基于局部LPS注射法構(gòu)建牙周炎動(dòng)物模型及其對(duì)牙髓與修復(fù)性牙本質(zhì)影響的深度探究一、引言1.1研究背景牙周炎是一種常見(jiàn)的口腔疾病，主要影響牙齒周圍的支持組織，包括牙齦、牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)。它以牙菌斑為始動(dòng)因子，在局部因素（如口腔衛(wèi)生不良、牙合創(chuàng)傷）及全身因素（如內(nèi)分泌障礙、免疫狀態(tài)、遺傳因素）的共同作用下，引發(fā)炎癥反應(yīng)。隨著病情的發(fā)展，會(huì)導(dǎo)致牙齦紅腫、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收，嚴(yán)重時(shí)可致使牙齒松動(dòng)、脫落，極大地影響患者的口腔健康和生活質(zhì)量。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，牙周炎在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率居高不下。在我國(guó)，牙周炎的患病率約為70%-85%，35歲以后的成人人群中，患病率更是急劇上升。這不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，還會(huì)對(duì)其心理健康和社交生活產(chǎn)生負(fù)面影響。同時(shí)，牙周炎還與一些全身性疾病，如心血管疾病、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病等存在密切關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步加重了患者的健康負(fù)擔(dān)。深入研究牙周炎的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的防治手段，對(duì)于維護(hù)口腔健康、提高生活質(zhì)量具有重要意義。然而，由于牙周炎的發(fā)病過(guò)程涉及復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制，且受到多種因素的交互影響，僅依靠臨床觀察和研究難以全面深入地揭示其本質(zhì)。因此，建立合適的牙周炎動(dòng)物模型成為研究牙周炎的重要手段之一。通過(guò)動(dòng)物模型，研究者可以在可控的實(shí)驗(yàn)條件下，模擬人類牙周炎的發(fā)病過(guò)程，深入探討其病因、病理機(jī)制，評(píng)估各種治療方法和藥物的效果，為臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在眾多建立牙周炎動(dòng)物模型的方法中，局部脂多糖（LPS）注射法因其操作相對(duì)簡(jiǎn)便、能夠在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)出典型的牙周炎病變等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛關(guān)注。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，具有較強(qiáng)的生物活性，能夠刺激宿主的免疫反應(yīng)，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。通過(guò)局部注射LPS，可以直接在動(dòng)物牙周組織中引入炎癥刺激，從而建立牙周炎動(dòng)物模型。此外，牙髓和修復(fù)性牙本質(zhì)與牙周組織緊密相連，牙周炎時(shí)產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)和細(xì)菌毒素可能會(huì)通過(guò)根尖孔、側(cè)支根管等途徑影響牙髓組織，導(dǎo)致牙髓細(xì)胞的損傷和修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。研究牙周炎動(dòng)物模型中LPS對(duì)牙髓及修復(fù)性牙本質(zhì)的影響，有助于深入了解牙周炎的病理過(guò)程，為牙周-牙髓聯(lián)合病變的防治提供理論支持。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)局部LPS注射法建立牙周炎動(dòng)物模型，深入探究LPS在牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)觀察該模型形成后牙髓狀態(tài)及修復(fù)性牙本質(zhì)的狀況，明確牙周炎時(shí)LPS對(duì)牙髓細(xì)胞及修復(fù)性牙本質(zhì)的影響，為口腔醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，牙周炎是導(dǎo)致牙齒喪失的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。局部LPS注射法作為一種常用的建立牙周炎動(dòng)物模型的方法，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)該方法建立的模型，能夠在較短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出牙周炎的典型病理變化，有助于研究人員深入探討牙周炎的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，由于牙周組織與牙髓組織緊密相連，牙周炎的炎癥反應(yīng)可能會(huì)波及牙髓，影響牙髓細(xì)胞的功能和修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。研究LPS對(duì)牙髓及修復(fù)性牙本質(zhì)的影響，對(duì)于揭示牙周-牙髓聯(lián)合病變的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。此外，本研究的成果還將為牙周炎及牙周-牙髓聯(lián)合病變的臨床治療提供理論指導(dǎo)。目前，臨床上對(duì)于牙周炎和牙周-牙髓聯(lián)合病變的治療主要基于經(jīng)驗(yàn)和傳統(tǒng)理論，缺乏深入的發(fā)病機(jī)制研究支持。通過(guò)本研究，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和治療策略，為開(kāi)發(fā)更加有效的治療方法提供理論依據(jù)，從而提高牙周炎和牙周-牙髓聯(lián)合病變的治療效果，改善患者的口腔健康和生活質(zhì)量。本研究還將豐富口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考和借鑒。在口腔醫(yī)學(xué)的發(fā)展過(guò)程中，基礎(chǔ)研究是推動(dòng)臨床治療進(jìn)步的重要?jiǎng)恿ΑＭㄟ^(guò)對(duì)局部LPS注射法建立牙周炎動(dòng)物模型及其對(duì)牙髓、修復(fù)性牙本質(zhì)影響的研究，能夠?yàn)榭谇会t(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方法，促進(jìn)口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的學(xué)術(shù)交流和發(fā)展。二、牙周炎動(dòng)物模型構(gòu)建相關(guān)理論2.1牙周炎概述2.1.1牙周炎的定義與病理特征牙周炎是一種侵犯牙齦和牙周組織的慢性炎癥，是一種具有破壞性的口腔疾病。其主要病理特征表現(xiàn)為牙周袋形成、袋壁炎癥、牙槽骨吸收和牙齒松動(dòng)。在疾病初期，主要表現(xiàn)為牙齦的慢性炎癥，牙齦呈現(xiàn)紅腫狀態(tài)，質(zhì)地松軟，刷牙或進(jìn)食時(shí)容易出血，口內(nèi)可能出現(xiàn)異味。隨著病情的進(jìn)展，炎癥逐漸向深部組織蔓延，導(dǎo)致牙周袋的形成。牙周袋是指牙齦與牙齒之間原本緊密貼合的結(jié)合上皮向根方增殖，形成的病理性加深的齦溝。此時(shí)，牙周袋內(nèi)會(huì)積聚大量的菌斑、牙石和炎性滲出物，為細(xì)菌的滋生提供了良好的環(huán)境。牙槽骨吸收是牙周炎的另一個(gè)重要病理特征。在炎癥的刺激下，牙槽骨中的破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，導(dǎo)致牙槽骨逐漸被吸收，高度降低。牙槽骨的吸收使得牙齒失去了足夠的支持，從而逐漸出現(xiàn)松動(dòng)、移位等現(xiàn)象。嚴(yán)重時(shí)，牙齒甚至?xí)孕忻撀?。此外，牙周炎還可能伴有牙齒移位、食物嵌塞、繼發(fā)性咬合創(chuàng)傷、牙根暴露、對(duì)溫度敏感、急性牙周膿腫、牙髓炎、口臭等多種臨床表現(xiàn)。這些癥狀不僅會(huì)影響患者的口腔咀嚼功能，還會(huì)對(duì)其身心健康造成負(fù)面影響。2.1.2牙周炎的發(fā)病機(jī)制牙周炎的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。目前普遍認(rèn)為，菌斑微生物及其產(chǎn)物在局部的堆積和浸潤(rùn)是牙周炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵始動(dòng)因子。口腔中的細(xì)菌種類繁多，其中一些特定的細(xì)菌，如牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌等，與牙周炎的發(fā)生密切相關(guān)。這些細(xì)菌能夠在牙齒表面和牙周組織上定植，形成生物膜，即牙菌斑。牙菌斑中的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生多種毒性物質(zhì)，如內(nèi)毒素、蛋白酶、脂多糖等，這些物質(zhì)能夠直接損傷牙周組織，引發(fā)炎癥反應(yīng)。當(dāng)菌斑微生物及其產(chǎn)物侵入牙周組織后，會(huì)激活宿主的免疫防御系統(tǒng)。宿主的免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等，會(huì)被募集到炎癥部位。中性粒細(xì)胞是最早到達(dá)炎癥部位的免疫細(xì)胞，它們能夠吞噬和殺滅細(xì)菌，但在這個(gè)過(guò)程中也會(huì)釋放一些酶和細(xì)胞因子，如彈性蛋白酶、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些物質(zhì)在一定程度上會(huì)導(dǎo)致牙周組織的損傷。巨噬細(xì)胞在吞噬細(xì)菌的同時(shí)，還能夠作為抗原呈遞細(xì)胞，將細(xì)菌抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活細(xì)胞免疫反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程。B淋巴細(xì)胞則會(huì)產(chǎn)生抗體，參與體液免疫反應(yīng)。然而，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，宿主的免疫反應(yīng)往往過(guò)度激活，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量釋放，造成牙周組織的繼發(fā)性損傷。炎癥介質(zhì)在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用。除了上述提到的IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子外，還有前列腺素E2（PGE2）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等炎癥介質(zhì)參與其中。PGE2能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致牙槽骨吸收；MMPs則能夠降解牙周組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，破壞牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能。此外，氧化應(yīng)激、遺傳因素、全身性疾病（如糖尿病、心血管疾病等）、吸煙、精神壓力等因素也會(huì)影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致牙周組織中的活性氧簇（ROS）增多，損傷細(xì)胞和組織；遺傳因素可能會(huì)影響個(gè)體對(duì)牙周炎的易感性；全身性疾病會(huì)改變機(jī)體的免疫狀態(tài)和代謝功能，增加牙周炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；吸煙會(huì)降低口腔局部的免疫功能，促進(jìn)菌斑的堆積；精神壓力則會(huì)通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)影響免疫功能，加重牙周炎的炎癥反應(yīng)。2.2動(dòng)物模型在牙周炎研究中的重要性動(dòng)物模型在牙周炎研究中扮演著不可或缺的角色，為深入探究牙周炎的發(fā)病機(jī)制、評(píng)估治療效果以及研發(fā)新藥提供了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在模擬人類牙周炎方面，由于人類牙周炎的發(fā)病過(guò)程受到多種復(fù)雜因素的影響，包括個(gè)體的生活習(xí)慣、遺傳背景、全身健康狀況等，且臨床研究存在諸多限制，如難以控制單一變量、樣本獲取困難等，因此直接在人體上進(jìn)行深入研究具有一定的局限性。而動(dòng)物模型能夠在相對(duì)可控的實(shí)驗(yàn)條件下，模擬人類牙周炎的發(fā)病過(guò)程。通過(guò)選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠、小鼠、犬、小型豬等，利用各種造模方法，如結(jié)扎法、細(xì)菌接種法、高糖飲食法、脂多糖注射法等，可以誘導(dǎo)出與人類牙周炎相似的病理變化，包括牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收等。這使得研究人員能夠在動(dòng)物身上觀察牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為理解人類牙周炎的病理機(jī)制提供重要線索。深入研究發(fā)病機(jī)制是牙周炎研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。動(dòng)物模型為研究牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供了有力工具。通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型的研究，能夠深入探討菌斑微生物及其產(chǎn)物、宿主免疫反應(yīng)、炎癥介質(zhì)等在牙周炎發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制。在動(dòng)物模型中，可以精確控制菌斑微生物的種類和數(shù)量，研究其對(duì)牙周組織的直接損傷作用。還可以觀察宿主免疫細(xì)胞在炎癥部位的募集、活化和功能變化，以及免疫反應(yīng)對(duì)牙周組織的影響。研究炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、前列腺素等在牙周炎發(fā)病過(guò)程中的表達(dá)變化和作用機(jī)制，有助于揭示牙周炎的發(fā)病本質(zhì)。評(píng)估治療效果是牙周炎研究的重要目標(biāo)之一。動(dòng)物模型在評(píng)估各種治療方法和藥物對(duì)牙周炎的治療效果方面具有重要價(jià)值。在動(dòng)物模型上，可以對(duì)不同的治療方法和藥物進(jìn)行系統(tǒng)的研究和比較。對(duì)于牙周基礎(chǔ)治療方法，如潔治、刮治、根面平整等，可以在動(dòng)物模型中觀察其對(duì)牙周組織炎癥的控制、牙周袋深度的減少、牙槽骨吸收的抑制等效果。對(duì)于藥物治療，無(wú)論是抗生素、抗炎藥物還是生物活性物質(zhì)，都能通過(guò)動(dòng)物模型評(píng)估其療效、安全性和作用機(jī)制。這為臨床治療方案的制定和優(yōu)化提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。新藥研發(fā)是牙周炎治療領(lǐng)域的重要任務(wù)。動(dòng)物模型在牙周炎新藥研發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在新藥研發(fā)的早期階段，通過(guò)動(dòng)物模型可以對(duì)候選藥物的有效性和安全性進(jìn)行初步評(píng)估。觀察藥物在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄情況，以及對(duì)牙周組織的作用效果，篩選出具有潛在治療價(jià)值的藥物。動(dòng)物模型還可以用于研究藥物的作用機(jī)制，為藥物的進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)提供理論支持。在新藥研發(fā)的過(guò)程中，動(dòng)物模型的研究結(jié)果可以為臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和開(kāi)展提供重要參考，提高新藥研發(fā)的成功率。2.3常見(jiàn)牙周炎動(dòng)物模型構(gòu)建方法2.3.1結(jié)扎線法結(jié)扎線法是一種較為成熟且廣泛應(yīng)用的建立牙周炎動(dòng)物模型的方法。其操作流程相對(duì)簡(jiǎn)單，首先選取合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如SD大鼠或Wistar大鼠。以10％水合氯醛按0.2mL/100g的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，將其仰臥位固定并張口，使用尖頭探針小心地將第二磨牙的牙齦分離。接著，選用結(jié)扎材料，如尼龍線、細(xì)絲線、橡皮圈或正畸用鋼絲等，其中正畸不銹鋼絲因結(jié)扎效果好、成功率高而被優(yōu)先選擇。將結(jié)扎材料環(huán)繞上頜第一磨牙牙頸部，置于齦溝內(nèi)，注意避免損傷結(jié)合上皮。結(jié)扎完成后，術(shù)后給予大鼠高糖飲食（如10%葡萄糖水和用10%葡萄糖水浸泡變軟的常規(guī)飼料），以促進(jìn)菌斑堆積。結(jié)扎線法具有諸多優(yōu)點(diǎn)。操作簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)，一般實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展。能在較短時(shí)間內(nèi)造成牙周炎，通常4周左右即可形成明顯的牙槽骨吸收和炎癥。這使得研究人員能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)觀察到牙周炎的病理變化，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。該方法還具有較高的重復(fù)性，不同研究人員按照相同的操作流程，能夠得到較為一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該方法也存在一些缺點(diǎn)。結(jié)扎過(guò)程中可能會(huì)對(duì)牙頸處包裹的牙周組織造成輕微的機(jī)械性損傷，這種損傷可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于結(jié)扎線的存在，可能會(huì)導(dǎo)致局部菌斑堆積不均勻，影響實(shí)驗(yàn)的可靠性。與人類慢性牙周炎病程相比，結(jié)扎線法誘導(dǎo)的牙周炎病程較短，可能無(wú)法完全模擬人類慢性牙周炎的長(zhǎng)期發(fā)展過(guò)程。在實(shí)際應(yīng)用中，許多研究成功地運(yùn)用了結(jié)扎線法建立牙周炎動(dòng)物模型。Achong等用肌內(nèi)注射氯胺酮(44mg/kg)法麻醉Sprague-Dawley大鼠，在其上頜第二磨牙頸部結(jié)扎絲線，7d時(shí)大鼠出現(xiàn)急性炎癥，伴有上皮潰瘍，中性多形核白細(xì)胞(PMN)浸潤(rùn)，結(jié)締組織崩解，并出現(xiàn)根面吸收。21d時(shí)，結(jié)合上皮根向遷移，大體及放射線觀察均見(jiàn)第二磨牙牙周有中到重度的水平型牙槽骨吸收。Bezerra等置尼龍線于Wistar大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙牙頸部，并在前庭處打結(jié)，以保證絲線位于腭側(cè)齦下。發(fā)現(xiàn)第4天時(shí)大鼠開(kāi)始出現(xiàn)牙槽骨喪失，7d時(shí)達(dá)到高峰。組織病理學(xué)顯示第一、第二磨牙區(qū)進(jìn)展性單核細(xì)胞浸潤(rùn)，破骨細(xì)胞數(shù)目增加，并有嚴(yán)重的牙骨質(zhì)和牙槽骨吸收。這些成功案例充分證明了結(jié)扎線法在牙周炎動(dòng)物模型構(gòu)建中的有效性和實(shí)用性。2.3.2高糖黏性食料喂飼聯(lián)合其他方法高糖黏性食料喂飼聯(lián)合其他方法的原理是利用高糖黏性軟食易黏附于牙面的特點(diǎn)，促使動(dòng)物口腔中自然菌群的黏著滋生，從而達(dá)到菌斑堆積的目的。同時(shí)，結(jié)合其他手段，如結(jié)扎、局部接種致病菌等，進(jìn)一步輔助誘導(dǎo)動(dòng)物牙周炎的形成。在伴糖尿病牙周炎動(dòng)物模型的研究中，該方法可更好地模擬臨床上相應(yīng)患者的發(fā)病機(jī)制。具體操作步驟如下，選取Wistar大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。使用牙科探針?lè)蛛x第一、二磨牙牙間間隙，采用直徑為0.2mm的正畸不銹鋼絲結(jié)扎大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙頸部。用持針器夾持結(jié)扎絲從大鼠上頜雙側(cè)第一磨牙遠(yuǎn)中腭側(cè)進(jìn)入，環(huán)繞上頜第一磨牙一周后，在腭側(cè)偏近中處結(jié)扎固定，結(jié)扎絲末端保留3mm回彎置于齦下，防止結(jié)扎絲劃傷口腔內(nèi)軟組織，且不損傷牙齦的結(jié)合上皮。術(shù)后嚴(yán)密觀察大鼠的狀態(tài)，從實(shí)驗(yàn)當(dāng)天起喂食糖水，12小時(shí)后進(jìn)食，每天給予高糖飲食喂養(yǎng)，飲用水為10%葡萄糖水，飼料為10%葡萄糖水浸泡變軟的常規(guī)飼料。術(shù)后每周檢查牙周結(jié)扎情況，并觀察牙周組織的狀況。單獨(dú)使用高糖低蛋白飼料飼養(yǎng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)牙周袋產(chǎn)生、牙槽骨吸收和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化，但建模效果一般，且耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要3個(gè)月左右才能觀察到重度牙周炎癥狀。通過(guò)與其他方法聯(lián)合使用，可以顯著提高建模效率和成功率。高糖飲食聯(lián)合結(jié)扎法，能夠加速菌斑的堆積和炎癥的發(fā)展，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在更短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)典型的牙周炎癥狀。在一項(xiàng)研究中，采用高糖飲食聯(lián)合結(jié)扎法，在2周時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物就出現(xiàn)了牙周袋，4周時(shí)牙槽骨吸收至根尖，成功模擬了人類牙周炎的急性進(jìn)展過(guò)程。在伴糖尿病牙周炎動(dòng)物模型的研究中，該方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。糖尿病患者由于血糖水平升高，口腔微環(huán)境發(fā)生改變，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)機(jī)體的免疫功能也會(huì)受到影響，使得糖尿病患者更容易患牙周炎，且病情往往更嚴(yán)重。通過(guò)高糖黏性食料喂飼聯(lián)合其他方法，可以較好地模擬糖尿病患者的口腔環(huán)境和全身狀態(tài)，為研究伴糖尿病牙周炎的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.3.3注射脂多糖（LPS）法脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，具有很強(qiáng)的免疫原性和毒性。在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，LPS起著重要的作用。它可以激活宿主的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，使其釋放大量的炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）等。這些炎癥介質(zhì)會(huì)引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙周組織的損傷和破壞，包括牙齦紅腫、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收等。注射LPS法的具體操作步驟如下，選取合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如Wistar大鼠。將大鼠麻醉后，在其下頜第二磨牙頰側(cè)齦溝內(nèi)注射LPS溶液。LPS溶液的濃度一般為2mg/mL，每次注射0.1mL。注射頻率通常為每周3次，持續(xù)3周左右即可誘導(dǎo)牙槽骨吸收。在一些研究中，也會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨螅{(diào)整LPS的注射劑量、濃度和頻率。在操作過(guò)程中，有一些注意事項(xiàng)需要特別關(guān)注。LPS的純化過(guò)程較為復(fù)雜，其生物活性容易受到多種因素的影響，如保存條件、純化方法等。因此，在使用LPS時(shí)，需要確保其生物活性的穩(wěn)定性，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。注射LPS時(shí)，要嚴(yán)格控制注射的部位和劑量，避免因注射不當(dāng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。還要注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境和健康狀況，減少其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。三、局部LPS注射法建立牙周炎動(dòng)物模型3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇在牙周炎研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇至關(guān)重要，不同動(dòng)物具有各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如猴，其牙式與人完全相同，除牙列大小差異、尖牙較大、切牙對(duì)刃牙合、前牙有間隙外，牙體和牙周解剖、組織病理學(xué)、微生物學(xué)及免疫學(xué)等都與人類極為相似，是牙周病研究的理想動(dòng)物。然而，由于其價(jià)格昂貴，繁殖速度慢，且屬于國(guó)家自然保護(hù)動(dòng)物，獲取難度大，難以進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究。狗也是常用的牙周炎研究動(dòng)物，其牙周組織結(jié)構(gòu)和組織學(xué)表現(xiàn)與人類相似，有乳牙和恒牙兩副牙列，牙面上常有牙石沉積，尖牙、前磨牙的牙間隙寬。價(jià)格適中且容易控制，尤其適用于各種牙周袋的研究，如Beagle犬在牙周病研究中被國(guó)外學(xué)者廣泛使用。但狗的飼養(yǎng)和管理相對(duì)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)操作也有一定難度。大鼠在牙周病研究中應(yīng)用最為廣泛，其中Wistar大鼠和SD大鼠是常用的品系。Wistar大鼠性情溫順，易于操作和管理。SD大鼠則生長(zhǎng)發(fā)育快，對(duì)疾病的抵抗力較強(qiáng)。這兩種大鼠口腔菌斑的形成及其生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等都與人類相似，磨牙牙周組織結(jié)構(gòu)、組織病理也與人類近似。而且它們價(jià)格便宜，易于飼養(yǎng)，成活率高，繁殖率較高，能夠提供足夠數(shù)量的樣本用于研究和統(tǒng)計(jì)分析。雖然大鼠牙周病發(fā)病率遠(yuǎn)低于人，牙齒較小，對(duì)操作和觀察有一定影響，且牙齒能持續(xù)不斷生長(zhǎng)，只適合短時(shí)程的實(shí)驗(yàn)研究，但綜合考慮成本、操作便利性、實(shí)驗(yàn)周期等因素，Wistar大鼠或SD大鼠是局部LPS注射法建立牙周炎動(dòng)物模型的理想選擇。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑為脂多糖（LPS），通常來(lái)源于牙齦卟啉單胞菌等牙周致病菌。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，具有很強(qiáng)的免疫原性和毒性，能夠刺激宿主的免疫反應(yīng)，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)中使用的LPS可從Sigma-Aldrich等知名試劑公司購(gòu)買，其純度和活性經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。麻醉劑選用10%水合氯醛，用于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，以確保在注射LPS等操作過(guò)程中動(dòng)物的安全和配合。10%水合氯醛具有麻醉效果確切、作用時(shí)間適中、對(duì)動(dòng)物生理功能影響較小等優(yōu)點(diǎn)?？赏ㄟ^(guò)腹腔注射的方式給予動(dòng)物，劑量一般為0.2mL/100g體重。固定器械包括鼠板和綁帶，用于在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中固定大鼠，使其保持穩(wěn)定的體位，便于進(jìn)行LPS注射等操作。鼠板通常采用有機(jī)玻璃材質(zhì)，表面光滑，易于清潔和消毒。綁帶則選用柔軟、有彈性的材質(zhì)，如橡膠帶或布帶，能夠在不損傷動(dòng)物的前提下將其牢固固定。檢測(cè)儀器方面，需要使用Micro-CT（微計(jì)算機(jī)斷層掃描）對(duì)大鼠的牙槽骨進(jìn)行掃描和三維圖像重建，以評(píng)估牙槽骨的吸收情況。Micro-CT具有高分辨率、無(wú)創(chuàng)傷、能夠?qū)ξ⑿〗Y(jié)構(gòu)進(jìn)行精確成像等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)Micro-CT掃描，可以清晰地觀察到牙槽骨的形態(tài)、密度和結(jié)構(gòu)變化，為判斷牙周炎的嚴(yán)重程度提供客觀的影像學(xué)依據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)中，可選用德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)的SkyScan1176Micro-CT等設(shè)備，其性能穩(wěn)定，成像質(zhì)量高。還需配備光學(xué)顯微鏡，用于對(duì)大鼠的牙周組織和牙髓組織進(jìn)行組織學(xué)觀察。通過(guò)對(duì)組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色等處理，在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，為研究牙周炎對(duì)牙髓和修復(fù)性牙本質(zhì)的影響提供組織學(xué)證據(jù)。3.2實(shí)驗(yàn)步驟3.2.1動(dòng)物麻醉實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，選用10%水合氯醛作為麻醉劑對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。根據(jù)大鼠的體重，精確計(jì)算麻醉劑的用量，劑量為0.2mL/100g體重。在注射麻醉劑前，先將大鼠放置于鼠籠中，使其處于安靜、舒適的環(huán)境，以減少其應(yīng)激反應(yīng)。使用一次性注射器抽取適量的10%水合氯醛，排盡注射器內(nèi)的空氣。將大鼠從鼠籠中取出，用左手輕輕握住大鼠的身體，使其腹部朝上，右手持注射器，在大鼠腹部的左下腹或右下腹位置，避開(kāi)內(nèi)臟器官，緩慢將麻醉劑注入腹腔。注射過(guò)程中，密切觀察大鼠的反應(yīng)，如大鼠的呼吸頻率、肌肉松弛程度等。當(dāng)大鼠的呼吸變得平穩(wěn)、肌肉逐漸松弛、失去自主活動(dòng)能力時(shí)，表明麻醉成功。將麻醉后的大鼠仰臥位放置于鼠板上，用綁帶將大鼠的四肢固定，使其保持穩(wěn)定的體位，便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。在麻醉過(guò)程中，要嚴(yán)格控制麻醉劑的劑量，避免因麻醉過(guò)深導(dǎo)致大鼠呼吸抑制、心跳驟停等嚴(yán)重不良反應(yīng)，也要防止麻醉過(guò)淺，使大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中蘇醒，影響實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。還要注意保持大鼠的體溫，可在鼠板上放置加熱墊，維持大鼠的體溫在正常范圍內(nèi)，減少麻醉對(duì)大鼠生理功能的影響。3.2.2LPS注射操作在大鼠麻醉成功并固定好體位后，進(jìn)行LPS注射操作。使用微量注射器吸取濃度為2mg/mL的LPS溶液，每次注射劑量為0.1mL。將微量注射器的針頭輕輕插入大鼠下頜第二磨牙頰側(cè)齦溝內(nèi)，注意插入的深度要適中，避免過(guò)深損傷牙周組織，過(guò)淺則無(wú)法將LPS溶液準(zhǔn)確注入齦溝。緩慢推動(dòng)注射器的活塞，將LPS溶液均勻地注射到齦溝內(nèi)。注射完畢后，輕輕拔出針頭，用棉球輕輕按壓注射部位，防止LPS溶液流出。注射頻率為每周3次，連續(xù)注射3周。在每次注射前，要對(duì)注射部位進(jìn)行消毒，使用碘伏棉球擦拭下頜第二磨牙頰側(cè)牙齦，以減少感染的風(fēng)險(xiǎn)。還要檢查微量注射器的準(zhǔn)確性和密封性，確保注射劑量的精確性。在注射過(guò)程中，要注意觀察大鼠的反應(yīng)，如是否有出血、腫脹等異常情況，如有異常，應(yīng)及時(shí)采取相應(yīng)的處理措施。3.2.3模型觀察與維護(hù)在LPS注射后，對(duì)大鼠進(jìn)行密切觀察。每天觀察大鼠的牙齦狀況，包括牙齦的顏色、質(zhì)地、是否有紅腫、出血等情況。使用牙周探針定期測(cè)量牙周袋深度，評(píng)估牙周組織的破壞程度。每周對(duì)大鼠的牙齒松動(dòng)度進(jìn)行檢查，判斷牙槽骨的吸收情況對(duì)牙齒支持的影響。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要確保大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境清潔、衛(wèi)生，溫度控制在22-25℃，濕度保持在40%-60%。提供充足的食物和清潔的飲用水，食物可選用標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料。定期更換鼠籠內(nèi)的墊料，減少細(xì)菌滋生。還要避免大鼠受到外界的刺激，如噪音、強(qiáng)光等，保持其生活環(huán)境的安靜和穩(wěn)定。每3周使用Micro-CT對(duì)大鼠的牙槽骨進(jìn)行掃描，觀察牙槽骨的吸收情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，取下頜骨進(jìn)行組織學(xué)分析，進(jìn)一步確定牙周炎模型的建立是否成功。通過(guò)觀察牙周組織的病理變化，如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)合上皮根方遷移、牙槽骨吸收等情況，評(píng)估模型的質(zhì)量。3.3模型驗(yàn)證3.3.1組織學(xué)分析在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理，迅速取下包含下頜第二磨牙的下頜骨組織。將取下的下頜骨組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)，以保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。隨后，使用10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液對(duì)固定后的下頜骨進(jìn)行脫鈣處理，脫鈣時(shí)間通常為2-3周，期間需定期更換EDTA溶液，以確保脫鈣效果。脫鈣完成后，將下頜骨組織依次經(jīng)過(guò)梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）進(jìn)行脫水處理，每個(gè)濃度的酒精中浸泡時(shí)間為1-2小時(shí)。脫水后的下頜骨組織再用二甲苯進(jìn)行透明處理，每次處理時(shí)間為30分鐘，共進(jìn)行2-3次。將透明后的下頜骨組織放入石蠟中進(jìn)行包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4-5μm。對(duì)石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟如下，將切片放入二甲苯中脫蠟2次，每次10分鐘。然后依次經(jīng)過(guò)梯度酒精（100%、95%、90%、80%、70%）進(jìn)行水化處理，每個(gè)濃度的酒精中浸泡時(shí)間為5分鐘。將水化后的切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，自來(lái)水沖洗10分鐘，以去除多余的蘇木精染液。再將切片放入1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。將切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，自來(lái)水沖洗。最后，將染色后的切片依次經(jīng)過(guò)梯度酒精（80%、90%、95%、100%）進(jìn)行脫水處理，每個(gè)濃度的酒精中浸泡時(shí)間為5分鐘。脫水后的切片用二甲苯透明2次，每次10分鐘，然后用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片，正常牙周組織的牙齦上皮完整，結(jié)締組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，牙槽骨結(jié)構(gòu)完整，骨小梁排列整齊。而在成功建立的牙周炎模型中，可見(jiàn)牙齦上皮增生、潰瘍，結(jié)締組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。牙周袋形成，結(jié)合上皮根方遷移，與牙面分離，牙周袋內(nèi)可見(jiàn)炎性滲出物和細(xì)菌。牙槽骨吸收明顯，骨小梁稀疏、斷裂，破骨細(xì)胞數(shù)量增多，可見(jiàn)破骨細(xì)胞在牙槽骨表面的吸收陷窩。通過(guò)觀察這些組織學(xué)變化，可以判斷牙周炎模型是否成功建立。3.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)分析免疫細(xì)胞化學(xué)分析主要用于檢測(cè)牙周組織中相關(guān)炎癥因子和細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況。將制備好的石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化處理，具體步驟同HE染色。為了增強(qiáng)抗原的暴露，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中進(jìn)行抗原修復(fù)，采用高壓修復(fù)法，將切片放入高壓鍋中，加熱至沸騰后維持2-3分鐘，然后自然冷卻。修復(fù)后的切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘。為了減少非特異性染色，將切片滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫孵育30分鐘。將封閉后的切片傾去封閉液，不洗，直接滴加一抗，一抗為針對(duì)目標(biāo)炎癥因子（如白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等）或細(xì)胞標(biāo)志物（如破骨細(xì)胞標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶等）的特異性抗體，按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋，4℃孵育過(guò)夜。次日，將切片用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，立即用自來(lái)水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。將復(fù)染后的切片依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色切片，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和分布情況，可以判斷相關(guān)炎癥因子和細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平。在牙周炎模型中，炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等的表達(dá)水平明顯升高，在炎癥細(xì)胞和牙周組織細(xì)胞中均可見(jiàn)大量棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。破骨細(xì)胞標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶的表達(dá)也顯著增加，在牙槽骨吸收部位的破骨細(xì)胞中呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性染色。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)分析，可以進(jìn)一步驗(yàn)證牙周炎模型的成功建立，并深入了解牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞變化機(jī)制。3.3.3影像學(xué)分析影像學(xué)分析采用Micro-CT技術(shù)，對(duì)大鼠的下頜骨進(jìn)行掃描和三維圖像重建，以觀察牙槽骨的吸收情況。在掃描前，將大鼠下頜骨標(biāo)本固定在專用的標(biāo)本架上，確保標(biāo)本位置穩(wěn)定。調(diào)整Micro-CT的掃描參數(shù)，電壓一般設(shè)置為80-100kV，電流為50-100μA，掃描層厚為10-20μm，以保證獲得高分辨率的圖像。對(duì)下頜骨進(jìn)行全方位掃描，獲取一系列斷層圖像。使用專門的圖像分析軟件（如CTAn等）對(duì)掃描得到的斷層圖像進(jìn)行三維重建。在重建過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整閾值等參數(shù)，將牙槽骨與周圍組織區(qū)分開(kāi)來(lái)，構(gòu)建出清晰的牙槽骨三維模型。在三維模型上，可以直觀地觀察牙槽骨的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和密度變化。正常牙槽骨的形態(tài)完整，骨小梁結(jié)構(gòu)清晰，密度均勻。而在牙周炎模型中，可見(jiàn)牙槽骨高度降低，骨小梁稀疏、斷裂，骨密度下降。通過(guò)軟件測(cè)量牙槽骨的高度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度等參數(shù)，與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，進(jìn)一步量化牙槽骨的吸收程度。在牙周炎模型組中，牙槽骨高度明顯低于正常對(duì)照組，骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度也顯著降低。Micro-CT影像學(xué)分析具有高分辨率、無(wú)創(chuàng)傷、能夠?qū)ξ⑿〗Y(jié)構(gòu)進(jìn)行精確成像等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)檠乐苎啄Ｐ偷尿?yàn)證提供客觀、準(zhǔn)確的影像學(xué)依據(jù)。四、牙周炎動(dòng)物模型對(duì)牙髓的影響4.1牙髓的生理結(jié)構(gòu)與功能牙髓位于牙齒內(nèi)部的牙髓腔內(nèi)，是一種疏松結(jié)締組織，主要由細(xì)胞、纖維、神經(jīng)、血管、淋巴管和其他細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。從組織結(jié)構(gòu)上看，牙髓由外向內(nèi)可分為四層。最外層為成牙本質(zhì)細(xì)胞層，成牙本質(zhì)細(xì)胞呈柱狀，緊密排列在牙髓的周邊，與前期牙本質(zhì)相連。這些細(xì)胞具有形成牙本質(zhì)的重要功能，它們能夠分泌膠原蛋白和非膠原蛋白，進(jìn)而礦化形成牙本質(zhì)。在成牙本質(zhì)細(xì)胞層內(nèi)側(cè)約25μm的區(qū)域是魏爾（Weil）層，也稱為乏細(xì)胞層，此層內(nèi)缺乏成纖維細(xì)胞，但富含神經(jīng)纖維。再向內(nèi)是多細(xì)胞層，主要由大量的成纖維細(xì)胞和儲(chǔ)備細(xì)胞（未分化的間質(zhì)細(xì)胞）構(gòu)成。中央?yún)^(qū)則含有較粗大的神經(jīng)纖維和血管，以及成纖維細(xì)胞。牙髓中的細(xì)胞成分多樣，各有其獨(dú)特的功能。成纖維細(xì)胞是牙髓中的主要細(xì)胞，呈星形，有胞質(zhì)突起相互連接。它們?cè)谘浪杞M織內(nèi)的分布不均勻，在創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在適當(dāng)?shù)拇碳は?，如暴露的前期牙本質(zhì)或炎癥細(xì)胞釋放的生長(zhǎng)因子、某些骨形成蛋白、細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)的刺激，成纖維細(xì)胞可增生、分化為新的成纖維細(xì)胞或成牙本質(zhì)細(xì)胞。組織細(xì)胞和未分化間充質(zhì)細(xì)胞通常位于小血管或毛細(xì)血管周圍，形態(tài)不規(guī)則，有短而鈍的突起，胞核小而圓，染色深。在受到刺激時(shí)，未分化間充質(zhì)細(xì)胞可分化成結(jié)締組織中任何一種類型的細(xì)胞，在炎癥中它可形成巨噬細(xì)胞。當(dāng)成牙本質(zhì)細(xì)胞消失時(shí)，它可以移向牙本質(zhì)壁，分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞，形成修復(fù)性牙本質(zhì)。樹(shù)突狀細(xì)胞主要分布在牙髓中央?yún)^(qū)的血管周圍和牙髓的外周區(qū)，如成牙本質(zhì)細(xì)胞周圍。此細(xì)胞常有3個(gè)以上的胞質(zhì)突起，在功能上屬抗原呈遞細(xì)胞，是牙髓免疫防御系統(tǒng)中重要的組成部分。T淋巴細(xì)胞是正常牙髓中的一種重要的細(xì)胞，包括有CD4和CD8陽(yáng)性細(xì)胞，它們是牙髓中主要免疫反應(yīng)細(xì)胞。牙髓在牙齒的生命活動(dòng)中具有多種重要功能。在形成功能方面，牙髓能夠不斷形成牙本質(zhì)。原發(fā)性牙本質(zhì)形成后，在牙齒的一生中，牙髓中的成牙本質(zhì)細(xì)胞會(huì)持續(xù)形成繼發(fā)性牙本質(zhì)。當(dāng)牙髓受到外界刺激時(shí)，還會(huì)誘導(dǎo)形成修復(fù)性牙本質(zhì)。修復(fù)性牙本質(zhì)的形成是一種防御機(jī)制，其目的是保護(hù)牙髓免遭不良刺激。修復(fù)性牙本質(zhì)形成的速度較快，牙本質(zhì)小管形態(tài)不規(guī)則，數(shù)目較少甚至缺乏，且不含成牙本質(zhì)細(xì)胞突，因此，它們對(duì)外界刺激的敏感性較低。若修復(fù)性牙本質(zhì)的形成速度過(guò)快，基質(zhì)中就會(huì)含有細(xì)胞或組織，形成類似骨組織樣外觀，因此又被稱為骨樣牙本質(zhì)。牙髓的營(yíng)養(yǎng)功能也十分關(guān)鍵，它通過(guò)血管為牙齒提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧，維持牙體組織的活力。牙髓內(nèi)的血管豐富，牙髓和牙周膜的血管除通過(guò)根尖孔交通外，尚可通過(guò)一些副根管相通。牙髓中的組織液還可形成牙本質(zhì)液，對(duì)維持牙本質(zhì)的生理功能具有重要意義。感覺(jué)功能是牙髓的另一重要功能，牙髓內(nèi)神經(jīng)豐富，進(jìn)入牙髓的神經(jīng)大多數(shù)是有髓神經(jīng)，傳導(dǎo)痛覺(jué)；少數(shù)為無(wú)髓神經(jīng)，系交感神經(jīng)，可調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張。牙髓神經(jīng)進(jìn)入根管后，至髓室纖維分散呈放射狀至成牙本質(zhì)細(xì)胞層，在靠近多細(xì)胞層，神經(jīng)纖維形成網(wǎng)狀，稱為神經(jīng)壁層（parietallayerofnerves）或Raschkow叢。自此層神經(jīng)軸突通過(guò)多細(xì)胞層和無(wú)細(xì)胞層，止于牙髓一牙本質(zhì)界處的成牙本質(zhì)細(xì)胞突起之間或牙本質(zhì)小管內(nèi)。當(dāng)牙齒受到外界刺激，如溫度、化學(xué)物質(zhì)或機(jī)械刺激時(shí)，牙髓神經(jīng)會(huì)將這些刺激轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動(dòng)，傳遞到大腦，產(chǎn)生疼痛感覺(jué)。牙髓還具有防御功能。當(dāng)牙髓受到細(xì)菌、毒素或其他有害物質(zhì)的侵襲時(shí)，牙髓內(nèi)的免疫細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等會(huì)被激活，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。它們能夠識(shí)別和清除病原體，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)牙髓組織的損傷。牙髓還可通過(guò)形成修復(fù)性牙本質(zhì)來(lái)阻擋外界刺激的進(jìn)一步侵入。4.2牙周炎對(duì)牙髓的影響機(jī)制在牙周炎的病理過(guò)程中，脂多糖（LPS）扮演著關(guān)鍵角色，其通過(guò)多種途徑對(duì)牙髓產(chǎn)生影響。牙周組織與牙髓組織之間存在著密切的解剖聯(lián)系，牙周膜中分布著豐富的血管、神經(jīng)和淋巴管，這些結(jié)構(gòu)與牙髓相通。當(dāng)牙周炎發(fā)生時(shí)，LPS可通過(guò)牙周膜血管、根尖孔以及側(cè)支根管等途徑進(jìn)入牙髓組織。牙周膜血管是LPS進(jìn)入牙髓的重要途徑之一。在牙周炎的炎癥狀態(tài)下，牙周膜血管擴(kuò)張，通透性增加，使得LPS能夠更容易地通過(guò)血管壁進(jìn)入血液循環(huán)。隨著血液循環(huán)，LPS可以到達(dá)牙髓組織，進(jìn)而引發(fā)牙髓的炎癥反應(yīng)。研究表明，在牙周炎動(dòng)物模型中，通過(guò)檢測(cè)牙髓組織中的LPS含量，發(fā)現(xiàn)其明顯高于正常對(duì)照組，這表明LPS能夠通過(guò)牙周膜血管進(jìn)入牙髓。根尖孔是牙髓與牙周組織之間的主要通道，也是LPS進(jìn)入牙髓的重要途徑。在正常情況下，根尖孔的直徑較小，能夠?qū)ρ浪杵鸬揭欢ǖ谋Ｗo(hù)作用。然而，在牙周炎時(shí)，由于牙槽骨吸收、牙周袋形成等病理變化，根尖孔周圍的組織受到破壞，使得根尖孔的直徑增大，LPS更容易通過(guò)根尖孔進(jìn)入牙髓。側(cè)支根管在牙齒中廣泛存在，其發(fā)生率因牙齒類型和個(gè)體差異而異。在牙周炎的過(guò)程中，LPS可以通過(guò)側(cè)支根管從牙周組織進(jìn)入牙髓，從而引起牙髓的炎癥。LPS進(jìn)入牙髓后，會(huì)激活牙髓內(nèi)的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞是牙髓免疫防御系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，當(dāng)LPS刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)被激活，釋放出多種炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥細(xì)胞因子具有強(qiáng)大的生物學(xué)活性，能夠引起牙髓組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙髓細(xì)胞的損傷和死亡。IL-1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2），PGE2能夠引起血管擴(kuò)張、通透性增加，導(dǎo)致牙髓組織充血、水腫。IL-6可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生抗體，參與免疫反應(yīng)，同時(shí)也能刺激破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致牙槽骨吸收。TNF-α則具有細(xì)胞毒性作用，能夠直接殺傷牙髓細(xì)胞，還能誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞LPS抗原，激活T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞被激活后，會(huì)分化為不同的亞型，如Th1、Th2、Th17等，它們分泌的細(xì)胞因子在牙髓炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不同的作用。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)展。Th2細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）等細(xì)胞因子，參與體液免疫反應(yīng)，同時(shí)也能抑制Th1細(xì)胞的功能。Th17細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，能夠招募中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到炎癥部位，加重炎癥反應(yīng)。LPS還能直接作用于牙髓細(xì)胞，影響其生物學(xué)功能。成牙本質(zhì)細(xì)胞是牙髓中的重要細(xì)胞，負(fù)責(zé)牙本質(zhì)的形成。研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以抑制成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，減少牙本質(zhì)基質(zhì)的合成和分泌。LPS還能誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和分泌炎癥介質(zhì)，如PGE2、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些炎癥介質(zhì)會(huì)破壞牙本質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致牙本質(zhì)的礦化異常和通透性增加。成纖維細(xì)胞是牙髓中的主要細(xì)胞之一，LPS可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，影響牙髓組織的修復(fù)和再生能力。LPS還能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，參與牙髓的炎癥反應(yīng)。4.3實(shí)驗(yàn)觀察與結(jié)果分析4.3.1牙髓組織病理學(xué)變化通過(guò)對(duì)牙周炎動(dòng)物模型的牙髓組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，牙周炎模型組的牙髓組織發(fā)生了明顯的病理學(xué)變化。在正常對(duì)照組中，牙髓組織的結(jié)構(gòu)完整，成牙本質(zhì)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，牙髓間質(zhì)中血管分布均勻，無(wú)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而在牙周炎模型組中，可見(jiàn)牙髓組織出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是牙周炎模型中牙髓組織的顯著變化之一，大量的炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，在牙髓組織中聚集。這些炎癥細(xì)胞主要分布在牙髓的血管周圍、成牙本質(zhì)細(xì)胞層以及牙髓間質(zhì)中。在炎癥初期，炎癥細(xì)胞主要以中性粒細(xì)胞為主，隨著炎癥的發(fā)展，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多。中性粒細(xì)胞能夠吞噬細(xì)菌和異物，但在吞噬過(guò)程中會(huì)釋放一些酶和細(xì)胞因子，如彈性蛋白酶、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致牙髓組織的損傷。巨噬細(xì)胞則具有強(qiáng)大的吞噬和免疫調(diào)節(jié)功能，能夠分泌多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。淋巴細(xì)胞則參與了免疫反應(yīng)，通過(guò)分泌細(xì)胞因子和抗體，對(duì)炎癥的發(fā)展和控制起到重要作用。牙髓組織中的血管也發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、充血。血管擴(kuò)張使得血管內(nèi)的血液流量增加，導(dǎo)致牙髓組織充血，呈現(xiàn)出紅色。血管通透性增加，使得血漿中的蛋白質(zhì)和液體滲出到組織間隙中，引起牙髓組織水腫。這些變化進(jìn)一步加重了牙髓組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙髓組織的壓力升高，刺激牙髓神經(jīng)，引起疼痛。在一些嚴(yán)重的病例中，還觀察到血管內(nèi)血栓形成的現(xiàn)象。血栓的形成會(huì)阻礙血液的流動(dòng)，導(dǎo)致牙髓組織缺血、缺氧，進(jìn)一步加重牙髓組織的損傷。長(zhǎng)期的缺血、缺氧還可能導(dǎo)致牙髓組織壞死。牙髓細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。成牙本質(zhì)細(xì)胞的排列變得紊亂，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死的現(xiàn)象。成牙本質(zhì)細(xì)胞的變性和壞死會(huì)影響牙本質(zhì)的形成和修復(fù)功能，導(dǎo)致牙本質(zhì)的礦化異常，通透性增加。牙髓中的成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器減少，表明成纖維細(xì)胞的功能受到了抑制。成纖維細(xì)胞在牙髓組織的修復(fù)和再生過(guò)程中起著重要作用，其功能的抑制會(huì)影響牙髓組織的修復(fù)能力。4.3.2牙髓細(xì)胞活性與功能變化利用細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)技術(shù)對(duì)牙髓細(xì)胞的活性、增殖能力和分泌功能進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示牙周炎對(duì)牙髓細(xì)胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生了顯著影響。在細(xì)胞活性方面，通過(guò)MTT比色法檢測(cè)牙髓細(xì)胞的活性，發(fā)現(xiàn)牙周炎模型組的牙髓細(xì)胞活性明顯低于正常對(duì)照組。MTT比色法是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞活性的方法，其原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)測(cè)定Formazan的吸光度值，可以間接反映細(xì)胞的活性。在本實(shí)驗(yàn)中，牙周炎模型組的牙髓細(xì)胞對(duì)MTT的還原能力降低，表明其細(xì)胞活性受到了抑制。這可能是由于牙周炎導(dǎo)致的炎癥微環(huán)境中存在大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些物質(zhì)能夠抑制牙髓細(xì)胞的代謝和功能，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。牙髓細(xì)胞的增殖能力也受到了明顯的抑制。采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記法檢測(cè)牙髓細(xì)胞的增殖情況，EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)熒光染色可以直觀地觀察到增殖細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牙周炎模型組中EdU陽(yáng)性的牙髓細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組，說(shuō)明牙周炎抑制了牙髓細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎模型組中與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，如PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）、CyclinD1等的表達(dá)水平顯著降低。PCNA是一種參與DNA合成的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。CyclinD1則是細(xì)胞周期蛋白，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些基因表達(dá)水平的降低，表明牙周炎通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，抑制了牙髓細(xì)胞的增殖。牙髓細(xì)胞的分泌功能也發(fā)生了改變。通過(guò)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）法檢測(cè)牙髓細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子和細(xì)胞因子的含量，發(fā)現(xiàn)牙周炎模型組中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌水平顯著升高。這些炎癥因子具有強(qiáng)大的生物學(xué)活性，能夠引起牙髓組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙髓細(xì)胞的損傷和死亡。IL-1β可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2），PGE2能夠引起血管擴(kuò)張、通透性增加，導(dǎo)致牙髓組織充血、水腫。IL-6可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生抗體，參與免疫反應(yīng)，同時(shí)也能刺激破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致牙槽骨吸收。TNF-α則具有細(xì)胞毒性作用，能夠直接殺傷牙髓細(xì)胞，還能誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。牙周炎模型組中與牙髓細(xì)胞修復(fù)和再生相關(guān)的細(xì)胞因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等的分泌水平降低。BMP-2能夠誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。VEGF則能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加血管通透性，促進(jìn)牙髓組織的血管生成，為牙髓細(xì)胞的修復(fù)和再生提供營(yíng)養(yǎng)支持。這些細(xì)胞因子分泌水平的降低，表明牙周炎抑制了牙髓細(xì)胞的修復(fù)和再生功能。4.3.3牙髓神經(jīng)感覺(jué)變化牙周炎對(duì)牙髓神經(jīng)感覺(jué)產(chǎn)生了顯著影響，通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)可以觀察到這一變化。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，采用冷熱刺激法對(duì)牙周炎動(dòng)物模型和正常對(duì)照組進(jìn)行測(cè)試。具體操作是將大鼠固定在特制的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，分別用冷刺激源（如冰塊）和熱刺激源（如加熱的金屬棒）接觸大鼠的牙齒，觀察大鼠的行為反應(yīng)。正常對(duì)照組的大鼠在受到冷熱刺激時(shí)，會(huì)出現(xiàn)短暫的躲避反應(yīng)，如頭部退縮、身體顫抖等，刺激結(jié)束后，大鼠的行為迅速恢復(fù)正常。而牙周炎模型組的大鼠在受到冷熱刺激時(shí)，表現(xiàn)出更為強(qiáng)烈的疼痛反應(yīng)，躲避反應(yīng)更為劇烈，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。在熱刺激時(shí)，牙周炎模型組的大鼠甚至?xí)霈F(xiàn)咬嚙實(shí)驗(yàn)器材、掙扎等行為，表明其對(duì)熱刺激的敏感度明顯增加。為了進(jìn)一步探究牙周炎對(duì)牙髓神經(jīng)感覺(jué)的影響機(jī)制，檢測(cè)了牙髓組織中神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的含量變化。通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，牙周炎模型組中P物質(zhì)（SP）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等神經(jīng)肽的含量顯著升高。SP和CGRP是感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的重要神經(jīng)肽，在疼痛信號(hào)的傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SP能夠直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管擴(kuò)張和通透性增加，導(dǎo)致炎癥部位充血、水腫。還能激活肥大細(xì)胞，使其釋放組胺、5-羥色胺等炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)和疼痛感覺(jué)。CGRP則具有強(qiáng)大的血管舒張作用，能夠增加血管通透性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和聚集。還能增強(qiáng)SP等神經(jīng)肽的致痛作用，參與疼痛信號(hào)的傳遞和調(diào)制。這些神經(jīng)肽含量的升高，表明牙周炎導(dǎo)致牙髓神經(jīng)感覺(jué)過(guò)敏，疼痛信號(hào)的傳遞和調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生了改變。通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)觀察牙髓神經(jīng)纖維的分布和形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)牙周炎模型組中牙髓神經(jīng)纖維的分布變得紊亂，部分神經(jīng)纖維出現(xiàn)腫脹、斷裂的現(xiàn)象。神經(jīng)纖維的損傷會(huì)影響神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致牙髓神經(jīng)感覺(jué)異常。在炎癥過(guò)程中，炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放可能會(huì)直接損傷神經(jīng)纖維，或者通過(guò)激活免疫細(xì)胞間接損傷神經(jīng)纖維。牙周炎引起的牙髓組織水腫和壓力升高，也可能對(duì)神經(jīng)纖維造成壓迫，導(dǎo)致神經(jīng)纖維的損傷和功能障礙。五、牙周炎動(dòng)物模型對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)的影響5.1修復(fù)性牙本質(zhì)的形成機(jī)制修復(fù)性牙本質(zhì)的形成是牙髓對(duì)各種刺激的一種重要防御反應(yīng)，其形成機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子的參與。當(dāng)牙本質(zhì)受到外界刺激，如齲病、磨損、酸蝕、牙周炎等，牙本質(zhì)小管內(nèi)的成牙本質(zhì)細(xì)胞突起及胞體首先受到損傷。這些損傷會(huì)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞的功能改變。受損的成牙本質(zhì)細(xì)胞部分發(fā)生變性，而牙髓深層的未分化間充質(zhì)細(xì)胞會(huì)遷移至受損部位，并分化為新的成牙本質(zhì)細(xì)胞。這些新形成的成牙本質(zhì)細(xì)胞與尚有功能的成牙本質(zhì)細(xì)胞一起，分泌牙本質(zhì)基質(zhì)。牙本質(zhì)基質(zhì)主要由膠原蛋白（如Ⅰ型膠原蛋白）和非膠原蛋白（如牙本質(zhì)涎磷蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1等）組成。在分泌過(guò)程中，成牙本質(zhì)細(xì)胞通過(guò)高爾基體將這些蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，形成一層無(wú)礦化的前期牙本質(zhì)。隨后，在一系列礦化相關(guān)蛋白和酶的作用下，前期牙本質(zhì)逐漸礦化，形成修復(fù)性牙本質(zhì)。在這個(gè)過(guò)程中，多種信號(hào)通路參與調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化和牙本質(zhì)基質(zhì)的合成。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族在修復(fù)性牙本質(zhì)形成中起著關(guān)鍵作用。TGF-β可以促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，增強(qiáng)成牙本質(zhì)細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)牙本質(zhì)基質(zhì)的合成和分泌。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）也是重要的信號(hào)分子。BMPs能夠誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞表達(dá)成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，促進(jìn)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。在牙髓損傷后，BMP-2、BMP-4等的表達(dá)會(huì)顯著增加，它們通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，如Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也參與了修復(fù)性牙本質(zhì)的形成過(guò)程。當(dāng)牙髓受到刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。這些激酶可以通過(guò)磷酸化作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而影響成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。ERK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，而p38MAPK信號(hào)通路的激活則主要參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，在修復(fù)性牙本質(zhì)形成過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。5.2牙周炎對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的影響在牙周炎的病理進(jìn)程中，脂多糖（LPS）作為重要的致病因素，對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成產(chǎn)生了顯著影響，這一過(guò)程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。LPS能夠刺激牙髓細(xì)胞，改變其生物學(xué)行為，進(jìn)而影響修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。研究表明，在牙周炎動(dòng)物模型中，隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，牙髓細(xì)胞的增殖活性逐漸降低。在LPS注射后的早期階段，牙髓細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)短暫的增殖反應(yīng)，這是牙髓組織對(duì)刺激的一種應(yīng)激反應(yīng)。隨著LPS持續(xù)作用，牙髓細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生改變，如CyclinD1等蛋白的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，影響了牙髓細(xì)胞的增殖能力。牙髓細(xì)胞的分化也受到干擾，成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）等的表達(dá)水平降低，使得牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程受阻，進(jìn)而減少了修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。炎癥反應(yīng)在LPS影響修復(fù)性牙本質(zhì)形成的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。LPS激活牙髓內(nèi)的免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞因子的釋放。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥細(xì)胞因子不僅能夠直接損傷牙髓細(xì)胞，還會(huì)干擾牙髓細(xì)胞的正常功能。IL-1β可以抑制成牙本質(zhì)細(xì)胞的活性，減少牙本質(zhì)基質(zhì)的合成和分泌。TNF-α則具有細(xì)胞毒性作用，能夠誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步破壞牙髓組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。這些炎癥細(xì)胞因子還會(huì)影響牙髓細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制與修復(fù)性牙本質(zhì)形成相關(guān)的信號(hào)通路的激活，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路。TGF-β信號(hào)通路在牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化以及修復(fù)性牙本質(zhì)形成過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，炎癥細(xì)胞因子的作用使得TGF-β信號(hào)通路的活性降低，從而影響了修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。在牙周炎動(dòng)物模型中，通過(guò)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，牙周炎模型組的修復(fù)性牙本質(zhì)形成量明顯減少。正常對(duì)照組在受到輕微刺激后，能夠迅速啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，形成一定量的修復(fù)性牙本質(zhì)，以保護(hù)牙髓組織。而在牙周炎模型組中，由于LPS的刺激和炎癥反應(yīng)的存在，修復(fù)性牙本質(zhì)的形成受到抑制，牙髓組織對(duì)刺激的防御能力減弱。在一些嚴(yán)重的牙周炎病例中，甚至觀察不到明顯的修復(fù)性牙本質(zhì)形成，牙髓組織直接暴露于炎癥環(huán)境中，增加了牙髓壞死和感染的風(fēng)險(xiǎn)。5.3實(shí)驗(yàn)觀察與結(jié)果分析5.3.1修復(fù)性牙本質(zhì)的組織學(xué)觀察通過(guò)組織切片技術(shù)，對(duì)牙周炎動(dòng)物模型和正常對(duì)照組的牙齒進(jìn)行了詳細(xì)的組織學(xué)觀察，以了解修復(fù)性牙本質(zhì)的形成部位、形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。在正常對(duì)照組中，牙齒的牙髓組織與牙本質(zhì)界限清晰，牙髓細(xì)胞排列整齊，成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，沿牙髓腔壁有序排列。牙本質(zhì)小管規(guī)則且均勻分布，管徑大小一致，從牙髓腔向釉牙本質(zhì)界呈放射狀延伸。在生理狀態(tài)下，牙髓組織處于穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中，幾乎沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，也未觀察到明顯的修復(fù)性牙本質(zhì)形成。在牙周炎動(dòng)物模型組中，觀察到顯著的變化。在靠近牙周炎病變部位的牙髓腔壁處，可見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。修復(fù)性牙本質(zhì)主要在受牙周炎炎癥刺激的牙本質(zhì)小管對(duì)應(yīng)的髓腔側(cè)沉積。其形態(tài)不規(guī)則，與原發(fā)性牙本質(zhì)之間存在一條明顯的分界線。在光鏡下，修復(fù)性牙本質(zhì)的牙本質(zhì)小管數(shù)目明顯減少，且小管走向彎曲、紊亂。這是因?yàn)樵谛迯?fù)性牙本質(zhì)形成過(guò)程中，牙髓細(xì)胞在炎癥刺激下分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，這些細(xì)胞的功能和排列與正常成牙本質(zhì)細(xì)胞不同，導(dǎo)致牙本質(zhì)小管的形成和排列異常。在一些區(qū)域，修復(fù)性牙本質(zhì)的小管甚至呈現(xiàn)出閉合狀態(tài)，這可能是牙髓組織為了阻擋炎癥刺激進(jìn)一步侵入而產(chǎn)生的一種防御機(jī)制。隨著牙周炎病情的進(jìn)展，修復(fù)性牙本質(zhì)的厚度逐漸增加。在早期階段，修復(fù)性牙本質(zhì)表現(xiàn)為薄層的、不連續(xù)的沉積物，散在分布于受刺激的牙髓腔壁。隨著炎癥的持續(xù)，修復(fù)性牙本質(zhì)不斷增厚，逐漸形成連續(xù)的層狀結(jié)構(gòu)。在高倍鏡下觀察，可見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)的基質(zhì)中含有較多的纖維成分，且礦化程度相對(duì)較低。這是由于在炎癥環(huán)境下，牙髓細(xì)胞的代謝活動(dòng)受到影響，導(dǎo)致牙本質(zhì)基質(zhì)的合成和礦化過(guò)程發(fā)生改變。在修復(fù)性牙本質(zhì)中，還觀察到一些成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞被包埋在基質(zhì)中，這些細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，周圍的基質(zhì)呈現(xiàn)出類似骨組織的結(jié)構(gòu)，被稱為骨樣牙本質(zhì)。骨樣牙本質(zhì)的出現(xiàn)表明修復(fù)性牙本質(zhì)的形成速度較快，成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞在基質(zhì)礦化過(guò)程中被包裹其中，未能完全分化成熟。5.3.2修復(fù)性牙本質(zhì)相關(guān)蛋白與基因表達(dá)為了深入探究牙周炎對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的分子機(jī)制，利用免疫組化和PCR等技術(shù)，對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，選擇了牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）作為主要的檢測(cè)指標(biāo)。DSPP是牙本質(zhì)特異性非膠原蛋白，在牙本質(zhì)的礦化和修復(fù)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。DMP1則參與了牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化調(diào)節(jié)。在正常對(duì)照組的牙髓組織中，DSPP和DMP1主要在成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，呈弱陽(yáng)性。這表明在生理狀態(tài)下，成牙本質(zhì)細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行牙本質(zhì)的合成和礦化，但速度相對(duì)較慢。在牙周炎動(dòng)物模型組中，牙髓組織中DSPP和DMP1的表達(dá)水平顯著升高。在靠近炎癥刺激部位的牙髓細(xì)胞和新分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞中，DSPP和DMP1的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。這說(shuō)明牙周炎的炎癥刺激能夠激活牙髓細(xì)胞，使其表達(dá)更多的DSPP和DMP1，從而促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，牙周炎模型組中DSPP、DMP1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）和堿性磷酸酶（ALP）等基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。BMP-2是一種重要的信號(hào)分子，能夠誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。ALP則參與了牙本質(zhì)基質(zhì)的礦化過(guò)程，其表達(dá)水平的升高表明礦化活動(dòng)增強(qiáng)。這些基因表達(dá)水平的變化與免疫組化的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了牙周炎能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。在牙周炎模型組中，也檢測(cè)到一些炎癥相關(guān)基因，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達(dá)水平顯著升高。這些炎癥因子可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，間接影響修復(fù)性牙本質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成過(guò)程。5.3.3修復(fù)性牙本質(zhì)形成的功能評(píng)估修復(fù)性牙本質(zhì)的形成對(duì)牙齒的力學(xué)性能和保護(hù)牙髓功能具有重要影響。在牙齒力學(xué)性能方面，通過(guò)微硬度測(cè)試和納米壓痕技術(shù)對(duì)正常對(duì)照組和牙周炎模型組的牙齒進(jìn)行了檢測(cè)。微硬度測(cè)試結(jié)果顯示，牙周炎模型組中修復(fù)性牙本質(zhì)區(qū)域的微硬度明顯低于正常牙本質(zhì)。這是因?yàn)樾迯?fù)性牙本質(zhì)的礦化程度相對(duì)較低，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)不夠致密，導(dǎo)致硬度下降。納米壓痕技術(shù)進(jìn)一步揭示了修復(fù)性牙本質(zhì)的彈性模量也低于正常牙本質(zhì)。彈性模量反映了材料抵抗彈性變形的能力，修復(fù)性牙本質(zhì)彈性模量的降低表明其在承受外力時(shí)更容易發(fā)生變形。這些力學(xué)性能的變化可能會(huì)影響牙齒的咀嚼功能和抗折能力。在長(zhǎng)期咀嚼過(guò)程中，修復(fù)性牙本質(zhì)區(qū)域更容易受到磨損和破壞，增加了牙齒折裂的風(fēng)險(xiǎn)。在保護(hù)牙髓功能方面，修復(fù)性牙本質(zhì)作為牙髓與外界刺激之間的一道屏障，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過(guò)熱刺激實(shí)驗(yàn)和電刺激實(shí)驗(yàn)對(duì)牙髓的敏感性進(jìn)行了評(píng)估。熱刺激實(shí)驗(yàn)中，將熱探頭接觸牙齒表面，觀察牙髓的反應(yīng)。結(jié)果顯示，牙周炎模型組中形成修復(fù)性牙本質(zhì)的牙齒，其牙髓對(duì)熱刺激的敏感性明顯低于未形成修復(fù)性牙本質(zhì)的牙齒。這表明修復(fù)性牙本質(zhì)能夠有效地阻擋外界熱刺激的傳導(dǎo)，減少牙髓受到的損傷。電刺激實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果，修復(fù)性牙本質(zhì)的存在降低了牙髓對(duì)電刺激的反應(yīng)。修復(fù)性牙本質(zhì)還能夠阻止細(xì)菌及其毒素等有害物質(zhì)從牙本質(zhì)小管侵入牙髓，從而保護(hù)牙髓組織免受感染。通過(guò)細(xì)菌侵入實(shí)驗(yàn)，將細(xì)菌接種在牙齒表面，觀察細(xì)菌在牙本質(zhì)小管中的侵入情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常牙本質(zhì)中，細(xì)菌能夠較快地通過(guò)牙本質(zhì)小管侵入牙髓。而在形成修復(fù)性牙本質(zhì)的牙齒中，細(xì)菌的侵入受到明顯抑制，修復(fù)性牙本質(zhì)的小管數(shù)目減少和彎曲的結(jié)構(gòu)有效地阻礙了細(xì)菌的傳播。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究成功通過(guò)局部LPS注射法建立了牙周炎動(dòng)物模型，為深入研究牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格按照既定的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。選用Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以10%水合氯醛按0.2mL/100g