生物制藥生產(chǎn)工藝流程考核試卷及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分）1.以下哪種方法是生物制藥中常用的菌種保藏方法，可長期保持菌種活性且變異率低？A.斜面低溫保藏法（4℃）B.甘油冷凍保藏法（20℃）C.液氮超低溫保藏法（196℃）D.沙土管保藏法2.發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的“消泡劑”主要作用是：A.調(diào)節(jié)pH值B.抑制雜菌生長C.降低泡沫表面張力，防止溢出D.提供碳源3.高壓蒸汽滅菌的標(biāo)準(zhǔn)條件是：A.100℃，30分鐘B.115℃，15分鐘C.121℃，1520分鐘D.135℃，5分鐘4.以下哪種分離技術(shù)基于分子大小差異實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物純化？A.離子交換色譜B.凝膠過濾色譜（分子篩）C.親和色譜D.疏水相互作用色譜5.單克隆抗體制備過程中，雜交瘤細(xì)胞的篩選通常使用：A.HAT培養(yǎng)基B.高糖培養(yǎng)基C.LB培養(yǎng)基D.麥康凱培養(yǎng)基6.病毒類疫苗生產(chǎn)中，“滅活”步驟的核心目的是：A.提高病毒感染力B.破壞病毒核酸或蛋白質(zhì)，消除致病性但保留抗原性C.增加病毒數(shù)量D.促進(jìn)病毒變異7.生物反應(yīng)器中“溶氧（DO）”的控制通常通過調(diào)節(jié)以下哪項(xiàng)參數(shù)實(shí)現(xiàn)？A.攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量B.培養(yǎng)基pHC.接種量D.發(fā)酵溫度8.基因工程藥物生產(chǎn)中，“包涵體”的形成主要是由于：A.目標(biāo)蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中過度表達(dá)導(dǎo)致折疊錯誤B.培養(yǎng)基營養(yǎng)不足C.發(fā)酵溫度過高D.雜菌污染9.以下哪種制劑工藝屬于“無菌制劑”范疇？A.片劑壓片B.凍干粉針劑分裝C.顆粒劑干燥D.膠囊填充10.生物制品質(zhì)量控制中，“內(nèi)毒素檢測”常用的方法是：A.兔熱原試驗(yàn)B.鱟試劑法（LAL法）C.無菌檢查法D.效價(jià)測定法二、填空題（每空1分，共20分）1.生物制藥上游工藝的核心環(huán)節(jié)包括菌種選育與保藏、培養(yǎng)基制備、__________和發(fā)酵過程控制。2.發(fā)酵罐的關(guān)鍵參數(shù)監(jiān)測通常包括溫度、pH、溶氧（DO）、__________（至少2項(xiàng)）。3.離心分離技術(shù)中，“差速離心”主要用于分離__________不同的顆粒，而“密度梯度離心”則基于__________差異實(shí)現(xiàn)分離。4.單克隆抗體制備的“細(xì)胞融合”步驟中，常用的促融劑是__________（化學(xué)法）或__________（物理法）。5.病毒類疫苗生產(chǎn)中，“收獲”病毒的方式取決于病毒的增殖特性：若病毒以出芽方式釋放，需收集__________；若病毒裂解宿主細(xì)胞釋放，需收集__________。6.基因工程藥物的下游純化工藝通常包括粗純（如離心、過濾）、中間純化（如__________）和精純化（如__________）三個階段。7.無菌制劑生產(chǎn)中，“A級潔凈區(qū)”要求空氣潔凈度達(dá)到ISO__________級標(biāo)準(zhǔn)，需采用__________（如層流罩）維持環(huán)境。8.生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)包括加速穩(wěn)定性試驗(yàn)（通常條件為__________）和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)（通常條件為__________）。9.發(fā)酵染菌的常見原因包括培養(yǎng)基滅菌不徹底、__________（至少2項(xiàng)）。三、簡答題（每題8分，共40分）1.簡述生物制藥中“種子擴(kuò)大培養(yǎng)”的目的及關(guān)鍵控制要點(diǎn)。2.比較“分批發(fā)酵”“補(bǔ)料分批發(fā)酵”和“連續(xù)發(fā)酵”的優(yōu)缺點(diǎn)，并說明各自適用場景。3.以重組人胰島素生產(chǎn)為例，簡述從工程菌發(fā)酵到最終制劑成型的主要工藝流程。4.列舉三種常用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)（需說明原理），并分析其在不同純化階段的應(yīng)用。5.闡述生物制藥生產(chǎn)中“無菌保證”的核心策略（至少包括設(shè)備、工藝、環(huán)境三方面）。四、綜合分析題（20分）某生物制藥企業(yè)生產(chǎn)重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhGCSF），發(fā)酵過程中出現(xiàn)以下異?，F(xiàn)象：發(fā)酵24小時(shí)后，溶氧（DO）從40%驟降至10%，且持續(xù)無法回升；發(fā)酵液pH從7.0快速上升至8.5；菌體密度（OD600）僅為正常批次的50%。請結(jié)合生物制藥生產(chǎn)知識，分析可能的原因（至少4項(xiàng)），并提出對應(yīng)的解決措施。答案一、單項(xiàng)選擇題1.C（液氮超低溫保藏法可長期保藏，變異率低）2.C（消泡劑降低泡沫表面張力）3.C（標(biāo)準(zhǔn)條件為121℃，1520分鐘）4.B（凝膠過濾基于分子大?。?.A（HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞）6.B（滅活保留抗原性，消除致病性）7.A（攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量調(diào)節(jié)溶氧）8.A（原核表達(dá)系統(tǒng)中蛋白折疊錯誤形成包涵體）9.B（凍干粉針劑需無菌分裝）10.B（鱟試劑法檢測內(nèi)毒素）二、填空題1.種子擴(kuò)大培養(yǎng)2.攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、尾氣CO?濃度（任意2項(xiàng)）3.沉降速度；密度4.PEG（聚乙二醇）；電融合5.細(xì)胞培養(yǎng)液；細(xì)胞裂解液6.離子交換色譜；親和色譜（或反相色譜）7.5；單向流裝置8.40℃±2℃，相對濕度75%±5%；25℃±2℃，相對濕度60%±10%9.接種操作污染、設(shè)備泄漏、空氣過濾失效（任意2項(xiàng)）三、簡答題1.目的：為發(fā)酵罐提供數(shù)量充足、生理狀態(tài)一致的高活性種子，縮短發(fā)酵延遲期，提高生產(chǎn)效率。關(guān)鍵控制要點(diǎn)：①培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基匹配，確保菌體快速增殖；②控制培養(yǎng)溫度、pH、溶氧等參數(shù)（如好氧菌需維持DO≥30%）；③嚴(yán)格監(jiān)控種齡（對數(shù)生長期中期最佳）；④無菌操作，避免雜菌污染；⑤定期檢測種子活力（如鏡檢、生長曲線分析）。2.分批發(fā)酵：一次性投料和收獲，操作簡單但生產(chǎn)效率低，適用于產(chǎn)物在穩(wěn)定期積累的品種（如抗生素）。補(bǔ)料分批發(fā)酵：間歇補(bǔ)加營養(yǎng)，延長對數(shù)期，提高產(chǎn)量，適用于需控制碳源濃度（如避免葡萄糖效應(yīng)）或產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)的場景（如重組蛋白）。連續(xù)發(fā)酵：連續(xù)進(jìn)料和出料，生產(chǎn)效率高但染菌風(fēng)險(xiǎn)大、產(chǎn)物濃度低，適用于代謝產(chǎn)物穩(wěn)定、需長期運(yùn)行的工藝（如乙醇發(fā)酵）。3.工藝流程：①工程菌活化：從甘油管中復(fù)蘇重組大腸桿菌，接種至搖瓶種子培養(yǎng)基（LB+抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；②種子擴(kuò)大培養(yǎng)：將搖瓶種子接種至一級種子罐（50L），培養(yǎng)至OD600=58，再轉(zhuǎn)種至二級種子罐（500L），擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1015；③發(fā)酵培養(yǎng)：接種至生產(chǎn)罐（5000L），采用補(bǔ)料分批模式，控制溫度37℃、pH7.0、DO≥30%，誘導(dǎo)期（OD600=50時(shí)）加入IPTG誘導(dǎo)重組胰島素原表達(dá)；④菌體收集：發(fā)酵結(jié)束后離心（8000rpm，20分鐘）收集菌體，高壓勻漿破碎（1000bar，3次）釋放包涵體；⑤包涵體純化：洗滌（含TritonX100的緩沖液）去除雜蛋白，溶解（8M尿素+還原劑）后稀釋復(fù)性（氧化還原緩沖液），形成正確二硫鍵；⑥酶切與純化：用胰蛋白酶切割胰島素原，獲得胰島素A鏈和B鏈，通過離子交換色譜（QSepharose）和反相色譜（C18柱）去除雜質(zhì)；⑦制劑成型：純化后胰島素經(jīng)0.22μm濾膜無菌過濾，加入鋅離子（形成六聚體）和防腐劑（如苯酚），分裝至西林瓶，凍干或液體灌裝，軋蓋后燈檢、貼標(biāo)。4.三種技術(shù)及應(yīng)用：①離子交換色譜（IEC）：基于蛋白質(zhì)表面電荷差異，通過陰陽離子交換樹脂吸附目標(biāo)蛋白。常用于中間純化階段（去除帶相反電荷的雜蛋白）。②親和色譜（AC）：利用目標(biāo)蛋白與配基（如抗體、金屬離子）的特異性結(jié)合，如HisTag蛋白用NiNTA樹脂。適用于精純化階段（純度可達(dá)95%以上）。③疏水相互作用色譜（HIC）：基于蛋白質(zhì)表面疏水性差異，高鹽條件下吸附，低鹽洗脫。常用于粗純后去除部分雜蛋白（如宿主蛋白）。5.無菌保證策略：①設(shè)備：采用蒸汽滅菌（SIP）或干熱滅菌（如灌裝機(jī)），關(guān)鍵設(shè)備（如發(fā)酵罐、配液罐）需驗(yàn)證滅菌效果（生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)）；②工藝：無菌制劑采用“最終滅菌”（如濕熱滅菌）或“無菌生產(chǎn)工藝”（如凍干制劑的無菌分裝），關(guān)鍵步驟（如過濾、灌裝）在A級潔凈區(qū)完成；③環(huán)境：生產(chǎn)區(qū)劃分潔凈級別（B級背景+A級操作區(qū)），定期監(jiān)測浮游菌、沉降菌、表面微生物（如每4小時(shí)檢測一次）；人員需穿無菌服（連體衣、手套、口罩），限制進(jìn)出次數(shù)；④物料：原輔料、包裝材料（如西林瓶）需經(jīng)滅菌（如干熱滅菌180℃×2小時(shí)）或除菌過濾（0.22μm濾膜），進(jìn)入潔凈區(qū)前需消毒（如75%乙醇擦拭）。四、綜合分析題可能原因及解決措施：1.染菌污染：雜菌大量繁殖消耗氧氣（DO下降），代謝產(chǎn)堿（pH上升），抑制工程菌生長（OD600低）。解決：立即停止發(fā)酵，取樣鏡檢（革蘭氏染色）或PCR檢測雜菌種類；清理發(fā)酵罐，用NaOH溶液浸泡滅菌；排查污染來源（如空氣過濾器失效、接種口泄漏）。2.培養(yǎng)基成分異常：碳源不足（如葡萄糖耗盡）導(dǎo)致工程菌代謝轉(zhuǎn)向分解蛋白質(zhì)（產(chǎn)氨，pH上升），同時(shí)呼吸強(qiáng)度下降（DO驟降）。解決：檢測發(fā)酵液殘?zhí)牵ㄈ鏒NS法），若殘?zhí)牵?.5g/L，補(bǔ)加葡萄糖溶液（需滅菌后補(bǔ)料）；優(yōu)化培養(yǎng)基配方（如提高初始葡萄糖濃度或調(diào)整補(bǔ)料速率）。3.溶氧控制失效：攪拌電機(jī)故障（轉(zhuǎn)速下降）或通氣量不足（空氣壓縮機(jī)停機(jī)），導(dǎo)致供氧不足，工程菌缺氧死亡（OD600低），同時(shí)死菌自溶釋放堿性物質(zhì)（pH上升）。解決：檢查攪拌電機(jī)電流、轉(zhuǎn)速傳感器；確認(rèn)空氣流量計(jì)讀數(shù)，重啟壓縮機(jī)或切換備用氣源；后續(xù)定期維護(hù)設(shè)備（如攪拌軸密封、空氣過濾器更換）。4.工程菌退化：長期傳代導(dǎo)致菌種代謝能力下降（如呼吸鏈酶活性降低），無法有效利用碳源（DO下降），同時(shí)代謝副產(chǎn)物（如氨）積累（pH上升）