ICS11.220

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2905—2023

羊副流感病毒3型檢測技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationfordiagnosticofcapineparainfluenzavirus

type3

2023-03-10發(fā)布2023-04-10實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2905—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古大學(xué)、內(nèi)蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保靈生物藥品有限公司、內(nèi)蒙

古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院、吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院。

本文件主要起草人：王煒、馬艷華、王鎵磊、趙麗霞、楊昱萍、郭宇、韓四娥、郭利、武有志、王

巖、薩如拉、高登軍、王旭紅、胡薇。

I

DB15/T2905—2023

羊副流感病毒3型檢測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了綿羊、山羊副流感3型的臨床診斷、病原分離、RT-PCR、ELISA方法的診斷技術(shù)要求。

本文件適用羊飼養(yǎng)場（戶）和動物疫病檢疫、診療單位對羊副流感病毒3型的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

羊副流感病毒3型caprineParainfluenzavirustype3，CPIV3

屬于副黏病毒科，呼吸道病毒屬成員，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒（見附錄A中圖A.1）。

4臨床診斷

感染羊主要臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱（體溫≥40℃）、呼吸困難、流漿液性或黏膿性鼻液和咳嗽等呼

吸道癥狀。病理剖檢可見肺部實變。

5實驗室診斷

病毒分離

5.1.1試劑耗材

牛腎細胞系（MDBK細胞系）、棉簽、FBS、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、細胞培養(yǎng)板。

5.1.2儀器

電子天平、研磨儀、臺式冷凍離心機、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱。

5.1.3病料采集

1

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5.1.3.1鼻拭子

用無菌棉簽刮取鼻道分泌物，然后放入3mL～5mL含1000IU/mL青霉素1000μg/mL鏈霉素的DMEM

培養(yǎng)基的凍存管中，編號，記錄，于2℃～8℃條件下保存并盡快送往實驗室。

5.1.3.2血清

使用非抗凝采血管采集新鮮血液2mL～5mL，靜置分離血清，編號，記錄，于2℃～8℃條件下保

存并盡快送往實驗室。

5.1.3.3肺組織

疑似因CPIV3感染死亡的羊，按照NY/T541采集肺組織樣品，放入離心管，編號，記錄，于2℃～

8℃條件下保存并盡快送往實驗室。

5.1.4樣品處理

5.1.4.1拭子

將鼻拭子樣品液凍融兩次，然后以6000r/min離心10min，再使用一次性注射器吸取上清經(jīng)0.22

μm濾膜過濾除菌，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

5.1.4.2血清

將靜置分層的血清轉(zhuǎn)移到滅菌離心管，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

5.1.4.3肺組織

取體積大小為2×2×3cm肺組織樣品，按照體積比為1:3～1:5的比例加入含有雙抗的PBS（pH7.2～

7.4），研磨成勻漿液，凍融兩次，再以6000r/min離心10min，取上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，

-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

5.1.5細胞接種

取處理過的樣品接種到長滿80%的24孔板MDBK細胞，每孔200μL，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱

中吸附30min后，加入含2%FBS或NBS的細胞培養(yǎng)液1mL，同時設(shè)對照組，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，

培養(yǎng)3d～5d，逐日觀察，記錄細胞病變。按上述方法盲傳3～5代。

5.1.6結(jié)果判定

逐日觀察細胞病變，表現(xiàn)為細胞變圓、大量脫落、貼壁細胞變長聚集形成網(wǎng)狀（見附錄A.2）；當(dāng)

70%～80%細胞出現(xiàn)病變時收獲培養(yǎng)物，經(jīng)反復(fù)凍融，以3000r/min離心10min，取上清進行5.2的檢測。

RT-PCR

5.2.1試劑耗材

移液器、無菌無酶離心管、PCR管、病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、TAE緩沖液、

瓊脂糖、核酸染料、陽性質(zhì)粒（陽性對照）、滅菌超純水（陰性對照）、引物。

5.2.2儀器

PCR儀、臺式冷凍離心機、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀。

2

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5.2.3待檢樣品

處理后的樣品或細胞培養(yǎng)物。

5.2.4病毒RNA提取

使用病毒RNA提取試劑盒提取已處理的待檢樣品、陰性對照樣品、陽性對照樣品RNA，并使用核酸分

析儀對RNA質(zhì)量及濃度進行測定。

5.2.5RT-PCR反應(yīng)體系

5.2.5.1RT反應(yīng)

引物CPIV3-F/CPIV3-R按照附錄A.3進行引物序列合成并用無菌的DEPC處理水配制成10μmol/L。

20μL體系：下游引物1μL，dNTPMixture1μL，模板RNA2μL，RNaseFreedH2O6μL。65℃保溫

5min后，轉(zhuǎn)至冰上迅速冷卻。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μL，RNase

Inhibitor(40U/μL)0.5μL(20U)，PrimeScriptIIRTase(200U/μL)1μL，RNaseFree

dH2O4.5μL，緩慢混勻。反應(yīng)條件為42℃45min，95℃5min，然后冰上冷卻。

5.2.5.2PCR反應(yīng)

5.2.5.2.1反應(yīng)體系

Premix溶液12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，RNaseFreedH2O9.5μL。

5.2.5.2.2反應(yīng)條件

95℃預(yù)變性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10min。

5.2.6PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳和成像

取PCR產(chǎn)物10μL，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V，時間30min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像

系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

5.2.7結(jié)果判定

當(dāng)陽性對照樣品出現(xiàn)400bp擴增帶、陰性對照樣品無擴增帶出現(xiàn)時，試驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)

400bp擴增帶為羊副流感病毒陽性，否則為陰性（見附錄A中圖A.2）。

間接ELISA抗體檢測

5.3.1試劑耗材

CPIV3重組N蛋白、陰性血清、陽性血清、辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊二抗、酶標(biāo)板、TMB底物顯

色試劑盒，抗原包被緩沖液、洗滌液、封閉液、終止液按照附錄B配制，用水標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB/T6682要求。

5.3.2儀器

水浴鍋、溫箱、洗板機、微量振蕩器、酶標(biāo)儀、移液器。

5.3.3操作方法

5.3.3.1抗原包被

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將CPIV3重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.05μg/mL，每孔100μL包被96孔酶標(biāo)板，4℃

包被16h。

5.3.3.2洗板

甩掉孔內(nèi)的包被液，以洗滌液洗滌三次，用量為200μL/孔。

5.3.3.3封閉

每孔加封閉液，用量為200μL/孔，置37℃封閉1h,洗滌三次。

5.3.3.4加樣

陰、陽性血清和被檢血清均用封閉液作200倍稀釋，每個樣品兩個平行，每孔100μL，每塊板均設(shè)

陰、陽性血清及稀釋液對照各2孔。加樣完畢后封板，放于37℃孵育1h，洗滌三次。

5.3.3.5加酶標(biāo)記抗體

每孔加入用封閉液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)記抗體100μL，置37℃再孵育1h，洗滌三次。

5.3.3.6加底物溶液

加入顯色底物（TMB）溶液100μL/孔，置37℃避光反應(yīng)15min。

5.3.3.7終止反應(yīng)

加入終止液50μL/孔,混勻后即刻測量OD450值。

5.3.4結(jié)果判定

P/N比法：被檢樣品(P)的吸光度值和陰性對照樣品(N)值之比。

P/N≤1.50判為陰性

2.0＞P/N＞1.50判為可疑

P/N≥2.0判為陽性

6綜合判定

經(jīng)4判定為疑似CPIV3感染病例，經(jīng)5.1或5.2其中一種方法檢測出CPIV3，判為羊副流感病毒

3型感染。

臨床無明顯特異癥狀的非免疫動物經(jīng)5.3檢測出CPIV3，判為羊副流感病毒3型感染。

4

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A

A

附錄A

（資料性）

病毒分離鑒定

A.1羊副流感病毒3型簡介

羊副流感病毒3型（Caprineparainfluenzavirustype3，CPIV3）屬于副黏病毒科，呼吸道病毒

屬成員，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒。數(shù)據(jù)表明，我國CPIV3在山羊和綿羊群流行率較高，可通過糞便

-口腔或空氣傳播。羊副流感病毒3型可引起羊發(fā)熱（體溫大于等于40℃）、呼吸困難、流漿液性或黏

膿性鼻液和咳嗽等呼吸道癥狀，如繼發(fā)細菌或支原體感染可引起病情加重，導(dǎo)致呼吸道疾病綜合征，造

成宿主的死亡。自然感染與人工感染均可對山羊和綿羊產(chǎn)生致病性。病理剖檢可見肺部實變。

A.2CPIV3病變示意圖

CPIV3病變示意圖見圖A.1。

注：圖A：正常MDBK細胞對照圖；圖B：CPIV3感染MDBK細胞病變圖。

圖A.1CPIV3病變示意圖

A.3PCR引物

A.3.1引物信息

PCR引物序列見表A.1

表A.1PCR引物序列

引物序列(5’-3’)位置目的片段參考毒株

CPIV3-FCATTGAATTCATACTCAGCAC

1-400400bpAF035681.1

CPIV3-RAGATTGTCGCATTTRCCTC

A.3.2引物溶解

上下游引物用無菌的DEPC處理水配制成10μmol/L。

A.3.3羊副流感病毒3型非結(jié)構(gòu)蛋白C基因PCR產(chǎn)物核苷酸序列

CATTGAATTCATACTCAGCACAGATACCCAAGAAAGTCCAATCAACGATGACGGAATCACAGCCGGAGAAACAAAACTTAGCTCA

ACAATCTTCCAAACAGAGTCCCAAGCAGCCAAAATATACAGGGAAAATAGTGGATCAATTGACCAAGATAGATGGGCTAGGCCATCATA

CAAATATACCACAAAAACAGAAAATAGAGATGTTGATCAAGAGGTTATACAGAGAGGAGATAGGCGAAGAAGCAGCGCAAGTGGTGGAA

5

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CTAAGATTATGGGCGATGGAAGGGTCTCCAGAAGCAGCACGGATCCTAGCCATGGATCCCAAGTCCAGGAGGGTACTGATAACAATGAA

ATTGGAGAGATGGATACGAACTCTCCTCAGAGGTAAATGCGACAATCT

A.4電泳結(jié)果

電泳結(jié)果見圖A.2。

注：M：DL2000；1：陰性對照；2：陽性對照。

圖A.2PCR電泳圖

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B

B