ICS11.220

CCSB41

35

福建省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB35/T1958—2021

鴨巴泰病毒RT-PCR檢測(cè)方法

DetectionmethodofRT-PCRforduckBataivirus

2021-02-09發(fā)布2021-05-09實(shí)施

福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB35/T1958—2021

目次

前言..............................................................................II

1范圍.................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.......................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義...........................................................................1

4設(shè)備、材料和試劑.....................................................................1

5樣品采集、前處理和保存...............................................................2

6RT-PCR操作步驟.......................................................................2

7結(jié)果判定.............................................................................3

附錄A（規(guī)范性）試劑的配制及引物參考序列...........................................4

附錄B（資料性）RT-PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖...............................................6

I

DB35/T1958—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出

本文件由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。

本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、福州海關(guān)技術(shù)中心、福建省動(dòng)物疫病預(yù)防控

制中心、寧德海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。

本文件主要起草人：傅秋玲、傅光華、鄭騰、李中華、葉洪、黃瑜、萬(wàn)春和、程龍飛、施少華、張

體銀、劉榮昌、陳翠騰、彭春香、陳紅梅、陳珍、朱春華。

II

DB35/T1958—2021

鴨巴泰病毒RT-PCR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了鴨巴泰病毒核酸診斷的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）的檢測(cè)方法。

本文件適用于鴨巴泰病毒感染的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用

于本文件。

GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

GB19489—2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

鴨巴泰病毒Bataivirus；BATV

該病毒屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）的成員，為有囊

膜病毒，其基因組為單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA，大小約12kb，包含S、M和L等3個(gè)基因片段，分別編碼病毒的

核衣殼蛋白，囊膜蛋白和聚合酶蛋白。

3.2

鴨巴泰病毒病Bataivirusdisease

鴨巴泰病毒病在我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中，尤其是種番鴨、麻鴨中流行，其臨床表現(xiàn)以種（蛋）鴨產(chǎn)蛋下降、

卵巢出血和脾臟輕度出血為特征，與禽坦布蘇病毒病相似，易引起臨床混淆甚至誤診。此外，該病還危

害肉鴨，臨床上以生長(zhǎng)不良為特征。

4設(shè)備、材料和試劑

4.1設(shè)備

4.1.1PCR擴(kuò)增儀。

4.1.2微量可調(diào)移液器（100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。

4.1.3冰箱（2℃～8℃、-20℃）。

4.1.4高速冷凍離心機(jī)（其最高轉(zhuǎn)速應(yīng)大于12000r/min）。

4.1.5組織勻漿器。

4.1.6手術(shù)剪。

4.1.7手術(shù)鑷。

1

DB35/T1958—2021

4.1.8電泳儀。

4.1.9電泳槽。

4.1.10凝膠成像系統(tǒng)。

4.1.11旋渦振蕩器。

4.1.12超凈工作臺(tái)。

4.2材料和試劑

4.2.1試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682—2008中一級(jí)水的規(guī)格要求。

4.2.2磷酸鹽緩沖液（PBS）配制方法見(jiàn)附錄A的A.1。

4.2.3焦炭酸二乙酯處理水（DiethyPyrocarbonate，DEPC水）配制方法見(jiàn)附錄A的A.2。

4.2.4Trizol。

4.2.5三氯甲烷。

4.2.6異丙醇。

4.2.7無(wú)水乙醇。

4.2.875%乙醇：配制方法見(jiàn)附錄A的A.3。

4.2.9溴化乙錠溶液：配制方法見(jiàn)附錄A的A.4。

4.2.101×TAE緩沖液：配制方法見(jiàn)附錄A的A.5。

4.2.111.0%瓊脂糖凝膠：配制方法見(jiàn)附錄A的A.6。

4.2.12DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物：DL2000。

4.2.1310×加樣緩沖液：配制方法見(jiàn)附錄A的A.7。

4.2.14RT-PCR檢測(cè)用引物和使用方法見(jiàn)附錄A的A.8。

4.2.15對(duì)照樣品：以提取的鴨巴泰病毒提取的核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）作為陽(yáng)性對(duì)照，

以其他禽源RNA病毒（如禽坦布蘇病毒）RNA樣品作為陰性對(duì)照，以滅菌去離子水作為空白對(duì)照。

5樣品采集、前處理和保存

5.1樣品采集和運(yùn)輸

采樣所用器具（手術(shù)剪、手術(shù)鑷和容器等）應(yīng)預(yù)先滅菌處理，在采樣過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套和口罩，

以免樣品間交叉污染。采集產(chǎn)蛋下降疑似病鴨的卵巢或（和）脾臟裝入滅菌過(guò)的容器中，編號(hào)后置于冷

藏箱內(nèi)在24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

5.2樣品處理

在超凈工作臺(tái)中取出采集的待檢樣品置于滅菌平皿內(nèi)，充分剪碎后與磷酸鹽緩沖液按體積比1:3的

比例制成組織勻漿液，反復(fù)凍融3次后于4℃～10℃條件下8000r/min離心30min，取上清用于核酸

（RNA）的抽提，或置-20℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.3樣品保存

采集或處理的樣品，在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h。否則，需保存在-20℃條件下，但時(shí)

間不超過(guò)7d；若需較長(zhǎng)時(shí)間待處理，應(yīng)保存在-70℃條件下，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

6RT-PCR操作步驟

2

DB35/T1958—2021

6.1病毒RNA提取

病毒RNA提取應(yīng)采用以下步驟或等效的商品化RNA提取試劑盒進(jìn)行，且在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中應(yīng)遵守GB

19489—2008的要求。

取200μL待檢樣品，加入1mLTrizol試劑，用移液器充分混勻，室溫放置5min；加入200μL

三氯甲烷，旋渦振蕩30s混勻，室溫放置15min；4℃下12000r/min離心15min；取上層水相加入等

體積異丙醇，上下顛倒數(shù)次混勻，-20℃放置20min；4℃下12000r/min離心15min；棄上清液，沉

淀用1mL75％乙醇清洗；10000r/min離心10min，棄上清液，沉淀室溫干燥5min；加20μLDEPC

水溶解RNA沉淀。-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，RNA溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融，并盡快用于檢測(cè)?？瞻讓?duì)照、陰性對(duì)

照和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行同步操作。

6.2RT-PCR反應(yīng)

RT-PCR反應(yīng)體系為25μL，每個(gè)反應(yīng)管的反應(yīng)體系為：依次加入14μL焦炭酸二乙酯（DEPC）處

理水，2.5μL反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，2.5μLTaq聚合酶緩沖液，0.5μLdNTP，0.5μLTaq聚合酶，0.5

μL反轉(zhuǎn)錄酶，0.5μLRNA酶抑制劑，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，樣品的RNA各3μL?；?/p>

勻后2000r/min離心15s，使反應(yīng)混合液都沉降到PCR管底。將上述混合物按照以下步驟進(jìn)行RT-PCR：

第一步是反轉(zhuǎn)錄，42℃，30min；第二步是PCR循環(huán)，94℃預(yù)變性3min；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30s，

52.4℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；最后，72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，可將產(chǎn)物保存

于4℃。

6.3RT-PCR產(chǎn)物電泳

反應(yīng)結(jié)束后，分別取待檢樣品、陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品和空白對(duì)照樣品各5μLRT-PCR產(chǎn)物

與0.5μL加樣緩沖液混合均勻，加入到1.0%瓊脂糖凝膠板的樣孔中；同時(shí)，在另一樣孔中加5μLDL2

000標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照；以5V/cm的電壓電泳30min后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察結(jié)果。

7結(jié)果判定

7.1結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)480bp特異性條帶（見(jiàn)附錄B電泳圖2號(hào)泳道）、陰性對(duì)照（見(jiàn)附錄B電泳圖3號(hào)泳道）

和空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增條帶（見(jiàn)附錄B電泳圖4號(hào)泳道）時(shí)，表明本次實(shí)驗(yàn)成立。

7.2結(jié)果判定

當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)480bp特異性條帶（見(jiàn)附錄B電泳圖5號(hào)泳道），結(jié)果判為陽(yáng)性，若無(wú)特異性擴(kuò)增條

帶（見(jiàn)附錄B電泳圖6號(hào)泳道），結(jié)果判為陰性。

3

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附錄A

（規(guī)范性）

試劑的配制及引物參考序列

A.10.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）

NaCl8.0g

KCl0.2g

Na2HPO41.15g

KH2PO40.2g

將上述試劑溶于800mL滅菌雙蒸水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高壓滅菌30min，4℃保

存?zhèn)溆谩?/p>

A.2焦炭酸二乙酯（DEPC）處理水

于三蒸水按0.1%加入DEPC，磁力攪拌過(guò)夜，1.034×105Pa高壓滅菌20min，冷卻備用。

A.375%乙醇

取無(wú)水乙醇750mL加入滅菌雙蒸水250mL，定容至1000mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.4溴化乙錠（EB）溶液

溴化乙錠20mg

滅菌雙蒸水至20mL

說(shuō)明：也可采用市售商品化的更環(huán)保、更安全的熒光染料，比如Goldviewer等。

A.51×TAE電泳緩沖液

A.5.1配制0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g

氫氧化鈉（10%）調(diào)pH至8.0

滅菌雙蒸水至100mL

A.5.2配制50×TAE電泳緩沖液

三羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）100mL

滅菌雙蒸水至1000mL

用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋50倍使用。

A.5.3配制1×TAE電泳緩沖液

50×TAE電泳緩沖液20mL

滅菌雙蒸水至1000mL

A.61.0%瓊脂糖凝膠

瓊脂糖1.0g

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1×TAE電泳緩沖液至100mL

置微波爐中加熱至完全融化，待冷至50℃～60℃時(shí)，加熒光染料溶液5μL，搖勻后倒入制膠板中，

待完全凝固后取下加樣梳，備用。

A.710×加樣緩沖液

聚蔗糖25g

溴酚藍(lán)0.1g

二甲苯青0.1g

滅菌雙蒸水至100mL

A.8RT-PCR檢測(cè)用引物序列為

BATV-F5’-CTGCAGTTTTMAGATTGTTTC-3’

BATV-R5’-TGTTTTATTTCCTGTAGGTAC-3’

注1：M（A/C）。

注2：此對(duì)引物針對(duì)BATV囊膜蛋白M基因設(shè)計(jì)而成，擴(kuò)增片段約480bp，用無(wú)菌雙