基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測新策略與應(yīng)用探索一、引言1.1microRNA概述microRNA（miRNA）是一類長度約為21-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于動(dòng)植物、病毒等真核生物中。1993年，科學(xué)家在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了miRNA——lin-4，這一發(fā)現(xiàn)開啟了miRNA研究的大門。隨著研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到miRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著極為重要的作用。截至目前，根據(jù)miRBase的最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，已發(fā)現(xiàn)的人類miRNA前體有1982條，成熟miRNA有2694條。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，miRNA通常由基因組DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），其長度可達(dá)數(shù)千堿基對(duì)，具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Drosha和輔助因子DGCR8蛋白識(shí)別，并在距離pri-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)分界點(diǎn)約11個(gè)堿基處被剪切，形成長度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA呈發(fā)夾狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，pre-miRNA通過核孔轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在多種蛋白和Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Dicer的作用下，被進(jìn)一步切割形成miRNA雙鏈。miRNA雙鏈與包括Argonaute蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合，形成靶向mRNA的沉默復(fù)合體RISC（RNAinducedsilencingcomplex），又稱為miRNP（microribonucleoprotein）。在這一過程中，miRNA雙鏈中5′-端堿基配對(duì)穩(wěn)定性較差的鏈被保留，形成成熟的miRNA，另一條鏈則會(huì)被迅速降解。miRNA在生物體內(nèi)參與了眾多重要的生物學(xué)過程。在細(xì)胞增殖過程中，miRNA可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA能夠抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡方面，miRNA也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一些miRNA可以通過靶向凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，特定的miRNA表達(dá)水平發(fā)生變化，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)或抑制細(xì)胞凋亡程序，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在細(xì)胞分化過程中，miRNA同樣不可或缺。不同的miRNA在細(xì)胞分化的不同階段發(fā)揮作用，它們通過調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化。在胚胎發(fā)育過程中，特定的miRNA表達(dá)模式?jīng)Q定了細(xì)胞的分化命運(yùn)，促使胚胎細(xì)胞逐漸分化形成各種組織和器官。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在癌癥領(lǐng)域，大量研究表明miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。某些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-21在多種癌癥中高表達(dá)，它可以通過靶向抑制腫瘤抑制基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。相反，一些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，失去了對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-34家族在多種腫瘤中表達(dá)降低，其靶基因包括一些與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，miR-34家族表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致這些靶基因的異常表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在心血管疾病方面，miRNA也參與了疾病的病理過程。例如，miR-126與血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。當(dāng)miR-126表達(dá)降低時(shí)，會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病，也發(fā)現(xiàn)了miRNA的表達(dá)異常。這些異常表達(dá)的miRNA可能通過調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的存活、凋亡、突觸功能等，參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制。1.2microRNA檢測的重要性microRNA檢測在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有至關(guān)重要的意義，尤其是在疾病的早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評(píng)估方面，發(fā)揮著不可替代的關(guān)鍵作用。在疾病早期診斷中，microRNA作為一類極具潛力的生物標(biāo)志物，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。許多疾病在早期階段，機(jī)體尚未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但體內(nèi)的microRNA表達(dá)譜已發(fā)生特異性改變。以癌癥為例，癌癥的早期診斷對(duì)于提高患者的治愈率和生存率至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，多種癌癥在早期階段都有特定的microRNA表達(dá)特征。在肺癌早期，miR-126、miR-21等的表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)顯著變化。通過檢測血液、痰液等樣本中這些microRNA的表達(dá)，能夠在癌癥發(fā)生的早期階段實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測，為患者爭取寶貴的治療時(shí)間。據(jù)相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)顯示，基于microRNA檢測的肺癌早期診斷方法，相較于傳統(tǒng)的診斷方法，靈敏度提高了20%-30%，特異性也有顯著提升。在乳腺癌早期診斷中，miR-155、miR-221等被證實(shí)具有重要的診斷價(jià)值。一項(xiàng)針對(duì)1000例乳腺癌患者和500例健康對(duì)照人群的研究表明，通過檢測血液中這兩種microRNA的表達(dá)水平，能夠準(zhǔn)確區(qū)分乳腺癌患者和健康人群，準(zhǔn)確率達(dá)到85%以上。這些研究充分表明，microRNA檢測為癌癥等疾病的早期診斷提供了新的思路和方法，有助于實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。在治療監(jiān)測方面，microRNA檢測能夠?qū)崟r(shí)反映患者對(duì)治療的反應(yīng)，為醫(yī)生調(diào)整治療方案提供重要依據(jù)。在腫瘤化療過程中，患者對(duì)化療藥物的敏感性存在個(gè)體差異，部分患者可能會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果不佳。研究發(fā)現(xiàn)，某些microRNA的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)。miR-34a可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。在臨床治療中，通過定期檢測患者血液或腫瘤組織中miR-34a的表達(dá)水平，醫(yī)生能夠及時(shí)了解患者對(duì)順鉑的治療反應(yīng)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)水平較低，提示患者可能對(duì)順鉑耐藥時(shí)，醫(yī)生可以及時(shí)調(diào)整治療方案，更換化療藥物或采用聯(lián)合治療的方式，提高治療效果。在靶向治療中，microRNA檢測同樣具有重要意義。對(duì)于接受表皮生長因子受體（EGFR）靶向治療的非小細(xì)胞肺癌患者，miR-129-5p的表達(dá)水平與治療效果密切相關(guān)。通過檢測miR-129-5p的表達(dá)，醫(yī)生可以預(yù)測患者對(duì)靶向治療的響應(yīng)情況，為個(gè)性化治療提供有力支持。在預(yù)后評(píng)估方面，microRNA檢測能夠幫助醫(yī)生判斷患者的疾病預(yù)后，為患者提供更合理的康復(fù)建議和隨訪計(jì)劃。大量研究表明，不同的microRNA表達(dá)譜與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，高表達(dá)的miR-21與患者的不良預(yù)后相關(guān)，患者的復(fù)發(fā)率和死亡率較高。而低表達(dá)的miR-34a則提示患者的預(yù)后較好，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低。通過檢測結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中miR-21和miR-34a的表達(dá)水平，醫(yī)生可以準(zhǔn)確評(píng)估患者的預(yù)后情況，為患者制定個(gè)性化的康復(fù)計(jì)劃和隨訪方案。對(duì)于預(yù)后較差的患者，醫(yī)生可以加強(qiáng)隨訪頻率，密切關(guān)注患者的病情變化，及時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)跡象并采取相應(yīng)的治療措施。對(duì)于預(yù)后較好的患者，可以適當(dāng)減少隨訪次數(shù)，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力。1.3傳統(tǒng)microRNA檢測方法及局限性由于miRNA具有片段短小、表達(dá)豐度低、家族成員序列相似度高等特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測存在一定的挑戰(zhàn)。目前，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法主要包括基于雜交的檢測方法和基于擴(kuò)增的檢測方法，這些方法在miRNA檢測中發(fā)揮了重要作用，但也存在一些局限性。1.3.1基于雜交的檢測方法基于雜交的檢測方法是利用核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將標(biāo)記的探針與樣本中的miRNA進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的檢測。這類方法中較為典型的是Northernblot和微陣列技術(shù)。Northernblot是一種經(jīng)典的基于核酸雜交的RNA檢測技術(shù)，也是最早用于miRNA檢測的方法之一。其基本原理是：首先提取樣本中的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳或脲-聚丙烯酰胺凝膠電泳，依據(jù)RNA分子的大小對(duì)其進(jìn)行分離。隨后，將分離后的RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，并使RNA固定在膜上。接著，用放射性同位素（如32P）、熒光素或地高辛等標(biāo)記的含有miRNA互補(bǔ)序列的DNA探針與固定在膜上的miRNA進(jìn)行雜交。雜交完成后，洗去未雜交的探針，通過放射自顯影、熒光掃描或化學(xué)發(fā)光等方法檢測雜交信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的定性和半定量分析。雖然Northernblot是檢測miRNAs的標(biāo)準(zhǔn)方法，常用于評(píng)價(jià)其它miRNAs檢測方法的可靠性，但它存在諸多缺點(diǎn)。操作步驟繁瑣，涉及RNA提取、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、雜交、洗膜和信號(hào)檢測等多個(gè)步驟，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)較長，通常需要2-3天。檢測靈敏度較低，其檢測限一般為納摩爾級(jí)別（nmol/L），對(duì)于低豐度表達(dá)的miRNA，難以準(zhǔn)確檢測。該方法為低通量檢測，一次只能檢測一種或少數(shù)幾種miRNA，無法滿足對(duì)大量miRNA同時(shí)檢測的需求。實(shí)驗(yàn)過程中需要使用放射性探針，這不僅會(huì)帶來健康和環(huán)境安全問題，還需要專門的防護(hù)設(shè)施和處理設(shè)備。此外，該方法對(duì)RNA樣本的需求量較大，一般需要10-30μg的總RNA，對(duì)于一些來源有限的樣本，可能無法滿足檢測要求。微陣列技術(shù)，也稱為基因芯片技術(shù)，是一種高通量的核酸檢測方法，可用于大規(guī)模檢測miRNA的表達(dá)譜。其原理是將大量已知序列的寡核苷酸探針固定在固相載體（如玻璃片、硅片或尼龍膜）表面，形成微陣列。提取樣本中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成熒光團(tuán)或生物素標(biāo)記的cDNA。將標(biāo)記后的cDNA與微陣列上的探針進(jìn)行雜交，雜交完成后，通過熒光掃描或化學(xué)發(fā)光等方法檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)度。信號(hào)強(qiáng)度與樣本中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA表達(dá)水平的定量分析。如果雜交的cDNA被生物素化，可利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記；若cDNA直接被熒光團(tuán)標(biāo)記，則可直接測量每孔的熒光強(qiáng)度以確定miRNA的表達(dá)水平。微陣列技術(shù)能夠在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測數(shù)百個(gè)甚至數(shù)千個(gè)miRNA，具有高通量的優(yōu)勢，適用于大規(guī)模的miRNA表達(dá)譜分析，在疾病的診斷、分類和預(yù)后研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。然而，該技術(shù)也存在一些局限性。成本較高，包括芯片的制備、檢測儀器的購置以及實(shí)驗(yàn)試劑的消耗等，使得其應(yīng)用受到一定限制。操作復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備，實(shí)驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)誤差。特異性較差，由于miRNA序列較短，家族成員之間序列相似度高，容易出現(xiàn)非特異性雜交，導(dǎo)致檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性受到影響。對(duì)低豐度表達(dá)的miRNA檢測靈敏度較低，可能會(huì)遺漏一些重要的miRNA信息。1.3.2基于擴(kuò)增的檢測方法基于擴(kuò)增的檢測方法主要是通過對(duì)miRNA或其互補(bǔ)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，增加目標(biāo)分子的數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的高靈敏檢測。這類方法中最常用的是RT-qPCR和二代測序技術(shù)。RT-qPCR，即逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是目前miRNA定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法之一。由于成熟miRNA序列較短，無法像mRNA那樣按常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，科研工作者對(duì)傳統(tǒng)的qRT-PCR方法進(jìn)行了改進(jìn)，目前主要有加尾法和莖環(huán)法兩種方法。加尾法是先在miRNA的3′端添加poly（A）尾，然后用3′端帶有標(biāo)簽的poly（T）引物進(jìn)行通用的逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，熒光探針會(huì)與模板結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的定量檢測。莖環(huán)法是利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，以達(dá)到延長miRNA長度的目的。莖環(huán)引物是長度約為45bp且能夠?qū)崿F(xiàn)自身環(huán)化的序列，每一個(gè)miRNA都有自己獨(dú)特的莖環(huán)引物，其結(jié)構(gòu)為5′端的環(huán)化序列+3′端的miRNA的特定互補(bǔ)序列。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，莖環(huán)引物與miRNA序列結(jié)合，起到延長miRNA的作用，后續(xù)的PCR擴(kuò)增和檢測過程與加尾法類似。RT-qPCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、動(dòng)態(tài)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Φ拓S度表達(dá)的miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣本中多個(gè)miRNA的同時(shí)定量分析。該方法也存在一些缺點(diǎn)。對(duì)設(shè)備要求較高，需要配備熒光定量PCR儀等專業(yè)設(shè)備，設(shè)備價(jià)格昂貴，維護(hù)成本高，限制了其在一些基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。操作復(fù)雜，涉及RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增等多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，否則容易出現(xiàn)誤差。實(shí)驗(yàn)過程中容易受到污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，引物設(shè)計(jì)困難，尤其是對(duì)于一些序列相似的miRNA家族成員，需要設(shè)計(jì)高度特異性的引物，增加了實(shí)驗(yàn)的難度和成本。二代測序技術(shù)，也稱為新一代測序技術(shù)，是一種高通量的核酸測序方法，可用于全面分析miRNA的表達(dá)譜和序列信息。其基本原理是將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行片段化處理，并在片段兩端連接上特定的接頭。將連接接頭后的cDNA片段構(gòu)建成文庫，通過橋式PCR等技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，最后利用測序儀對(duì)擴(kuò)增后的文庫進(jìn)行高通量測序。通過對(duì)測序數(shù)據(jù)的分析，可以獲得樣本中miRNA的種類、表達(dá)水平以及序列變異等信息。二代測序技術(shù)具有高通量、高分辨率、能夠發(fā)現(xiàn)新的miRNA等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)樣本中的所有miRNA進(jìn)行無偏倚的檢測和分析，為miRNA的研究提供了全面、深入的信息。然而，該技術(shù)也存在一些局限性。成本較高，包括文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)，需要耗費(fèi)大量的資金和時(shí)間。數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，產(chǎn)生的海量測序數(shù)據(jù)需要專業(yè)的生物信息學(xué)知識(shí)和軟件進(jìn)行分析和解讀，對(duì)研究人員的技術(shù)要求較高。實(shí)驗(yàn)過程中需要使用大量的試劑和耗材，且對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作要求嚴(yán)格，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差。此外，由于測序深度的限制，對(duì)于低豐度表達(dá)的miRNA，可能存在檢測不準(zhǔn)確或遺漏的情況。1.4電化學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)勢電化學(xué)檢測技術(shù)作為一種重要的分析檢測手段，在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，尤其在即時(shí)檢測（POCT）中具有巨大的應(yīng)用潛力，為疾病的快速診斷和監(jiān)測提供了新的解決方案。電化學(xué)檢測技術(shù)具有極高的靈敏度。它能夠檢測到極低濃度的目標(biāo)物質(zhì)，這是許多傳統(tǒng)檢測方法難以企及的。在檢測重金屬離子時(shí)，基于陽極溶出伏安法的電化學(xué)傳感器可以檢測到低至納摩爾級(jí)別的重金屬離子濃度。這種高靈敏度使得電化學(xué)檢測技術(shù)在生物標(biāo)志物檢測中具有重要應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤標(biāo)志物檢測中，電化學(xué)免疫傳感器能夠靈敏地檢測到血液中微量的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等。研究表明，某些基于納米材料修飾電極的電化學(xué)免疫傳感器對(duì)CEA的檢測限可低至皮克每毫升（pg/mL）級(jí)別，能夠在腫瘤早期，當(dāng)腫瘤標(biāo)志物含量極低時(shí)就實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測，為腫瘤的早期診斷提供有力支持。電化學(xué)檢測技術(shù)的響應(yīng)速度快也是其一大突出優(yōu)勢。相比于一些傳統(tǒng)的檢測方法，如色譜分析、質(zhì)譜分析等，需要復(fù)雜的樣品前處理和較長的檢測時(shí)間，電化學(xué)檢測能夠在短時(shí)間內(nèi)給出檢測結(jié)果。在血糖檢測中，電化學(xué)血糖儀通過檢測血液中葡萄糖在電極表面的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)，能夠在幾秒鐘內(nèi)準(zhǔn)確測量出血糖濃度，為糖尿病患者的日常血糖監(jiān)測提供了極大的便利。在環(huán)境污染物檢測中，電化學(xué)傳感器可以實(shí)時(shí)快速地檢測水中的有機(jī)污染物和重金屬離子，及時(shí)反映環(huán)境質(zhì)量狀況，為環(huán)境監(jiān)測和污染治理提供及時(shí)的數(shù)據(jù)支持。該技術(shù)設(shè)備具有便攜性的特點(diǎn)。隨著微納加工技術(shù)和材料科學(xué)的不斷發(fā)展，電化學(xué)檢測設(shè)備逐漸向小型化、集成化方向發(fā)展?，F(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了許多便攜式的電化學(xué)檢測儀器，如手持式電化學(xué)分析儀、可穿戴式電化學(xué)傳感器等。這些設(shè)備體積小巧、重量輕，便于攜帶和操作，能夠滿足現(xiàn)場檢測和即時(shí)檢測的需求。在現(xiàn)場水質(zhì)檢測中，工作人員可以攜帶便攜式電化學(xué)水質(zhì)分析儀，隨時(shí)隨地對(duì)水中的酸堿度、溶解氧、重金屬離子等參數(shù)進(jìn)行檢測，無需將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)雜的分析。在家庭健康監(jiān)測領(lǐng)域，可穿戴式電化學(xué)傳感器可以實(shí)時(shí)監(jiān)測人體的生理參數(shù)，如心率、血壓、血糖等，并將數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳輸?shù)绞謾C(jī)或其他智能設(shè)備上，方便用戶隨時(shí)了解自己的健康狀況。操作簡便也是電化學(xué)檢測技術(shù)的一大優(yōu)勢。其檢測過程通常不需要復(fù)雜的樣品前處理和專業(yè)的技術(shù)人員。對(duì)于一些簡單的電化學(xué)檢測項(xiàng)目，如常見離子濃度的檢測，普通操作人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可熟練掌握檢測方法。在食品安全檢測中，利用電化學(xué)傳感器檢測食品中的農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等有害物質(zhì)，操作簡單快捷，不需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量食品樣本進(jìn)行快速篩查，保障食品安全。在即時(shí)檢測方面，電化學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)勢得到了充分的體現(xiàn)。POCT要求檢測設(shè)備能夠在現(xiàn)場快速、準(zhǔn)確地給出檢測結(jié)果，為臨床診斷和治療提供及時(shí)的依據(jù)。電化學(xué)檢測技術(shù)正好滿足了這些要求。在急診醫(yī)學(xué)中，對(duì)于急性心肌梗死、腦卒中患者的快速診斷至關(guān)重要。利用電化學(xué)免疫傳感器可以快速檢測血液中的心肌標(biāo)志物和神經(jīng)標(biāo)志物，如肌鈣蛋白、腦鈉肽等，在幾分鐘內(nèi)就能夠做出診斷，為患者的及時(shí)治療爭取寶貴的時(shí)間。在基層醫(yī)療單位和偏遠(yuǎn)地區(qū)，由于醫(yī)療資源相對(duì)匱乏，電化學(xué)檢測技術(shù)的便攜性和操作簡便性使其成為一種理想的檢測手段。基層醫(yī)生可以使用便攜式電化學(xué)檢測設(shè)備對(duì)患者進(jìn)行常見疾病的篩查和診斷，提高醫(yī)療服務(wù)的可及性。二、多重信號(hào)放大技術(shù)原理與分類2.1信號(hào)放大原理基礎(chǔ)信號(hào)放大技術(shù)的核心在于通過特定的機(jī)制增加檢測信號(hào)的強(qiáng)度，從而提高檢測方法的靈敏度。在分析檢測領(lǐng)域，檢測信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)物質(zhì)的含量密切相關(guān)，但由于實(shí)際樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度往往較低，直接檢測時(shí)信號(hào)微弱，難以準(zhǔn)確測定。以電化學(xué)檢測技術(shù)為例，其檢測信號(hào)通常來源于電活性物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流、電位或電容變化。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)為電活性物質(zhì)時(shí)，其在電極表面的反應(yīng)活性和濃度決定了檢測信號(hào)的大小。在檢測重金屬離子時(shí)，重金屬離子在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的電流信號(hào)。然而，當(dāng)樣品中重金屬離子濃度極低時(shí)，產(chǎn)生的電流信號(hào)非常微弱，容易受到噪聲干擾，導(dǎo)致檢測誤差較大。為了提高檢測靈敏度，需要增加電活性物質(zhì)的濃度，從而增強(qiáng)檢測信號(hào)。在傳統(tǒng)的電化學(xué)檢測中，通常采用增加目標(biāo)物質(zhì)濃度的方法來提高信號(hào)強(qiáng)度，但這種方法受到樣品中目標(biāo)物質(zhì)含量的限制，對(duì)于低濃度樣品效果不佳。而信號(hào)放大技術(shù)則通過引入額外的信號(hào)放大步驟，巧妙地解決了這一問題。在基于酶標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器中，利用酶的催化作用，將大量的底物轉(zhuǎn)化為電活性產(chǎn)物，從而顯著增加了電活性物質(zhì)的濃度，實(shí)現(xiàn)了檢測信號(hào)的放大。在檢測腫瘤標(biāo)志物時(shí)，將酶標(biāo)記在抗體上，當(dāng)抗體與腫瘤標(biāo)志物特異性結(jié)合后，加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，生成大量的電活性產(chǎn)物，這些電活性產(chǎn)物在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的電流信號(hào)，使得檢測靈敏度大幅提高。二、多重信號(hào)放大技術(shù)原理與分類2.1信號(hào)放大原理基礎(chǔ)信號(hào)放大技術(shù)的核心在于通過特定的機(jī)制增加檢測信號(hào)的強(qiáng)度，從而提高檢測方法的靈敏度。在分析檢測領(lǐng)域，檢測信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)物質(zhì)的含量密切相關(guān)，但由于實(shí)際樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度往往較低，直接檢測時(shí)信號(hào)微弱，難以準(zhǔn)確測定。以電化學(xué)檢測技術(shù)為例，其檢測信號(hào)通常來源于電活性物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流、電位或電容變化。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)為電活性物質(zhì)時(shí)，其在電極表面的反應(yīng)活性和濃度決定了檢測信號(hào)的大小。在檢測重金屬離子時(shí)，重金屬離子在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的電流信號(hào)。然而，當(dāng)樣品中重金屬離子濃度極低時(shí)，產(chǎn)生的電流信號(hào)非常微弱，容易受到噪聲干擾，導(dǎo)致檢測誤差較大。為了提高檢測靈敏度，需要增加電活性物質(zhì)的濃度，從而增強(qiáng)檢測信號(hào)。在傳統(tǒng)的電化學(xué)檢測中，通常采用增加目標(biāo)物質(zhì)濃度的方法來提高信號(hào)強(qiáng)度，但這種方法受到樣品中目標(biāo)物質(zhì)含量的限制，對(duì)于低濃度樣品效果不佳。而信號(hào)放大技術(shù)則通過引入額外的信號(hào)放大步驟，巧妙地解決了這一問題。在基于酶標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器中，利用酶的催化作用，將大量的底物轉(zhuǎn)化為電活性產(chǎn)物，從而顯著增加了電活性物質(zhì)的濃度，實(shí)現(xiàn)了檢測信號(hào)的放大。在檢測腫瘤標(biāo)志物時(shí)，將酶標(biāo)記在抗體上，當(dāng)抗體與腫瘤標(biāo)志物特異性結(jié)合后，加入酶的底物，酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，生成大量的電活性產(chǎn)物，這些電活性產(chǎn)物在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的電流信號(hào)，使得檢測靈敏度大幅提高。2.2常見多重信號(hào)放大技術(shù)2.2.1酶催化信號(hào)放大技術(shù)酶催化信號(hào)放大技術(shù)是基于酶的高效催化活性，通過酶促反應(yīng)將底物轉(zhuǎn)化為大量可檢測的信號(hào)分子，從而實(shí)現(xiàn)檢測信號(hào)的顯著增強(qiáng)。在眾多酶中，辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）是該技術(shù)中最為常用的兩種酶。HRP廣泛存在于植物界，是一種含血紅素的糖蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為40kDa。HRP催化的底物顯色反應(yīng)在生化分析中應(yīng)用極為廣泛，其中以3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD）最為常見。以TMB作為底物時(shí)，在過氧化氫（H?O?）的存在下，HRP能夠催化TMB發(fā)生氧化反應(yīng)。TMB分子中的氨基被氧化，形成具有共軛結(jié)構(gòu)的醌式產(chǎn)物，該產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色。在酸性條件下，藍(lán)色產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，通過分光光度計(jì)在特定波長（如450nm）下檢測吸光度，可對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。研究表明，在最佳反應(yīng)條件下，一個(gè)HRP分子在1分鐘內(nèi)能夠催化數(shù)百個(gè)TMB分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生大量的顯色產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的有效放大。當(dāng)HRP標(biāo)記的抗體與抗原特異性結(jié)合后，加入TMB和H?O?底物溶液，反應(yīng)體系迅速顯色，通過檢測吸光度的變化，能夠靈敏地檢測出低至皮克級(jí)別的抗原。ALP是一組特異的磷酸酯酶，其分子質(zhì)量在80-120kDa之間，在堿性條件下具有高度的催化活性。對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP）是ALP常用的底物之一。在堿性環(huán)境中，ALP催化pNPP發(fā)生水解反應(yīng)，斷裂磷酸酯鍵，生成對(duì)硝基苯酚和磷酸。對(duì)硝基苯酚在堿性溶液中呈現(xiàn)出黃色，可在405nm波長處檢測其吸光度。由于ALP的催化效率較高，每一個(gè)ALP分子在適宜條件下能夠在短時(shí)間內(nèi)催化大量的pNPP分子水解，使得反應(yīng)體系中對(duì)硝基苯酚的濃度迅速增加，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色變化信號(hào)。在免疫檢測中，利用ALP標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合，加入pNPP底物后，通過檢測吸光度的變化，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原的高靈敏檢測。酶催化信號(hào)放大技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的顯著優(yōu)勢。由于酶的催化作用具有高度的特異性，只有特定的底物能夠在酶的作用下發(fā)生反應(yīng)，因此可以有效減少非特異性信號(hào)的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性。在檢測病毒抗原時(shí)，酶標(biāo)記的抗體能夠特異性地識(shí)別病毒抗原，避免與其他無關(guān)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而保證檢測結(jié)果的可靠性。該技術(shù)操作相對(duì)簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，在臨床診斷、食品安全檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在臨床診斷中，基于酶催化信號(hào)放大技術(shù)的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法被廣泛用于檢測各種疾病標(biāo)志物，如腫瘤標(biāo)志物、病原體抗體等。在食品安全檢測中，可用于檢測食品中的農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等有害物質(zhì)。然而，該技術(shù)也存在一些局限性。酶的活性容易受到溫度、pH值、抑制劑等因素的影響，在實(shí)際應(yīng)用中需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，以確保酶的活性和檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。酶催化反應(yīng)的底物種類相對(duì)有限，限制了該技術(shù)在某些特殊檢測中的應(yīng)用。2.2.2核酸擴(kuò)增信號(hào)放大技術(shù)核酸擴(kuò)增信號(hào)放大技術(shù)是通過對(duì)核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增，增加目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)核酸信號(hào)的顯著放大，在生物檢測和分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。常見的核酸擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）等。PCR技術(shù)由穆利斯（KaryMullis）于1983年發(fā)明，是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。其基本原理是在模板DNA、引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTPs）和耐熱DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等存在的條件下，通過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，使目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。在高溫變性階段，雙鏈DNA模板在95℃左右的高溫下解鏈成為兩條單鏈；在低溫退火階段，引物與單鏈模板DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合，形成引物-模板復(fù)合物；在適溫延伸階段，TaqDNA聚合酶以dNTPs為原料，在引物的引導(dǎo)下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從引物的3'-端開始合成新的DNA鏈。每完成一個(gè)循環(huán)，DNA分子數(shù)量增加一倍，經(jīng)過30-40個(gè)循環(huán)后，DNA量可擴(kuò)增數(shù)百萬倍。PCR技術(shù)具有極高的靈敏度和特異性，能夠檢測出極低拷貝數(shù)的目標(biāo)核酸。在臨床診斷中，PCR技術(shù)被廣泛用于檢測病原體核酸，如新冠病毒核酸檢測，通過對(duì)患者樣本中的病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，能夠快速、準(zhǔn)確地判斷患者是否感染新冠病毒。在法醫(yī)鑒定中，PCR技術(shù)可用于擴(kuò)增犯罪現(xiàn)場殘留的微量DNA，為案件偵破提供重要線索。LAMP技術(shù)是由日本學(xué)者Notomi等在2000年開發(fā)的一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶和針對(duì)靶基因的6條特異性引物，在恒溫條件下（60-65℃）實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增。LAMP技術(shù)的引物設(shè)計(jì)獨(dú)特，包括兩對(duì)內(nèi)部引物（FIP、BIP）和兩對(duì)外部引物（F3、B3）。在反應(yīng)過程中，F(xiàn)IP引物中的F1c序列與靶基因的互補(bǔ)序列結(jié)合，BstDNA聚合酶以其為引物開始合成DNA鏈，同時(shí)置換出下游的單鏈DNA。隨后，B3引物與被置換出的單鏈DNA結(jié)合，啟動(dòng)新一輪的DNA合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的DNA模板。該模板可在自身引發(fā)下進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，形成大量具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA產(chǎn)物。LAMP技術(shù)的擴(kuò)增效率極高，在1小時(shí)內(nèi)可使核酸擴(kuò)增10?-101?倍。其反應(yīng)結(jié)果可通過肉眼觀察白色焦磷酸鎂沉淀的生成或使用熒光染料進(jìn)行檢測。在病原體檢測中，LAMP技術(shù)可快速檢測出細(xì)菌、病毒等病原體的核酸，如對(duì)結(jié)核桿菌的檢測，LAMP技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，且操作簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場檢測。RCA技術(shù)是一種借鑒自然界中環(huán)狀DNA或RNA分子滾環(huán)復(fù)制過程發(fā)展而來的體外等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。RCA反應(yīng)需要環(huán)狀DNA模板、與模板部分互補(bǔ)的DNA/RNA引發(fā)鏈、具有鏈置換活性的DNA/RNA聚合酶（如Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶）和脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）等組分。在反應(yīng)過程中，環(huán)狀DNA模板在DNA連接酶的作用下環(huán)化，引發(fā)鏈與環(huán)狀模板的特定區(qū)域結(jié)合，DNA聚合酶以環(huán)狀模板為模板，從引發(fā)鏈的3'-端開始合成新的DNA鏈。在合成過程中，DNA聚合酶持續(xù)將dNTPs添加到新合成的DNA鏈上，同時(shí)置換出已合成的DNA鏈，形成具有重復(fù)串聯(lián)序列的單鏈DNA分子。Phi29DNA聚合酶具有強(qiáng)大的5'-3'聚合活性和3'-5'外切酶活性，在30℃左右的最適溫度下，能夠在20分鐘內(nèi)產(chǎn)生大于70kbp的擴(kuò)增子，擴(kuò)增靈敏度可達(dá)到單分子拷貝水平。RCA技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可用于檢測核酸、蛋白質(zhì)等生物分子。在檢測microRNA時(shí)，通過設(shè)計(jì)特異性的環(huán)狀探針，利用RCA技術(shù)對(duì)與microRNA互補(bǔ)的序列進(jìn)行擴(kuò)增，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)低豐度microRNA的高靈敏檢測。2.2.3納米材料輔助信號(hào)放大技術(shù)納米材料輔助信號(hào)放大技術(shù)是利用納米材料獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，如大比表面積、良好的導(dǎo)電性、熒光特性等，實(shí)現(xiàn)檢測信號(hào)的有效放大，在生物分析和檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。金納米顆粒（AuNPs）、碳納米材料（如碳納米管、石墨烯）等是該技術(shù)中常用的納米材料。AuNPs是一種具有獨(dú)特光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)的納米材料，其粒徑通常在1-100nm之間。AuNPs具有較大的比表面積，能夠提供大量的表面活性位點(diǎn)，可高效地負(fù)載生物分子，如抗體、核酸等，從而顯著增強(qiáng)檢測信號(hào)。在免疫檢測中，將AuNPs標(biāo)記在抗體上，由于AuNPs的大比表面積，每個(gè)AuNPs可以連接多個(gè)抗體分子。當(dāng)標(biāo)記有AuNPs的抗體與抗原特異性結(jié)合后，在后續(xù)的檢測過程中，AuNPs能夠放大檢測信號(hào)。利用銀增強(qiáng)技術(shù)，在AuNPs表面沉積銀原子，使AuNPs的尺寸增大，從而進(jìn)一步增強(qiáng)其光學(xué)信號(hào)，提高檢測靈敏度。AuNPs還具有良好的表面等離子體共振（SPR）特性，其表面等離子體共振波長會(huì)隨著周圍環(huán)境的變化而發(fā)生改變。當(dāng)AuNPs與目標(biāo)分子結(jié)合后，其周圍的電子云密度發(fā)生變化，導(dǎo)致SPR波長發(fā)生位移，通過檢測SPR波長的變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的高靈敏檢測。在檢測腫瘤標(biāo)志物時(shí)，基于AuNPs的SPR生物傳感器能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出低濃度的腫瘤標(biāo)志物，檢測限可達(dá)到納摩爾級(jí)別。碳納米管是由碳原子組成的具有管狀結(jié)構(gòu)的納米材料，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為單壁碳納米管（SWCNTs）和多壁碳納米管（MWCNTs）。碳納米管具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和高的機(jī)械強(qiáng)度。在電化學(xué)生物傳感器中，將碳納米管修飾在電極表面，能夠顯著提高電極的電子傳遞速率，增強(qiáng)電信號(hào)的檢測。碳納米管修飾的電極可以促進(jìn)電活性物質(zhì)在電極表面的氧化還原反應(yīng)，使檢測信號(hào)增強(qiáng)。在檢測神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)，基于碳納米管修飾電極的電化學(xué)生物傳感器能夠靈敏地檢測出多巴胺、腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)，檢測靈敏度比傳統(tǒng)電極提高數(shù)倍。此外，碳納米管還具有良好的生物相容性，能夠與生物分子（如酶、抗體等）進(jìn)行有效的結(jié)合，為構(gòu)建高性能的生物傳感器提供了有利條件。石墨烯是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料。石墨烯具有極高的載流子遷移率和良好的電學(xué)性能，其理論比表面積高達(dá)2630m2/g。在生物檢測中，石墨烯可作為信號(hào)放大材料，提高檢測靈敏度。將石墨烯與核酸適配體結(jié)合，構(gòu)建基于石墨烯的熒光生物傳感器。當(dāng)目標(biāo)分子與核酸適配體特異性結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致核酸適配體的構(gòu)象發(fā)生變化，從而使石墨烯與核酸適配體之間的相互作用改變，熒光信號(hào)發(fā)生變化。由于石墨烯的熒光猝滅效應(yīng)，在未結(jié)合目標(biāo)分子時(shí)，熒光信號(hào)較弱；當(dāng)結(jié)合目標(biāo)分子后，熒光信號(hào)增強(qiáng)，通過檢測熒光信號(hào)的變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測。在檢測蛋白質(zhì)時(shí)，基于石墨烯的熒光生物傳感器能夠檢測到低至皮摩爾級(jí)別的蛋白質(zhì)，具有較高的靈敏度和選擇性。2.2.4生物親和作用信號(hào)放大技術(shù)生物親和作用信號(hào)放大技術(shù)是基于生物分子之間特異性、高親和力的結(jié)合特性，如抗原-抗體、生物素-鏈霉親和素等，實(shí)現(xiàn)檢測信號(hào)的放大，在生物檢測和分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用?？乖?抗體特異性結(jié)合是免疫檢測的基礎(chǔ)，其結(jié)合具有高度的特異性和親和力。在免疫檢測中，利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，將抗體標(biāo)記上可檢測的信號(hào)分子（如熒光素、酶等），當(dāng)抗體與抗原結(jié)合后，通過檢測信號(hào)分子的信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的檢測。在酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）中，將抗原固定在固相載體表面，加入待檢測的抗體，抗體與抗原特異性結(jié)合后，再加入酶標(biāo)記的二抗。二抗與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入酶的底物后，酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號(hào)，如顏色變化或熒光信號(hào)。由于每個(gè)抗原分子可以結(jié)合多個(gè)抗體分子，每個(gè)抗體分子又可以結(jié)合多個(gè)酶標(biāo)二抗分子，通過這種級(jí)聯(lián)放大作用，大大增強(qiáng)了檢測信號(hào)，提高了檢測靈敏度。在檢測腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）時(shí)，利用ELISA方法，能夠檢測到低至納克每毫升（ng/mL）級(jí)別的AFP，為腫瘤的早期診斷提供了有力支持。生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)是一種具有極高親和力的生物分子相互作用體系。生物素是一種水溶性維生素，又稱維生素B7，能夠與鏈霉親和素特異性結(jié)合，其結(jié)合常數(shù)高達(dá)101?-101?M?1，比抗原-抗體的結(jié)合力強(qiáng)100萬倍。鏈霉親和素是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，每個(gè)鏈霉親和素分子可以結(jié)合4個(gè)生物素分子。在生物檢測中，將生物素標(biāo)記在抗體、抗原或核酸等生物分子上，然后利用鏈霉親和素與生物素的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，先將生物素標(biāo)記的一抗與組織切片中的抗原結(jié)合，再加入鏈霉親和素標(biāo)記的熒光素或酶。鏈霉親和素與生物素結(jié)合后，由于其多價(jià)結(jié)合特性，可同時(shí)結(jié)合多個(gè)生物素標(biāo)記的一抗分子，從而使熒光素或酶的信號(hào)得到顯著放大。通過熒光顯微鏡或顯色反應(yīng)，能夠清晰地觀察到抗原在組織中的分布和表達(dá)情況。在核酸檢測中，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，可將生物素標(biāo)記的核酸探針與目標(biāo)核酸雜交，然后通過鏈霉親和素與生物素的結(jié)合，引入可檢測的信號(hào)分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸的高靈敏檢測。三、基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法構(gòu)建3.1電極材料的選擇與修飾3.1.1常見電極材料在電化學(xué)檢測中，電極材料的選擇對(duì)檢測性能起著關(guān)鍵作用。常見的電極材料包括玻碳電極、金電極、碳納米管修飾電極等，它們各自具有獨(dú)特的特性和優(yōu)缺點(diǎn)。玻碳電極（GCE）是一種由玻璃碳制成的電極，具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性。在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等惡劣的化學(xué)環(huán)境中，玻碳電極不易被腐蝕，能夠保持電極的結(jié)構(gòu)和性能穩(wěn)定。它還具有較寬的電位窗口，一般在酸性溶液中，其電位窗口可達(dá)-1.0V至+1.5V（相對(duì)于飽和甘汞電極）。這使得玻碳電極能夠適應(yīng)多種電化學(xué)反應(yīng)的需求，可用于檢測不同類型的電活性物質(zhì)。此外，玻碳電極的導(dǎo)電性良好，能夠有效地傳導(dǎo)電子，促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。然而，玻碳電極也存在一些缺點(diǎn)，如表面容易吸附雜質(zhì)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理才能保證檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在檢測生物分子時(shí)，玻碳電極表面的吸附作用可能會(huì)導(dǎo)致生物分子的變性和失活，影響檢測結(jié)果。金電極是一種常用的貴金屬電極，具有良好的導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率高達(dá)4.1×10?S/m。這使得金電極在電化學(xué)反應(yīng)中能夠快速地傳遞電子，提高檢測的靈敏度和響應(yīng)速度。金電極的化學(xué)穩(wěn)定性也非常高，不易被氧化和腐蝕，能夠在多種環(huán)境中保持穩(wěn)定的性能。它還具有獨(dú)特的表面性質(zhì)，能夠通過自組裝等方法修飾各種生物分子，如抗體、核酸等，為生物傳感器的構(gòu)建提供了便利。金電極的成本相對(duì)較高，限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。在一些對(duì)成本敏感的檢測場景中，金電極的使用受到一定的限制。碳納米管修飾電極是在傳統(tǒng)電極表面修飾碳納米管而得到的電極。碳納米管具有優(yōu)異的電學(xué)性能，其載流子遷移率高，能夠顯著提高電極的電子傳遞速率。它還具有較大的比表面積，一般單壁碳納米管的比表面積可達(dá)1315m2/g。這使得碳納米管修飾電極能夠提供更多的活性位點(diǎn)，增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的吸附和催化作用，從而提高檢測靈敏度。碳納米管修飾電極的生物相容性良好，能夠與生物分子有效地結(jié)合，且不會(huì)對(duì)生物分子的活性產(chǎn)生明顯影響。然而，碳納米管的制備和修飾過程相對(duì)復(fù)雜，需要一定的技術(shù)和設(shè)備支持。在制備碳納米管修飾電極時(shí)，需要精確控制碳納米管的修飾量和修飾方式，以確保電極的性能穩(wěn)定。3.1.2電極修飾策略為了進(jìn)一步提高電極的性能，滿足microRNA電化學(xué)檢測的需求，常常需要對(duì)電極進(jìn)行修飾。常見的電極修飾策略包括自組裝單分子層、納米材料修飾、生物分子固定等。自組裝單分子層修飾是利用分子間的相互作用，如氫鍵、范德華力等，將具有特定功能的分子在電極表面自發(fā)組裝形成單分子層。在金電極表面，通過巰基與金原子之間的強(qiáng)相互作用，能夠自組裝形成巰基化合物的單分子層。這種修飾方式可以改變電極表面的性質(zhì)，如電荷分布、親疏水性等。通過自組裝帶有負(fù)電荷的分子，可以使電極表面帶負(fù)電，從而增強(qiáng)對(duì)帶正電的目標(biāo)物質(zhì)的吸附作用。自組裝單分子層還可以作為一種分子識(shí)別層，通過設(shè)計(jì)特定的分子結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的特異性識(shí)別。在檢測microRNA時(shí)，可以將與microRNA互補(bǔ)的寡核苷酸鏈通過自組裝固定在電極表面，當(dāng)樣品中的microRNA與寡核苷酸鏈雜交時(shí)，會(huì)引起電極表面電學(xué)性質(zhì)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的檢測。納米材料修飾是將納米材料（如金納米顆粒、碳納米管、石墨烯等）修飾在電極表面，利用納米材料的獨(dú)特性質(zhì)來提高電極的性能。金納米顆粒具有較大的比表面積，能夠負(fù)載大量的生物分子，如酶、抗體等。將金納米顆粒修飾在電極表面，可以增加電極表面的生物分子負(fù)載量，從而增強(qiáng)檢測信號(hào)。在基于酶催化信號(hào)放大的電化學(xué)檢測中，將酶標(biāo)記的金納米顆粒修飾在電極表面，當(dāng)酶催化底物反應(yīng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的電活性產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的電流信號(hào)，提高檢測靈敏度。碳納米管和石墨烯具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和高的比表面積，能夠提高電極的電子傳遞速率和對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的吸附能力。將碳納米管或石墨烯修飾在電極表面，可以促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，增強(qiáng)檢測信號(hào)。在檢測microRNA時(shí)，基于碳納米管修飾電極的電化學(xué)傳感器能夠有效地捕獲樣品中的microRNA，提高檢測的靈敏度和選擇性。生物分子固定是將具有特異性識(shí)別能力的生物分子（如抗體、核酸適配體等）固定在電極表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的特異性檢測。在檢測microRNA時(shí)，將與microRNA互補(bǔ)的核酸適配體固定在電極表面，核酸適配體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合microRNA。當(dāng)microRNA與核酸適配體結(jié)合后，會(huì)引起電極表面電學(xué)性質(zhì)的變化，如電阻、電容等的改變。通過檢測這些電學(xué)性質(zhì)的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的定量檢測。將抗體固定在電極表面，可以用于檢測與抗體特異性結(jié)合的抗原。在免疫電化學(xué)檢測中，利用抗體-抗原的特異性結(jié)合，將抗體固定在電極表面，加入抗原后，通過檢測抗原-抗體復(fù)合物在電極表面產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的檢測。3.2信號(hào)放大體系的設(shè)計(jì)與優(yōu)化3.2.1單一信號(hào)放大策略的選擇在基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法構(gòu)建中，單一信號(hào)放大策略的選擇至關(guān)重要，需綜合考慮檢測需求和樣本特點(diǎn)。對(duì)于檢測需求而言，靈敏度是首要考量因素。若旨在檢測極低濃度的microRNA，如在早期癌癥診斷中，患者樣本中的相關(guān)microRNA含量可能低至皮摩爾級(jí)別，此時(shí)核酸擴(kuò)增信號(hào)放大技術(shù)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是較為理想的選擇。PCR技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)microRNA的拷貝數(shù)擴(kuò)增數(shù)百萬倍，極大地提高了檢測靈敏度。在乳腺癌早期診斷中，通過PCR技術(shù)對(duì)血液樣本中低豐度表達(dá)的miR-155和miR-221進(jìn)行擴(kuò)增，可使其信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)至可檢測水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的早期篩查。特異性也是不容忽視的要點(diǎn)。當(dāng)需要準(zhǔn)確區(qū)分序列相似的microRNA家族成員時(shí)，生物親和作用信號(hào)放大技術(shù)憑借抗原-抗體、生物素-鏈霉親和素等生物分子之間高度特異性的結(jié)合特性，能夠有效避免交叉反應(yīng)，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在檢測miR-1和miR-133這對(duì)序列相似的microRNA時(shí)，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)標(biāo)記特異性的探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)它們的精準(zhǔn)檢測。檢測速度和通量也會(huì)影響策略的選擇。在需要快速獲得檢測結(jié)果且樣本量較大的情況下，酶催化信號(hào)放大技術(shù)由于其操作相對(duì)簡便、反應(yīng)速度快的特點(diǎn)，更具優(yōu)勢?；诶备^氧化物酶（HRP）催化的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)大量樣本中microRNA的檢測，適用于臨床大規(guī)模篩查。樣本特點(diǎn)同樣是決定單一信號(hào)放大策略的關(guān)鍵因素。樣本中microRNA的豐度是重要參考。對(duì)于豐度較高的microRNA，納米材料輔助信號(hào)放大技術(shù)即可滿足檢測需求。利用金納米顆粒（AuNPs）修飾電極，通過AuNPs的大比表面積和良好的光學(xué)性質(zhì)，能夠有效增強(qiáng)檢測信號(hào)。在檢測血液中高豐度表達(dá)的miR-16時(shí)，基于AuNPs修飾電極的電化學(xué)傳感器可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測。若樣本中microRNA豐度較低，則需選擇擴(kuò)增效率更高的策略，如滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）技術(shù)。RCA技術(shù)能夠?qū)Φ拓S度的microRNA進(jìn)行高效擴(kuò)增，在檢測腦脊液中低豐度的miR-124時(shí)，通過RCA技術(shù)可顯著提高檢測靈敏度。樣本的來源和性質(zhì)也會(huì)對(duì)策略選擇產(chǎn)生影響。對(duì)于復(fù)雜的生物樣本，如組織勻漿、細(xì)胞裂解液等，可能含有多種雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，此時(shí)生物親和作用信號(hào)放大技術(shù)的特異性優(yōu)勢能夠有效排除干擾，確保檢測的準(zhǔn)確性。在檢測組織勻漿中的microRNA時(shí)，利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，可減少雜質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的影響。而對(duì)于較為純凈的樣本，如經(jīng)過純化的RNA樣本，可根據(jù)其他檢測需求選擇合適的信號(hào)放大策略。3.2.2多重信號(hào)放大策略的組合多種信號(hào)放大策略的協(xié)同作用能夠顯著提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，在基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測中具有重要意義。酶催化與核酸擴(kuò)增結(jié)合是一種常見且有效的多重信號(hào)放大策略組合。以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）與辣根過氧化物酶（HRP）催化相結(jié)合為例，其原理在于：LAMP技術(shù)利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶和針對(duì)靶基因的6條特異性引物，在恒溫條件下（60-65℃）對(duì)目標(biāo)microRNA進(jìn)行快速擴(kuò)增，使目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)大幅增加。在檢測miR-21時(shí)，LAMP反應(yīng)能夠在1小時(shí)內(nèi)將miR-21的核酸序列擴(kuò)增10?-101?倍。然后，將擴(kuò)增產(chǎn)物與HRP標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交。HRP能夠催化底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在過氧化氫（H?O?）的存在下發(fā)生氧化反應(yīng)，生成大量的有色產(chǎn)物。一個(gè)HRP分子在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)催化數(shù)百個(gè)TMB分子反應(yīng)，從而進(jìn)一步放大檢測信號(hào)。通過檢測有色產(chǎn)物在特定波長下的吸光度，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-21的高靈敏檢測。這種組合策略的優(yōu)勢明顯，LAMP技術(shù)的高效擴(kuò)增為后續(xù)的酶催化反應(yīng)提供了大量的目標(biāo)分子，增強(qiáng)了酶催化信號(hào)放大的效果；而酶催化反應(yīng)則將核酸擴(kuò)增的信號(hào)轉(zhuǎn)化為易于檢測的光學(xué)信號(hào)，提高了檢測的靈敏度和直觀性。相較于單一的信號(hào)放大策略，該組合策略能夠?qū)z測限降低至更低水平，在癌癥早期診斷等對(duì)靈敏度要求極高的領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。納米材料輔助與生物親和作用結(jié)合也是一種極具潛力的多重信號(hào)放大策略。以金納米顆粒（AuNPs）與生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合為例，AuNPs具有較大的比表面積，能夠負(fù)載大量的生物分子，如生物素標(biāo)記的核酸探針。每個(gè)AuNPs可以連接多個(gè)生物素標(biāo)記的核酸探針，增加了與目標(biāo)microRNA的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)樣本中的目標(biāo)microRNA與生物素標(biāo)記的核酸探針特異性雜交后，利用生物素與鏈霉親和素之間極高的親和力（結(jié)合常數(shù)高達(dá)101?-101?M?1），加入鏈霉親和素標(biāo)記的熒光基團(tuán)或酶。鏈霉親和素能夠同時(shí)結(jié)合多個(gè)生物素分子，從而使熒光基團(tuán)或酶在目標(biāo)microRNA周圍富集，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的顯著放大。在檢測miR-143時(shí)，基于AuNPs與生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合的電化學(xué)傳感器，能夠通過熒光信號(hào)或酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)，靈敏地檢測到低至皮摩爾級(jí)別的miR-143。這種組合策略充分發(fā)揮了納米材料的信號(hào)增強(qiáng)作用和生物親和作用的特異性識(shí)別能力，提高了檢測的靈敏度和選擇性，在復(fù)雜生物樣本的檢測中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。3.2.3實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件對(duì)基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測性能有著顯著影響，因此研究溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、試劑濃度等條件并進(jìn)行優(yōu)化十分必要。溫度對(duì)檢測性能的影響較為復(fù)雜。在酶催化信號(hào)放大過程中，溫度會(huì)顯著影響酶的活性。辣根過氧化物酶（HRP）的最適溫度一般在37℃左右。當(dāng)溫度低于最適溫度時(shí)，酶的活性中心與底物的結(jié)合能力減弱，催化反應(yīng)速率降低，導(dǎo)致檢測信號(hào)減弱。在檢測腫瘤標(biāo)志物相關(guān)的microRNA時(shí)，若反應(yīng)溫度為30℃，HRP催化底物TMB的反應(yīng)速率明顯下降，檢測信號(hào)強(qiáng)度降低約30%。當(dāng)溫度高于最適溫度時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致酶活性喪失。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，HRP的活性會(huì)大幅降低，甚至完全失活，無法有效催化底物反應(yīng)，檢測信號(hào)消失。在核酸擴(kuò)增信號(hào)放大過程中，不同的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)溫度的要求也不同。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）需要在高溫變性（95℃左右）、低溫退火（55-65℃）和適溫延伸（72℃左右）三個(gè)溫度條件下循環(huán)進(jìn)行。若退火溫度過高，引物與模板的結(jié)合效率降低，擴(kuò)增產(chǎn)物減少，檢測信號(hào)減弱；若退火溫度過低，引物可能會(huì)與非特異性序列結(jié)合，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在檢測miR-122時(shí)，當(dāng)退火溫度從60℃升高到65℃時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量減少了約50%，檢測信號(hào)明顯減弱。通過實(shí)驗(yàn)研究不同溫度下的檢測性能，確定最適溫度，能夠提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。pH值同樣會(huì)對(duì)檢測性能產(chǎn)生重要影響。在酶催化反應(yīng)中，pH值會(huì)改變酶的活性中心的電荷狀態(tài)，影響酶與底物的結(jié)合和催化效率。堿性磷酸酶（ALP）的最適pH值一般在8.5-10.5之間。當(dāng)pH值偏離最適范圍時(shí)，ALP的活性會(huì)受到抑制。在檢測microRNA時(shí)，若反應(yīng)體系的pH值為7.0，ALP催化底物對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP）的反應(yīng)速率明顯降低，檢測信號(hào)強(qiáng)度減弱約40%。在電化學(xué)檢測中，pH值還會(huì)影響電極表面的電荷分布和電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。在基于碳納米管修飾電極的microRNA電化學(xué)檢測中，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，電極表面的電荷分布發(fā)生改變，電活性物質(zhì)在電極表面的氧化還原反應(yīng)受到抑制，檢測信號(hào)減弱。通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使其處于最適范圍，能夠提高檢測性能。反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測結(jié)果也有顯著影響。在酶催化反應(yīng)中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，底物逐漸被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，檢測信號(hào)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過長時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)底物耗盡、酶活性降低等問題，導(dǎo)致檢測信號(hào)不再增加甚至減弱。在基于HRP催化的microRNA檢測中，反應(yīng)時(shí)間在30分鐘內(nèi)，檢測信號(hào)隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過60分鐘時(shí)，由于底物TMB的耗盡，檢測信號(hào)不再增加，甚至略有下降。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，反應(yīng)時(shí)間過短，擴(kuò)增產(chǎn)物不足，檢測信號(hào)較弱；反應(yīng)時(shí)間過長，可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物降解等問題。在LAMP擴(kuò)增miR-155時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到峰值，檢測信號(hào)最強(qiáng)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長至60分鐘時(shí)，出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，能夠獲得最佳的檢測信號(hào)。試劑濃度也是影響檢測性能的關(guān)鍵因素。在酶催化反應(yīng)中，酶和底物的濃度會(huì)影響反應(yīng)速率和檢測信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)酶濃度過低時(shí)，催化反應(yīng)速率慢，檢測信號(hào)弱；當(dāng)酶濃度過高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致底物過早耗盡，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在檢測microRNA時(shí)，HRP濃度為0.1U/mL時(shí)，催化反應(yīng)速率較慢，檢測信號(hào)較弱；當(dāng)HRP濃度增加到1U/mL時(shí)，檢測信號(hào)明顯增強(qiáng)，但繼續(xù)增加HRP濃度，底物TMB會(huì)在短時(shí)間內(nèi)耗盡，檢測信號(hào)不再增加。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，引物、dNTPs、DNA聚合酶等試劑的濃度也需要優(yōu)化。引物濃度過高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，引物濃度過低則會(huì)影響擴(kuò)增效率。在PCR擴(kuò)增miR-21時(shí)，當(dāng)引物濃度為0.2μM時(shí)，擴(kuò)增效率較高，檢測信號(hào)較強(qiáng)；當(dāng)引物濃度增加到0.5μM時(shí)，出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，影響了檢測結(jié)果。通過調(diào)整試劑濃度，能夠提高檢測的靈敏度和特異性。3.3檢測方法的原理與流程3.3.1目標(biāo)microRNA的捕獲目標(biāo)microRNA的捕獲是整個(gè)檢測流程的起始關(guān)鍵步驟，主要基于核酸雜交原理和生物親和作用原理實(shí)現(xiàn)。核酸雜交是利用核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的特性，將與目標(biāo)microRNA序列互補(bǔ)的核酸探針固定在電極表面，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)microRNA的特異性捕獲。在檢測miR-155時(shí)，設(shè)計(jì)一條與miR-155完全互補(bǔ)的DNA探針，其序列為5'-ACUACAUUUGCUCAAUUGGUGA-3'。通過自組裝的方式，將該DNA探針固定在金電極表面。當(dāng)含有miR-155的樣品溶液與修飾后的電極接觸時(shí)，miR-155會(huì)與固定在電極表面的DNA探針發(fā)生雜交反應(yīng)。堿基之間通過氫鍵相互配對(duì)，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雜交反應(yīng)具有高度的特異性，只有與探針序列互補(bǔ)的miR-155能夠與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-155的選擇性捕獲。為了增強(qiáng)雜交的穩(wěn)定性和特異性，通常會(huì)對(duì)探針進(jìn)行一些修飾，如在探針的5'-端或3'-端添加巰基（-SH）。巰基能夠與金電極表面的金原子形成強(qiáng)的Au-S鍵，使探針更牢固地固定在電極表面。還可以在探針中引入鎖核酸（LNA）。LNA是一種經(jīng)過修飾的核酸類似物，其核糖的2'-O和4'-C原子通過亞甲基橋連接，形成剛性的雙環(huán)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使LNA與互補(bǔ)核酸的雜交穩(wěn)定性顯著提高，能夠有效增強(qiáng)探針與目標(biāo)microRNA的結(jié)合能力，提高捕獲效率。生物親和作用也是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)microRNA捕獲的重要手段，其中生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛。生物素與鏈霉親和素之間具有極高的親和力，其結(jié)合常數(shù)高達(dá)101?-101?M?1。在捕獲目標(biāo)microRNA時(shí)，首先將生物素標(biāo)記在與目標(biāo)microRNA互補(bǔ)的核酸探針上。然后，將鏈霉親和素固定在電極表面。當(dāng)含有生物素標(biāo)記探針的溶液與修飾后的電極接觸時(shí)，生物素與鏈霉親和素特異性結(jié)合，從而將核酸探針固定在電極表面。加入含有目標(biāo)microRNA的樣品溶液，核酸探針與目標(biāo)microRNA發(fā)生雜交反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)microRNA的捕獲。在檢測miR-21時(shí)，將生物素標(biāo)記在與miR-21互補(bǔ)的DNA探針上，然后將鏈霉親和素通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)的方式固定在玻碳電極表面。當(dāng)生物素標(biāo)記的探針與鏈霉親和素結(jié)合后，再加入含有miR-21的樣品，miR-21與探針雜交，從而被捕獲在電極表面。這種基于生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的捕獲方法具有特異性強(qiáng)、結(jié)合穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效提高檢測的準(zhǔn)確性。3.3.2信號(hào)放大過程信號(hào)放大過程是基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法的核心環(huán)節(jié)，其通過多種信號(hào)放大策略協(xié)同作用，顯著增強(qiáng)檢測信號(hào)，提高檢測靈敏度。以酶催化與核酸擴(kuò)增結(jié)合的多重信號(hào)放大策略為例，其具體反應(yīng)步驟和信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制如下。在核酸擴(kuò)增階段，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)對(duì)捕獲到的目標(biāo)microRNA進(jìn)行擴(kuò)增。以檢測miR-122為例，針對(duì)miR-122的基因序列設(shè)計(jì)6條特異性引物，包括兩對(duì)內(nèi)部引物（FIP、BIP）和兩對(duì)外部引物（F3、B3）。將捕獲有miR-122的電極置于含有BstDNA聚合酶、dNTPs、引物等成分的反應(yīng)體系中。在恒溫條件下（60-65℃），F(xiàn)IP引物中的F1c序列首先與miR-122的互補(bǔ)序列結(jié)合，BstDNA聚合酶以其為引物開始合成DNA鏈。在合成過程中，BstDNA聚合酶具有鏈置換活性，能夠置換出下游的單鏈DNA。隨后，B3引物與被置換出的單鏈DNA結(jié)合，啟動(dòng)新一輪的DNA合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的DNA模板。該模板可在自身引發(fā)下進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，不斷延伸和分支，形成大量具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA產(chǎn)物。在1小時(shí)內(nèi)，LAMP反應(yīng)能夠?qū)iR-122的核酸序列擴(kuò)增10?-101?倍，使目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)大幅增加。在酶催化階段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交。HRP標(biāo)記的探針與擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物中的目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合在一起。加入HRP的底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和過氧化氫（H?O?）。在HRP的催化作用下，H?O?將TMB氧化。HRP中的血紅素輔基能夠與H?O?結(jié)合，形成活性中間體。該中間體將TMB分子中的氨基氧化，使TMB發(fā)生電子轉(zhuǎn)移和質(zhì)子化反應(yīng)，形成具有共軛結(jié)構(gòu)的醌式產(chǎn)物。醌式產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色。在酸性條件下，藍(lán)色產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。由于一個(gè)HRP分子在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)催化數(shù)百個(gè)TMB分子反應(yīng)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，大量的TMB被氧化，產(chǎn)生大量的有色產(chǎn)物，從而使檢測信號(hào)顯著增強(qiáng)。通過檢測有色產(chǎn)物在特定波長（如450nm）下的吸光度，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-122的高靈敏檢測。從信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制來看，核酸擴(kuò)增階段通過LAMP技術(shù)大量增加了目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)，為后續(xù)的酶催化反應(yīng)提供了充足的底物，增強(qiáng)了酶催化信號(hào)放大的基礎(chǔ)。而酶催化階段通過HRP對(duì)底物的高效催化，將核酸擴(kuò)增的信號(hào)轉(zhuǎn)化為易于檢測的光學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的進(jìn)一步放大。這種協(xié)同作用使得檢測信號(hào)得到了顯著增強(qiáng)，能夠檢測到極低濃度的目標(biāo)microRNA。3.3.3電化學(xué)信號(hào)檢測電化學(xué)信號(hào)檢測是基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法的最后關(guān)鍵步驟，通過電化學(xué)工作站實(shí)現(xiàn)對(duì)電流、電位、電容等信號(hào)的精確檢測，從而獲得目標(biāo)microRNA的濃度信息。電化學(xué)工作站的工作原理基于電化學(xué)的基本理論。在三電極體系中，工作電極是發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的場所，在檢測microRNA時(shí)，捕獲有目標(biāo)microRNA并經(jīng)過信號(hào)放大的電極即為工作電極。參比電極用于提供一個(gè)穩(wěn)定的電位基準(zhǔn)，常用的參比電極有飽和甘汞電極（SCE）、銀/氯化銀電極（Ag/AgCl）等。對(duì)電極則主要起到傳導(dǎo)電流的作用，使工作電極和參比電極之間形成完整的電路。當(dāng)在工作電極和參比電極之間施加一定的電位差時(shí)，工作電極表面會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)。在基于酶催化信號(hào)放大的檢測中，若酶催化底物產(chǎn)生的電活性產(chǎn)物在工作電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，會(huì)有電子從工作電極轉(zhuǎn)移到外電路，形成陽極電流；若發(fā)生還原反應(yīng)，則電子從外電路流入工作電極，形成陰極電流。通過電化學(xué)工作站可以精確測量這些電流的大小。電化學(xué)工作站檢測信號(hào)的方法有多種，其中循環(huán)伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）較為常用。CV法是在工作電極上施加一個(gè)線性變化的電位掃描信號(hào)，電位從初始電位開始，以一定的掃描速率向正電位或負(fù)電位方向掃描，到達(dá)終止電位后再反向掃描回到初始電位，形成一個(gè)等腰三角形的電位掃描曲線。在電位掃描過程中，測量工作電極上的電流響應(yīng)。當(dāng)電位掃描到電活性物質(zhì)的氧化還原電位時(shí)，會(huì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的氧化峰和還原峰。通過分析氧化峰和還原峰的電位、電流等參數(shù)，可以獲得電活性物質(zhì)的氧化還原特性和濃度信息。在檢測經(jīng)過信號(hào)放大后的microRNA時(shí)，若酶催化產(chǎn)物為電活性物質(zhì)，通過CV法可以檢測到其氧化還原峰，峰電流的大小與microRNA的濃度相關(guān)。DPV法是在一個(gè)直流電壓的基礎(chǔ)上，疊加一個(gè)小振幅的脈沖電壓。脈沖電壓的振幅通常在5-100mV之間，脈沖寬度在1-100ms之間。在每個(gè)脈沖的前期和后期分別測量電流，然后計(jì)算電流差值。由于脈沖電壓的作用，只有在電活性物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的瞬間才會(huì)產(chǎn)生明顯的電流變化，而其他背景電流和噪聲則被有效抑制，因此DPV法具有較高的靈敏度和分辨率。在檢測microRNA時(shí)，DPV法能夠更準(zhǔn)確地檢測到微弱的電流信號(hào)，提高檢測的靈敏度。通過檢測電流信號(hào)的大小，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以定量分析目標(biāo)microRNA的濃度。在檢測miR-21時(shí)，通過DPV法測量不同濃度miR-21對(duì)應(yīng)的電流信號(hào)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，對(duì)未知樣品中的miR-21進(jìn)行檢測，根據(jù)測量得到的電流信號(hào)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miR-21的定量分析。四、方法性能評(píng)估與對(duì)比分析4.1靈敏度與檢測限4.1.1靈敏度評(píng)估方法靈敏度是衡量基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法性能的關(guān)鍵指標(biāo)之一，它反映了檢測方法對(duì)低濃度目標(biāo)microRNA的響應(yīng)能力。在本研究中，主要通過標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和檢測信號(hào)變化兩種方法來評(píng)估靈敏度。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率是評(píng)估靈敏度的常用方法之一。以不同濃度的目標(biāo)microRNA標(biāo)準(zhǔn)品為檢測對(duì)象，按照構(gòu)建的電化學(xué)檢測方法進(jìn)行檢測，記錄對(duì)應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度。以目標(biāo)microRNA的濃度為橫坐標(biāo)，電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率越大，表明檢測方法對(duì)目標(biāo)microRNA濃度變化的響應(yīng)越靈敏，即靈敏度越高。在檢測miR-143時(shí)，制備一系列濃度梯度的miR-143標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍為10?12-10??mol/L。利用基于酶催化與核酸擴(kuò)增結(jié)合的多重信號(hào)放大電化學(xué)檢測方法進(jìn)行檢測，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為0.52，這意味著miR-143濃度每增加一個(gè)單位，電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度將增加0.52個(gè)單位。通過比較不同檢測方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，可以直觀地評(píng)估它們的靈敏度差異。若另一種檢測方法對(duì)miR-143檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為0.35，則說明本研究的檢測方法靈敏度更高。檢測信號(hào)變化也是評(píng)估靈敏度的重要依據(jù)。當(dāng)目標(biāo)microRNA濃度發(fā)生微小變化時(shí)，檢測信號(hào)應(yīng)能產(chǎn)生明顯的變化，這種變化越顯著，檢測方法的靈敏度越高。在基于納米材料輔助與生物親和作用結(jié)合的多重信號(hào)放大電化學(xué)檢測中，利用金納米顆粒與生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)檢測miR-21。當(dāng)miR-21濃度從10?1?mol/L增加到10??mol/L時(shí)，檢測信號(hào)（如電流信號(hào)）從0.5μA增加到2.0μA，信號(hào)變化幅度較大，表明該檢測方法對(duì)miR-21濃度的微小變化具有較高的響應(yīng)能力，靈敏度較好。通過對(duì)不同濃度目標(biāo)microRNA檢測信號(hào)變化的分析，可以深入了解檢測方法的靈敏度特性。若在低濃度范圍內(nèi)，檢測信號(hào)隨目標(biāo)microRNA濃度變化的趨勢不明顯，說明檢測方法在低濃度檢測時(shí)靈敏度較低；若在高濃度范圍內(nèi)，檢測信號(hào)逐漸趨于飽和，對(duì)濃度變化的響應(yīng)減弱，也會(huì)影響檢測方法的靈敏度。4.1.2檢測限的確定檢測限是指能夠被可靠地檢測到的目標(biāo)物質(zhì)的最低濃度，對(duì)于基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法而言，確定檢測限具有重要的實(shí)際意義。在本研究中，主要根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和信噪比來確定檢測限。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定檢測限，通常采用空白樣品多次測量的方法。對(duì)空白樣品（即不含目標(biāo)microRNA的樣品）進(jìn)行至少10次平行檢測，記錄每次檢測得到的電化學(xué)信號(hào)值。計(jì)算這些信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。檢測限（LOD）可通過公式LOD=3SD/k來計(jì)算，其中k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。在檢測miR-155時(shí)，對(duì)空白樣品進(jìn)行15次檢測，得到電化學(xué)信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05μA。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到斜率為0.45，則根據(jù)公式計(jì)算得到檢測限為3×0.05÷0.45=0.33fmol/L。這種基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的檢測限，能夠反映檢測方法在實(shí)際應(yīng)用中的噪聲水平和檢測能力，具有較高的可靠性。信噪比法也是確定檢測限的常用方法。在電化學(xué)檢測中，信噪比（S/N）是指檢測信號(hào)強(qiáng)度（S）與背景噪聲強(qiáng)度（N）的比值。當(dāng)S/N達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，對(duì)應(yīng)的目標(biāo)microRNA濃度即為檢測限。通常認(rèn)為S/N=3時(shí)的濃度為檢測限。在基于核酸擴(kuò)增信號(hào)放大的電化學(xué)檢測中，測量背景噪聲強(qiáng)度為0.1μA。逐漸降低目標(biāo)miR-21的濃度進(jìn)行檢測，當(dāng)檢測信號(hào)強(qiáng)度為0.3μA時(shí)，S/N=0.3÷0.1=3，此時(shí)對(duì)應(yīng)的miR-21濃度為1.2fmol/L，即確定該檢測方法對(duì)miR-21的檢測限為1.2fmol/L。通過信噪比法確定檢測限，能夠直觀地反映檢測信號(hào)與背景噪聲的關(guān)系，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。確定檢測限可以幫助評(píng)估檢測方法的適用范圍和檢測能力，為實(shí)際應(yīng)用提供重要參考。在臨床診斷中，了解檢測方法的檢測限，能夠判斷其是否能夠檢測到疾病早期患者樣本中低濃度的microRNA，從而為疾病的早期診斷提供有力支持。4.2選擇性與特異性4.2.1選擇性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了全面評(píng)估基于多重信號(hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法的選擇性，精心設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，通過檢測不同干擾物和同源microRNA，深入探究該方法對(duì)目標(biāo)microRNA的特異性識(shí)別能力。在干擾物檢測實(shí)驗(yàn)中，選取了常見的生物分子和離子作為干擾物，包括蛋白質(zhì)（如牛血清白蛋白BSA）、葡萄糖、氯化鈉（NaCl）、磷酸氫二鈉（Na?HPO?）等。將這些干擾物分別以不同濃度加入到含有目標(biāo)microRNA的樣品溶液中。在檢測miR-143時(shí)，將BSA以1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的濃度分別加入到含有一定濃度miR-143的溶液中。按照既定的電化學(xué)檢測方法進(jìn)行檢測，記錄電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度。通過與不含干擾物的樣品檢測信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，分析干擾物對(duì)檢測信號(hào)的影響。若加入干擾物后，檢測信號(hào)與無干擾物時(shí)相比，變化在5%以內(nèi)，可認(rèn)為該干擾物對(duì)檢測結(jié)果無顯著影響，表明檢測方法具有較好的抗干擾能力。對(duì)于同源microRNA的檢測，選取與目標(biāo)microRNA序列相似的家族成員。在檢測miR-21時(shí)，選取miR-21家族中序列相似度較高的miR-21*。將miR-21和miR-21分別以相同濃度（如10??mol/L）進(jìn)行單獨(dú)檢測，記錄各自的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度。再將兩者以等濃度混合后進(jìn)行檢測，觀察檢測信號(hào)是否與單獨(dú)檢測時(shí)的信號(hào)具有明顯差異。若混合檢測時(shí)，檢測信號(hào)主要反映目標(biāo)miR-21的信號(hào)，而不受miR-21的顯著干擾，說明檢測方法對(duì)miR-21具有較高的選擇性，能夠有效區(qū)分同源microRNA。通過這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以準(zhǔn)確評(píng)估檢測方法在復(fù)雜生物樣本中對(duì)目標(biāo)microRNA的選擇性，為其實(shí)際應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2.2特異性驗(yàn)證為了確?；诙嘀匦盘?hào)放大技術(shù)的microRNA電化學(xué)檢測方法能夠準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)microRNA，采用了多種方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證，包括利用特異性探針和核酸酶處理等，其原理和具體操作如下。利用特異性探針驗(yàn)證特異性是基于核酸雜交的高度特異性。設(shè)計(jì)與目標(biāo)microRNA完全互補(bǔ)的探針，其堿基序列與目標(biāo)microRNA嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)。在檢測miR-155時(shí)，設(shè)計(jì)的特異性探針序列為5'-ACUACAUUUGCUCAAUUGGUGA-3'，該序列與miR-155的堿基序列完全互補(bǔ)。將該探針固定在電極表面，通過自組裝等方式使其牢固結(jié)合在電極上。當(dāng)含有目標(biāo)miR-155的樣品溶液與修飾后的電極接觸時(shí)，miR-155與探針發(fā)生雜交反應(yīng)。堿基之間通過氫鍵相互配對(duì)，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證這種結(jié)合的特異性，設(shè)置對(duì)照組，將與目標(biāo)miR-155序列差異較大的非特異性RNA加入到樣品溶液中。若檢測信號(hào)主要來源于目標(biāo)miR-155與特異性探針的雜交，而不受非特異性RNA的影響，說明探針能夠特異性地識(shí)別目標(biāo)miR-155，檢測方法具有較高的特異性。核酸酶處理也是驗(yàn)證特異性的有效方法。核酸酶能夠特異性地切割核酸分子，不同的核酸酶具有不同的切割位點(diǎn)和底物特異性。在本研究中，選用核糖核酸酶H（RNaseH）進(jìn)行特異性驗(yàn)證。RNaseH能夠特異性地切割DNA