等）

2.(2)蘇木精（Hematoxylin）

3.(3)脫水液（乙醇梯度）

4.(4)透明液（二甲苯）

5.(5)封片劑（如中性樹膠）

（五）**對照用**

1.(1)陰性對照切片（不加一抗）

2.(2)陽性對照切片（已知表達該抗原的樣本）

（六）**輔助與防護**

1.(1)無菌水/雙蒸水

2.(2)冰盒、冰浴

3.(3)旋轉混勻器/溫和搖床

4.(4)顯微鏡（光學顯微鏡或熒光顯微鏡）

5.(5)手套、護目鏡

6.(6)實驗記錄本/電子記錄系統(tǒng)

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本部分對免疫組織化學操作規(guī)程中的注意事項和所需試劑耗材進行了更詳細的補充，旨在提供更具體、更具操作指導性的信息，幫助實驗人員規(guī)范操作并確保實驗質量。

###一、免疫學免疫組織操作規(guī)程概述

免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）是一種在組織切片上檢測特定蛋白質或其他分子的技術，廣泛應用于基礎醫(yī)學研究和臨床診斷。本規(guī)程旨在提供一套標準化的操作流程，以確保實驗結果的準確性和可重復性。操作流程包括樣本準備、抗原修復、封閉、抗體孵育、顯色、復染和封片等關鍵步驟。以下將詳細闡述各步驟的操作要點和注意事項。

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###二、免疫組織化學操作規(guī)程

####（一）樣本準備

1.**樣本采集**

-選擇新鮮組織樣本，避免壞死或自溶。

-樣本尺寸應足夠進行切片（通?！?0mm×10mm×5mm）。

-立即固定，常用固定液為4%多聚甲醛（pH7.4）。

2.**樣本固定**

-將組織放入固定液中，確保完全浸沒。

-固定時間：4-24小時，根據(jù)組織類型調整。

-固定后用蒸餾水沖洗3次，每次10分鐘。

3.**樣本脫水與透明**

-依次放入梯度乙醇溶液（70%,80%,95%,100%）脫水，每次15分鐘。

-放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15分鐘，更換兩次。

-脫水步驟需避光操作，防止標本變色。

4.**包埋**

-將組織塊置于石蠟包埋盒中，加入適量石蠟。

-置于包埋機上，45-55°C恒溫包埋，時間約1小時。

-冷卻后切取4-5μm厚切片。

####（二）切片與染色

1.**切片**

-使用切片機切取組織切片，厚度均勻。

-將切片貼附于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上。

-60°C干燥30分鐘，增強附著力。

2.**抗原修復**

-將切片放入抗原修復液中（如檸檬酸鹽緩沖液或EDTA緩沖液）。

-高壓鍋加熱至120°C，維持10-20分鐘。

-自然冷卻后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘。

3.**封閉**

-加入封閉液（如5%脫脂奶粉或10%正常血清）。

-37°C孵育1小時，封閉非特異性結合位點。

-吸去封閉液，用PBS沖洗3次。

4.**一抗孵育**

-用稀釋后的一抗（濃度參考說明書，常用1:100-1:500）。

-4°C過夜孵育，或37°C孵育1-2小時。

-用PBS沖洗3次，每次10分鐘。

5.**二抗孵育**

-加入相應種類的二抗（如山羊抗兔IgG）。

-37°C孵育1小時，或4°C過夜。

-用PBS沖洗3次，每次10分鐘。

6.**顯色**

-選擇合適的顯色劑（如DAB或BCIP/NBT）。

-滴加顯色液，室溫避光孵育10-30分鐘。

-觀察染色結果，適時終止反應（可用PBS或甲醇終止）。

7.**復染與封片**

-用蘇木精進行復染，增強組織對比度。

-蒸餾水沖洗，脫水至100%乙醇。

-用中性樹膠封片，蓋片，防止標本脫落。

####（三）結果觀察與記錄

1.**顯微鏡觀察**

-在光學顯微鏡下觀察染色結果，記錄陽性信號分布和強度。

-使用不同放大倍數(shù)（如100×和400×）拍照記錄。

2.**結果分析**

-陽性信號表現(xiàn)為棕色或藍紫色顆粒。

-定量分析時，可使用圖像分析軟件進行積分光密度（IOD）測定。

3.**質量控制**

-每批實驗設置陰性對照（不加一抗）和陽性對照。

-檢查切片厚度、封片質量，確保實驗一致性。

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###三、注意事項

1.**試劑配制**

-所有試劑需使用無菌水或雙蒸水配制。

-嚴格遵循說明書比例，避免濃度偏差。

2.**溫度控制**

-孵育溫度需精確控制，過高或過低影響抗體結合。

3.**避光操作**

-顯色步驟需避光，防止氧化影響結果。

4.**安全防護**

-操作時佩戴手套和護目鏡，避免化學試劑接觸皮膚。

5.**實驗記錄**

-詳細記錄實驗條件、試劑批號等信息，便于結果追溯。

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本規(guī)程涵蓋了免疫組織化學操作的主要步驟，實際應用中可根據(jù)實驗需求調整細節(jié)。規(guī)范操作是獲得可靠實驗結果的基礎，操作者需嚴格遵守并不斷優(yōu)化流程。

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###三、注意事項(續(xù))

1.**試劑配制(續(xù))**

***溶劑選擇：**除特殊說明外，所有溶液均需使用超純水或雙蒸水（電導率<1μS/cm）配制，以確保無離子干擾。顯色液（如DAB）配制需特別注意，避免使用含金屬離子的容器或蒸餾水，以防催化氧化。

***抗體稀釋：**一抗和二抗稀釋應使用特定緩沖液（通常是含0.1%吐溫-20的PBS或Tris緩沖液）。稀釋時需在冰浴中操作，并充分混勻（如使用旋轉混勻器或溫和搖晃），確?？贵w濃度均勻。建議分裝成小份使用，避免反復凍融對抗體活性造成影響，一般可凍存4°C備用，或-20°C長期保存（注意查閱抗體說明書推薦保存條件）。

***緩沖液準備：**PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）或TBS（Tris緩沖鹽水）是常用稀釋和沖洗緩沖液。配制時需精確調節(jié)pH值（通常PBS為7.4±0.2），并使用磁力攪拌器充分溶解鹽類。緩沖液可過濾除菌后4°C保存，有效期約1個月。

2.**溫度控制(續(xù))**

***抗原修復：**高壓鍋加熱時需確保壓力和溫度穩(wěn)定達到設定值。自然冷卻過程同樣重要，不可用冷水沖淋，以免熱沖擊導致切片脫落或組織結構破壞。修復時間需根據(jù)組織類型和目標抗原決定，例如，石蠟切片的抗原修復時間通常為10-20分鐘，而冰凍切片可能需要更短時間（如5-10分鐘）。

***孵育溫度：**一抗孵育通常在4°C（適用于需要長時間孵育或信號較弱的場合）或37°C（適用于大多數(shù)一抗，可加速反應）進行。二抗孵育一般在37°C進行，有利于二抗與一抗結合。顯色反應通常在室溫（約22-25°C）進行，需避光，并嚴格控制時間，過長可能導致背景過高或染色過度。

***溫度梯度：**使用水浴鍋或恒溫搖床進行孵育時，確保溫度均勻，避免邊緣效應?？墒褂脺囟忍筋^監(jiān)測孵育液實際溫度。

3.**避光操作(續(xù))**

***顯色階段：**DAB等酶促顯色反應對光敏感，會產生光氧化副產物，導致背景染色增強，特異性信號減弱。因此，顯色過程必須在避光環(huán)境下進行，可使用避光箱或黑色布罩覆蓋實驗臺。

***其他環(huán)節(jié)：**雖然不如顯色階段嚴格，但某些熒光標記的免疫組化或免疫熒光實驗中，封閉和一抗孵育也建議在黑暗環(huán)境下進行，以減少熒光淬滅。

4.**安全防護(續(xù))**

***個人防護：**全程佩戴一次性手套，實驗結束后徹底脫掉并丟棄。如需接觸眼睛或面部，應佩戴護目鏡。操作化學試劑（如二甲苯、乙醇、固定液）時，應在通風良好的實驗臺或通風柜中進行，并佩戴口罩。

***試劑處理：**廢棄的固定液、二甲苯、顯色液等需按實驗室規(guī)定分類收集，不可直接倒入下水道。用過的切片載玻片應統(tǒng)一收集處理。

***儀器安全：**使用切片機、包埋機、高壓鍋等設備時，需嚴格遵守操作規(guī)程，注意用電安全和設備維護。

5.**實驗記錄(續(xù))**

***詳細記錄：**每一步操作的關鍵參數(shù)（如溫度、時間、緩沖液pH、抗體稀釋倍數(shù)、試劑批號）都應詳細記錄在實驗記錄本或電子實驗記錄系統(tǒng)中。記錄陽性對照和陰性對照的設置及結果至關重要，用于判斷實驗是否成功及結果的有效性。

***圖像存檔：**對代表性切片進行拍照時，應使用相同的顯微鏡設置（放大倍數(shù)、曝光時間、白平衡等），并標注清晰的實驗信息和圖注。圖像文件應妥善保存，便于后續(xù)分析和分享。

***問題記錄：**實驗過程中遇到的問題（如背景高、信號弱、切片脆裂等）及其解決方法也應記錄下來，有助于優(yōu)化后續(xù)實驗。

###四、試劑與耗材清單

進行一次標準的免疫組化實驗，通常需要準備以下試劑和耗材：

（一）**樣本處理相關**

1.(1)多聚甲醛（40%或4%溶液）

2.(2)乙醇（70%,80%,95%,100%）