ICS67.050B23DB12天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布IDB12/T652—2016本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、李亮、趙新、劉雪巖、宛煜嵩、王成、陳銳、朱珠、劉娜、徐石勇。本標(biāo)準(zhǔn)2016年9月首次發(fā)布。DB12/T652—2016轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4及其衍生品種定性檢測實時熒光PCR法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性的定性PCR檢測方法的術(shù)語和定義、檢測方法、結(jié)果分析與表述。本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4及其衍生品種，以及制品中DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分的定性PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法農(nóng)業(yè)部1485號公告—4—2010轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測DNA提取和純化農(nóng)業(yè)部2031號公告—8—2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR法農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求3術(shù)語和定義農(nóng)業(yè)部2031號公告—8—2013界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1Lectin基因Lectingene編碼大豆凝集素的基因。3.2DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列event-specificsequenceofDAS-68416-4DAS-68416-4外源插入片段5′端與大豆基因組的連接區(qū)序列。4原理根據(jù)轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)計特異性引物，對試樣DNA進行PCR擴增。依據(jù)是否擴增獲得典型的實時熒光擴增曲線，判斷樣品中是否含有DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分。5檢測方法5.1試劑和材料除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒。5.1.2引物和探針。DB12/T652—20165.1.2.1Lectin基因。lec-1215F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′lec-1332R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′lec-1269P：5′-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3′預(yù)期擴增片段大小為118bp（參見附錄A）。5.1.2.2DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列。DAS-68416-4-F：5'-GGGCCTAACTTTTGGTGTGATG-3'DAS-68416-4-R：5'-TACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATT-3'DAS-68416-4-P：5'-HEX-TTCAAGCACCAGTCAGCAT-MGB-3'需避光保存。5.2儀器分析天平感量0.1g和0.1mg熒光定量PCR擴增儀；核酸定量儀；重蒸餾水發(fā)生器或純水儀；其他相關(guān)儀器設(shè)備。5.3分析步驟5.3.1抽樣按NY/T672和農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013規(guī)定執(zhí)行。5.3.2試樣準(zhǔn)備按NY/T672和農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013規(guī)定執(zhí)行。5.3.3試樣預(yù)處理按農(nóng)業(yè)部1485號公告—4—2010規(guī)定執(zhí)行。5.3.4DNA模板制備按農(nóng)業(yè)部1485號公告—4—2010規(guī)定執(zhí)行。5.3.5PCR反應(yīng)5.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣實時熒光PCR反應(yīng)同時進行標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣的PCR反應(yīng)，每個PCR反應(yīng)設(shè)置3次平行。DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體實時熒光PCR反應(yīng)按表1在PCR反應(yīng)管中依次加入反應(yīng)試劑，混勻；Lectin內(nèi)標(biāo)基因?qū)崟r熒光PCR反應(yīng)按表2在PCR反應(yīng)管中依次加入反應(yīng)試劑，混勻。將PCR管放在離心機上，500g~3000g離心10s，然后取出PCR管，放入PCR儀中。運行實時熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：94℃變性5min；進行45次循環(huán)擴增反應(yīng)（94℃變性15s，60℃退火延伸1minDB12/T652—20163表1DAS-68416-4PCR反應(yīng)體系 10μmol/LDAS-68416-4-F10μmol/LDAS-68416-4-R10μmol/LDAS-68416-4-P 表2Lectin內(nèi)標(biāo)基因PCR反應(yīng)體系 —5.3.5.2設(shè)置對照在試樣PCR反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照。以非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA作為陰性對照；以耐除草劑大豆DAS-68416-4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%~1.0%的基因組DNA（或采用大豆DAS-68416-4與非轉(zhuǎn)基因大豆基因組相比的拷貝數(shù)分?jǐn)?shù)為0.1%~1.0%的DNA溶液）作為陽性對照；以水作為空白對照。各對照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，其余組分及PCR反應(yīng)條件與5.3.5.1相同。6結(jié)果分析與表述6.1Lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因無典型擴增曲線，表明樣品中未檢出大豆成分，結(jié)果表述為“樣品中未檢測出大豆成分，檢測結(jié)果為陰性”。6.2Lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值≤38；同時DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值≤38，表明樣品中檢測出DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分，結(jié)果表述為“樣品中檢測出轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分，檢測結(jié)果為陽性”。DB12/T652—201646.3Lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值≤38；但DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列未出現(xiàn)典型擴增曲線，表明樣品中未檢測出DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分，結(jié)果表述為“樣品中未檢測出轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體成分，檢測結(jié)果為陰性”。6.4Lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和/或DAS-68416-4轉(zhuǎn)化體特異性序列出現(xiàn)典型擴增曲線，但Ct值在38～40之間，進行重復(fù)實驗。如重復(fù)實驗結(jié)果符合6.1～6.3的情形，依照6.1～6.3進行判斷。如重復(fù)實驗檢測參數(shù)出現(xiàn)典型擴增曲線，但檢測Ct值仍在38～40之間，則判定樣品檢出Lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和/或轉(zhuǎn)化體特異性序列，根據(jù)檢出參數(shù)情況，參照6.1～6.3對樣品進行判定。DB12/T652—2016（資料性附錄）A.1Lectin基因?qū)崟r熒光PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列（AccessionNo.K00821）61GCCGCTTCCTTCAACTTCAClCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGC61GCCGCTTCCTTCAACTTCAClCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCA.2耐除草劑大