ICS65.020.3053CCSB4353云 南 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB53/T447.4—2022DB53/T447.4-2012云嶺牛第4部分：胚胎移植2022-05-202022-05-20發(fā)布2022-08-20實(shí)施云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局??發(fā)布DB53/T447.4DB53/T447.4—2022前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件為DB53/T447—2022《云嶺?！返牡?部分。DB53/T447已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：品種；——第2部分：養(yǎng)殖場(chǎng)建設(shè)規(guī)范；34——第5部分：體外胚胎生產(chǎn)；——第6部分：飼養(yǎng)管理；——第7部分：飼草加工與調(diào)制技術(shù)；89——第10部分：檔案管理；——第11部分：胴體生產(chǎn)、評(píng)定及分割技術(shù)。DB53/TBMY第4DB53/T447.4-2012BMY3.5（3）；（4.2）；（5.2.3）；f)（6.1.2.1、6.1.2.3）；（7.2.3）；（7.2.4.4）；8.1）；j)（8.2.1.1、8.2.1.28.2.1.3）；k)更改了“胚胎解凍”中部分表述，并將細(xì)管裝槍及移植部分內(nèi)容并入10.5.4（見(jiàn)9.2、10.5.4.1、10.5.4.2）。本文件由云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院提出。本文件由云南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC07）歸口。本文件起草單位：云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2012年首次發(fā)布；——本次為第一次修訂。IDB53/T447.4DB53/T447.4—2022引 言DB53/T447-20222014年12戶）DB53/T447-2022由十一個(gè)部分構(gòu)成。12345IVMIVFIVC67（堿）化飼料、青干草飼料的加工調(diào)制技術(shù)要求?！?部分：育肥技術(shù)。目的在于確立云嶺牛優(yōu)質(zhì)牛肉生產(chǎn)和雪花牛肉生產(chǎn)技術(shù)要求。91011DB53/T447-2022IIIDB53/T447.4DB53/T447.4—2022DB53/T447.4DB53/T447.4—2022云嶺牛第4部分：胚胎移植范圍本文件適用于云嶺牛的超數(shù)排卵及胚胎移植（MOET）的各個(gè)環(huán)節(jié)。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB4143牛冷凍精液DB53/T247.3肉牛養(yǎng)殖綜合標(biāo)準(zhǔn)第3部分：繁殖技術(shù)DB53/T447.3云嶺牛第3部分：人工授精術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1供體牛donor提供卵子和胚胎的優(yōu)秀繁殖母牛。3.2受體牛recipient接受胚胎（移植）的母牛。3.3同期發(fā)情synchronousestrus使用外源激素來(lái)調(diào)控一群母牛的發(fā)情進(jìn)程，使之在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情和排卵。3.4超數(shù)排卵（簡(jiǎn)稱超排）superovulation在母牛發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)間，使用外源性腺激素，誘導(dǎo)更多的卵泡正常發(fā)育，并多排卵。3.5胚胎冷凍保存embryocryopreservation按胚胎冷凍的原理和方法，對(duì)胚胎進(jìn)行冷凍，并在液氮中長(zhǎng)期保存。3.6胚胎移植embryotransfer將受精卵（胚胎）移植到受體母牛子宮角內(nèi)。4胚胎移植的要求124供體牛的選擇與飼養(yǎng)管理供體牛的選擇10280kg～600kg。經(jīng)產(chǎn)母牛產(chǎn)后60供體牛的飼養(yǎng)管理供體牛的超排及輸精超排處理超排激素FSH（促卵泡素）、PG（前列腺素及其類似物）、CIDR?或CUE-MATETM（孕酮陰道栓）、GnRH（促性腺激素釋放激素）、LH（促黃體生成素）等。超排方法FSH+PG法在發(fā)情周期的任一天對(duì)供體牛用一次PG法進(jìn)行同期發(fā)情處理或選擇自然發(fā)情的供體牛在發(fā)情周期的第10～114FSH的第3PG。CIDR?CUE-MATETMFSH+PG法以供體牛發(fā)情當(dāng)日為0天置入CIDR?或10天～11天開(kāi)始注射連續(xù)注射4天，第12天～13天（FSH注射第3天）注射PG，同時(shí)取出CIDR?或CUE-MATETM。FSHPG用量6.1.2.1和6.1.2.2中FSH和PG用量可采用下列任意一種組合：——日本產(chǎn)FSH24mg～36mg+美國(guó)產(chǎn)PG30mg～35mg或國(guó)產(chǎn)氯前列烯醇0.6mg～0.8mg；——加拿大產(chǎn)FSH320mg～380mg+美國(guó)產(chǎn)PG30mg～35mg或國(guó)產(chǎn)氯前列烯醇0.6mg～0.8mg；——國(guó)產(chǎn)FSH10mg～12mg+國(guó)產(chǎn)氯前列烯醇0.6mg～0.8mg。發(fā)情鑒定在注射PG24h后進(jìn)行發(fā)情鑒定，發(fā)情鑒定方法按DB53/T247.3的規(guī)定執(zhí)行。凍精質(zhì)量檢查2應(yīng)符合GB4143的規(guī)定。輸精注射PG48h12hDB53/T447.3GnRH50μg～100μgLH2000IU～3000IU。胚胎回收（沖胚）沖胚時(shí)間供體牛以超排發(fā)情后第一次輸精當(dāng)日為0天，在第（7±0.5）天，用非手術(shù)法回收胚胎。沖胚前的準(zhǔn)備主要器材沖胚管及內(nèi)芯、子宮頸擴(kuò)張棒、子宮頸黏液吸除器、過(guò)濾式集卵（胚）杯、Y字型三通硅膠管，以及50mL注射器、20mL注射器、10mL注射器、5mL注射器、培養(yǎng)皿、量筒、毛剪、鑷子等。藥劑新潔爾滅、2%利多卡因、0.9%生理鹽水、酒精、青霉素、鏈霉素等。沖胚液的配制基液：杜氏磷酸緩沖液（PBS），配方見(jiàn)附錄A。也可用進(jìn)口PBS粉配制。沖胚液：含1%FCS（胎犢血清）或CS（犢牛血清）加含抗生素的PBS液。也可直接用進(jìn)口的沖胚液。沖胚準(zhǔn)備按以下步驟進(jìn)行沖胚準(zhǔn)備：23mL～5mL將牛尾固定，清除直腸中的糞便；用子宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸口，再用黏液吸除器清除子宮頸黏液；20mL10mL～1515mL～18mL；Y沖胚按以下步驟沖胚：50mL15mL～30mL36～10250mL～300mL一側(cè)子宮沖胚完畢后，用注射器筒接到?jīng)_胚管的注氣口將氣囊中的氣體放出，抽出沖胚管；用同樣的方法對(duì)另一側(cè)子宮角沖胚；（20010020mL～50mL）PG（0.4mg～0.6mg）；10mL胚胎質(zhì)量鑒定檢胚在實(shí)驗(yàn)室（檢胚室）20～2513～4圖圖1 檢胚順序20%犢牛血清（CS）PBSTCM-199（同一頭供體牛的胚胎放入同一培養(yǎng)皿中），并做好標(biāo)記。PBSTCM-1993～5胚胎的質(zhì)量鑒定形態(tài)學(xué)方法觀察在40～80發(fā)育期劃分4供體牛超排發(fā)情后第（7±1）天的胚胎發(fā)育期劃分為以下6個(gè)時(shí)期：——早期桑椹胚（EarlyMorula，EM），卵裂球隱約可見(jiàn)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)基本占滿卵周間隙；——致密桑椹胚（CompactMorula，CM），卵裂球進(jìn)一步分裂變小，看不清卵裂球的界線，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)致密收縮，占卵周間隙的60%～70%；——早期囊胚（EarlyBlastocyst，EB），出現(xiàn)透亮的囊胚腔，開(kāi)始分為發(fā)暗的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和明亮的滋養(yǎng)層，但兩層界線尚不明晰，細(xì)胞團(tuán)占卵周間隙的70%～80%；——囊胚（Blastocyst，BL），囊胚腔增大明顯，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞界線清晰，細(xì)胞充滿卵周間隙；——擴(kuò)張囊胚（ExpandedBlastocyst，Exp），囊胚腔充分?jǐn)U張，體積增至原來(lái)的1.2～1.5倍，透明帶變薄，約為原厚度的1/3；——孵化囊胚（HatchedBlastocyst，Hed或HB），囊胚腔擴(kuò)張到一定程度，透明帶破裂，胚胎細(xì)胞團(tuán)脫出透明帶。發(fā)育階段供體牛排卵受精后不同時(shí)間的胚胎發(fā)育階段見(jiàn)表1。表1 供體牛排卵受精后不同時(shí)間的胚胎發(fā)育階段時(shí)間（天）0～11～22～33～44～55～66～77～88～10胚胎形態(tài)發(fā)育階段1細(xì)胞2細(xì)胞4細(xì)胞8細(xì)胞16細(xì)胞早期桑葚胚致密胚早期囊胚囊胚擴(kuò)張囊胚孵化囊胚胚胎質(zhì)量等級(jí)胚胎質(zhì)量劃分為下列四個(gè)等級(jí)：——1——210%以下；——3級(jí)，即普通胚，發(fā)育階段正常、突出的細(xì)胞或較明顯不均勻，變性部分占10%～30%；——4級(jí)，即不良胚，細(xì)胞不均勻、變性細(xì)胞明顯，變性部分占30%～50%；發(fā)育緩慢和未受精卵。胚胎使用1～31～238.2.2體外培養(yǎng)法將被鑒定的胚胎用TCM199＋F1CS或TC-199＋FCS＋β-ME（β-巰基乙醇）培養(yǎng)液，在5%C、95%空氣、38.5℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h，判斷胚胎是否存活和活力。桑椹胚、早期囊胚5胚胎的冷凍保存及解凍胚胎的冷凍保存儀器、器材實(shí)體顯微鏡、胚胎冷凍儀、液氮罐、液氮、細(xì)管、封口儀、吸胚管、0.22μm過(guò)濾器、培養(yǎng)皿、記號(hào)筆等。保存液與冷凍液含有20%犢牛血清(CS)的PBS液為保存液。用8%乙二醇（EG）＋0.1mol/L海藻糖（Tre.）＋m-PBS＋20%CS,用0.22μm濾器過(guò)濾滅菌分裝為冷凍液。胚胎裝管胚胎先在保存液微滴中清洗4次，然后在冷凍液微滴中清洗4次。將胚胎吸入0.25mL細(xì)管內(nèi)，用封口機(jī)封口、分類、標(biāo)記，在4℃的冰箱內(nèi)放置平衡10min～15min后放入冷凍儀。胚胎冷凍保存胚胎冷凍儀溫度降至-772min后進(jìn)行人工植冰，繼續(xù)保持至10min，以0.3/min的速率降溫至-30-3010min后，直接放入盛有液氮的液氮罐中保存，并定期檢查和加液氮。9.2胚胎解凍9.2胚胎解凍從液氮中取出裝有胚胎的細(xì)管，空氣浴6s后在32～3510s。10胚胎移植受體牛的選擇供同期發(fā)情處理的受體牛必須是確認(rèn)空懷的。受體牛的選擇參見(jiàn)附錄B。受體牛的飼養(yǎng)管理75A、D、E，補(bǔ)充微量元素，如硒等。保持受體牛飼養(yǎng)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定與衛(wèi)生，避免應(yīng)激。妊?受體牛在飼喂全價(jià)日糧飼料基礎(chǔ)上，補(bǔ)充鹽、礦物質(zhì)和維生素，加強(qiáng)舍外運(yùn)動(dòng)。受體牛的同期發(fā)情處理PGF2α法PGF2α法對(duì)受體牛在發(fā)情周期的任意一天（除發(fā)情當(dāng)日）直腸檢查，只對(duì)卵巢上有黃體的一次注射PGFα或類似物（Lutalyse?或氯前列烯醇），在注射PG后24h～96h觀察發(fā)情。PGF2α法6在受體牛發(fā)情周期的任意一天（除發(fā)情當(dāng)日外），不論卵巢上有無(wú)黃體，先注射PGF2α或類似物一次(Lutalyse?或氯前列烯醇)，間隔11天～14天再用等量注射一次，在第二次注射PG后24h～96h內(nèi)觀察發(fā)情。CIDR?（CUE-MATETM）＋PGF2α法在受體牛發(fā)情周期的任一天（除發(fā)情當(dāng)日），無(wú)論卵巢上有無(wú)黃體，將CID?（CU-MAE）孕酮陰道栓置入陰道內(nèi)，以置栓之日為0天，在第7天一次性肌注PGFα類似物（氯前列烯醇），第9天取出CID（CUEMAT810～12取栓后72h或第9～10EB+CIDR?（CUE-MATETM）＋PGF2α法在受體牛發(fā)情周期的任一天，將CIDR?（CUE-MATETM）置入陰道內(nèi)，同時(shí)肌肉注射EB（EstradiolBenzoate，EB，苯甲酸雌二醇)。第8天撤栓,同時(shí)肌注氯前列烯醇；第9天再次注射EB，不觀察發(fā)情，在第16天～17天檢查黃體狀況。GnRHPGF2α法對(duì)受體牛不作黃體檢查，第1GnRH或類似物（Fertagy）或促排3（LHRH-A3），第7PGF（Lutlys，第9GnR16同供體牛發(fā)情鑒定。受體牛的胚胎移植器具、藥劑同供體牛發(fā)情鑒定。受體牛的胚胎移植器具、藥劑解凍杯、移植槍、移植槍塑料外套和保護(hù)膜、毛剪、2%利多卡因、酒精棉球、5mL一次性注射器、無(wú)菌紙、生理鹽水棉球。移植時(shí)間（胚齡24表2 受體牛胚胎移植時(shí)間10.5.3黃體判定7受體與供體的發(fā)情時(shí)間相差（h）-240+24站立發(fā)情時(shí)間早移植移植移植晚移植移植不移植（AB級(jí)胚胎移植操作細(xì)管裝槍鮮胚裝管或凍胚按9.2進(jìn)行解凍，用消毒紙擦干細(xì)管，再用半干的酒精棉球擦拭細(xì)管表面，剪開(kāi)細(xì)管封口端(如用細(xì)管塞封口的則拔出即可)，細(xì)管棉塞端裝入移植槍中，套上滅菌的保護(hù)外套和保護(hù)膜。胚胎移植2%min內(nèi)完成移植。移植記錄（左或右側(cè)卵巢（A、B、C級(jí)）、供體牛號(hào)以及移植日期、移植者、備注（如出血、子宮內(nèi)膜炎和其它）等。11受體牛的妊娠診斷與否。診斷方法按DB53/T447.3的規(guī)定執(zhí)行。8受體牛胚胎移植后第25天～30天，用B超作早期妊?診斷，第60天～80天用直腸檢查，確定妊?與否。診斷方法按DB53/T447.3的規(guī)定執(zhí)行。8附錄 A（規(guī)范性）杜氏磷酸緩沖液配方表杜氏磷酸緩沖液配方見(jiàn)表A.1。表A.1杜氏磷酸緩沖液配方表試劑名稱量NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4（Na2HPO4?12H2）1.15(2.16）gKH2PO40.20gCaCl2（CaCl2?2H2O）0.10(0.132）gMgCl2（MgCl2?6H2O）0.1(0.2133）g丙酮酸鈉0.36g葡萄糖（葡萄糖?H2O）1.00(1.10）g青霉素0.075g鏈霉素0.05g酚紅0.005g超純凈水1L99附錄 B（規(guī)范性受體牛選擇見(jiàn)表B.1。表B.1受體牛選擇牛品種受體選擇標(biāo)準(zhǔn)云嶺牛2～81～6300kg60周期正常，發(fā)情表現(xiàn)良好；泌乳性能好。奶牛1.5～80～5350