第七章重組DNA藥品一、重組DNA技術(shù)與基因工程基本定義重組DNA技術(shù)是指將一個生物體（供體）基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一個生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們意愿穩(wěn)定遺傳并表示出新產(chǎn)物或新性狀DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。所以，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)三大基本元件。第1頁基因工程是指重組DNA技術(shù)產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包含上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指是基因重組、克隆和表示設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游則包括到基因工程菌或細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物分離純化過程。第2頁優(yōu)點(diǎn)：1、可大量生產(chǎn)過去難以取得生理活性蛋白和多肽；去除內(nèi)源性物質(zhì)不足之處2、提供足夠數(shù)量生理活性物質(zhì)，以進(jìn)行生理生化、結(jié)構(gòu)研究3、利用基因工程技術(shù)可發(fā)覺、挖掘更多內(nèi)源性生理活性物質(zhì)4、取得新型化合物第3頁主要基因工程產(chǎn)品研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品人生長激素釋放抑制素（SRM)人胰島素首次克隆表示時間國家用途首次進(jìn)入市場時間國家/地域1977日本治療巨人癥1978美國治療糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH)1979美國治療侏儒癥1985美國人α干擾素（α－IFN)1980美國治療病毒感染癥1985美國乙肝疫苗1983美國預(yù)防乙型肝炎1986歐洲人白細(xì)胞介素－21984日本治療腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素治療貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子治療中性白細(xì)胞降低癥1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA)治療血栓癥1987美國第4頁DNA重組藥品制造主要步驟取得目標(biāo)基因DNA體外重組（切與連）載體選擇受體細(xì)胞選擇重組DNA分子轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)化子篩選與判定（選）外源基因大規(guī)模表示和分離純化產(chǎn)品檢驗(yàn)和制劑制備第5頁第6頁二、基本過程上游階段：試驗(yàn)室取得目標(biāo)基因、酶切和酶連、插入適當(dāng)載體、轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞、復(fù)制、目標(biāo)基因分析確證、表示、篩選適當(dāng)表示系統(tǒng)等下游階段：將試驗(yàn)室結(jié)果產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵參數(shù)確定、新型生物反應(yīng)器研制、高效分離介質(zhì)及裝置開發(fā)、生物傳感器設(shè)計(jì)制造、電子計(jì)算機(jī)優(yōu)化控制、產(chǎn)品質(zhì)量控制注意：上游DNA重組設(shè)計(jì)必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導(dǎo)思想；而下游過程則是上游基因重組藍(lán)圖表達(dá)和確保，這是基因工程產(chǎn)業(yè)化基本標(biāo)準(zhǔn)。第7頁1、目標(biāo)基因取得1）、鳥槍法（基因文庫）基因組DNA提取→限制性內(nèi)切酶部分水解→與載體連接→轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與篩選2）、逆轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫）

mRNA純化→cDNA第一合成→第二鏈合成→cDNA克隆→將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞→cDNA文庫判定→目標(biāo)cDNA克隆分離和判定3）、合成法4）、PCR法第8頁4、PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

經(jīng)典PCR反應(yīng)包含①模板變性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高溫聚合酶作用下，以DNA單鏈為模板，由引物起始從5′→3′延伸。第9頁(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度鏈不一樣長度鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目標(biāo)片段（不一樣長度鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)第10頁5’3’3’5’靶DNA片段引物A5’5’引物A’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR引物B引物C5’5’3’3’混合,變性,退火5’3’5’3’3’5’3’5’+DNA聚合酶5’3’3’5’5’3’3’5’用引物B和C作PCRPCR定點(diǎn)誘變PCR用于基因突變第11頁第12頁第13頁化學(xué)合成法

在已知DNA序列或多肽普通結(jié)構(gòu)時，如鏈長在60bp～100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA。第14頁第15頁2、基因表示1）、選擇宿主細(xì)胞

原核

大腸桿菌：生長快；遺傳研究深入；產(chǎn)品多為胞內(nèi)（包含體）或周質(zhì)中；不能糖基化修飾。需注意內(nèi)毒素污染。

枯草芽孢桿菌：分泌力強(qiáng)，不形成包含體；不修飾；胞外酶可能會降解產(chǎn)物

鏈霉菌：分泌能力強(qiáng)；不致病，安全；有糖基化能力。第16頁優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短缺點(diǎn)：多為胞內(nèi)表示、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met(AUG)，有內(nèi)毒素毒性第17頁真核酵母：研究基因表示調(diào)控最有效單細(xì)胞真核微生物；基因組小，僅為大腸桿菌4倍；傳代時間短；無毒；有分泌功效和修飾功效；已用于干擾素、乙肝表面抗原等重組DNA藥品生產(chǎn)。絲狀真菌：有很強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌能力，能正確加工，糖基化方式與高等生物相同，有成熟發(fā)酵和后處理工藝哺乳動物細(xì)胞：類似天然產(chǎn)物，但培養(yǎng)條件苛刻第18頁大腸桿菌與真核細(xì)胞表示系統(tǒng)比較大腸桿菌:

發(fā)酵包含體復(fù)性純化目標(biāo)蛋白真核細(xì)胞:發(fā)酵上清液純化目標(biāo)蛋白第19頁大腸桿菌表示重組蛋白易形成包含體

高效表示目標(biāo)蛋白在大腸桿菌內(nèi)形成大量無活性包含體。因無法有效處理復(fù)性問題，在美國每年造成經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)幾十億美元

包含體電鏡圖第20頁蛋白質(zhì)復(fù)性概念將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無活性狀態(tài)，恢復(fù)到有唯一立體結(jié)構(gòu)、有生物活性狀態(tài)過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。第21頁2）、表示載體要求：a、能獨(dú)立復(fù)制b、有靈活多克隆位點(diǎn)和方便篩選標(biāo)識c、含有有效運(yùn)載外源基因能力，能攜帶大小不一樣外源基因d、輕易控制，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，安全可靠。第22頁

如大腸桿菌pBV220系統(tǒng)，為溫度誘導(dǎo)表示載體，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系統(tǒng)，最有潛力系統(tǒng)，可用乳糖代替IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖），產(chǎn)物可達(dá)細(xì)胞總蛋白20~30%，表示量可達(dá)總蛋白50%。第23頁pET載體第24頁

3）、構(gòu)建工程菌目標(biāo)基因與載體DNA連接重組DNA向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移篩選與判定帶有目標(biāo)基因陽性克隆影響目標(biāo)基因表示原因第25頁三、重組藥品分離純化

A重組蛋白分離純化方法選擇基本標(biāo)準(zhǔn)◎針對不用產(chǎn)物表示形式采取不一樣策略◎針對不一樣性質(zhì)重組蛋白選擇不一樣層析類型◎各種分離純化技術(shù)聯(lián)合利用◎適當(dāng)分離純化介質(zhì)選擇◎分離純化過程規(guī)?；?6頁◎針對不一樣產(chǎn)物表示形式采取不一樣策略采取分泌型戰(zhàn)略表示重組蛋白，通常體積大、濃度低，所以應(yīng)在純化之前采取沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理；采取包涵體型戰(zhàn)略表示重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體；采取融合型戰(zhàn)略表示重組蛋白，普通是胞內(nèi)可溶性，擬首先選取親和層析進(jìn)行純化表示在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間間隙中蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度溶菌酶處理，然有再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。第27頁◎針對不一樣性質(zhì)重組蛋白選擇不一樣層析類型

等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（大于8或小于5）重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進(jìn)行分離，這么很輕易除去幾乎全部雜蛋白；重組蛋白特異性配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析純化方法主要條件，標(biāo)準(zhǔn)是它們與目標(biāo)蛋白之間解離常數(shù)應(yīng)在適當(dāng)范圍內(nèi)（10－8～10－4mol/L）;

疏水層析和反相層析是依據(jù)蛋白質(zhì)疏水性差異進(jìn)行分離；

凝膠過濾層析是依據(jù)蛋白分子量和體積差異進(jìn)行分離；

徑向?qū)游鍪墙陙戆l(fā)展起來集層析分離和膜分離于一體一個復(fù)合技術(shù)，在流量、負(fù)荷量等參數(shù)方面顯示出極大優(yōu)越性。第28頁◎各種分離純化技術(shù)聯(lián)合利用在進(jìn)行重組蛋白純化時，通常需要綜合使用各種技術(shù)，普通來說，在選擇分離純化方法時應(yīng)遵照以下標(biāo)準(zhǔn)：＃應(yīng)選擇不一樣分離純化機(jī)理方法聯(lián)合使用＃應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)方法＃應(yīng)盡可能選擇高效分離方法＃應(yīng)將最費(fèi)時、成本最高分離純化方法安排在最終階段第29頁◎適當(dāng)分離純化介質(zhì)選擇慣用蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Sepharose。理想分離純化介質(zhì)應(yīng)含有以下性質(zhì)：＃對目標(biāo)蛋白含有較高分辨效率＃對目標(biāo)蛋白不會造成變性?；瘜W(xué)性能和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好＃價格低廉第30頁◎分離純化過程規(guī)模化蛋白質(zhì)分離純化試驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必適當(dāng)，如：＃試驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁）＃試驗(yàn)室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心）所以，在很多情況下，試驗(yàn)室技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。第31頁四、質(zhì)量控制

1、原材料質(zhì)量控制：2、培養(yǎng)過程質(zhì)量控制3、純化工藝質(zhì)量控制

4、目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量控制

第32頁確保編碼DNA序列正確要了解以下特征：A、目標(biāo)基因起源、克隆過程、序列B、表示載體名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特征及酶切圖譜、抗生素標(biāo)識等C、宿主名稱、起源、傳代歷史、檢定結(jié)果及生物學(xué)特征D、載體引入宿主方式、及載體再宿主中狀態(tài)E、插入基因于表示載體兩側(cè)控制區(qū)核酸序列F、開啟和控制克隆基因表示方法及水平第33頁種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應(yīng)出現(xiàn)無突變或質(zhì)粒丟失現(xiàn)象種子批系統(tǒng)工作細(xì)胞庫第34頁盡可能去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白等雜質(zhì)，并防止在純化過程帶入有害物質(zhì)純化每一步應(yīng)測定純度、計(jì)算提純倍數(shù)、收率等等第35頁1）、產(chǎn)品判別氨基酸組成份析：肽圖分析：N末端和C末端氨基酸測序：蛋白質(zhì)二硫鍵分析：重組蛋白相對分子量：等電點(diǎn)測定：2）、純度分析：SDS,CE,IEF,HPLC3）、生物活性測定4）、殘余雜質(zhì)檢測宿主細(xì)胞蛋白含量、宿主細(xì)胞DNA、殘余抗生素等5）、安全性檢測無菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、免疫原性檢驗(yàn)第36頁A

體內(nèi)生物學(xué)活性測定方法生物學(xué)模型生長激素大鼠腦垂體B體外生物學(xué)活性測定方法如：MTT法:MTTformazan(藍(lán)紫色)干擾素類蛋白：可用細(xì)胞毒抑制試驗(yàn)來測定干擾素體外活性。琥珀酸脫氫酶第37頁五、主要重組DNA藥品（一）利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽代表產(chǎn)品：重組人胰島素、重組人生長激素、重組人干擾素、重組人白細(xì)胞介素、重組人集落刺激因子、重組抗體及其片斷等。

效率高、產(chǎn)量大周期短、成本低工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控

缺點(diǎn)是易形成包含體第38頁1）、干擾素（IFN-α、β、γ）1957年Isaccs等發(fā)覺病毒干擾現(xiàn)象，即病毒感染細(xì)胞能產(chǎn)生一個因子，作用于其它細(xì)胞干擾病毒復(fù)制，因而命名為干擾素。依據(jù)產(chǎn)生干擾素細(xì)胞起源、理化性質(zhì)和生物活性等差異，可分為α、β、γ等3種，其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上亞型。第39頁

1986年，F(xiàn)DA同意Roch企業(yè)重組IFN-α2a和Schering企業(yè)重組IFN-α2b，重組IFN-β、γ分別在1990年和1993年上市。我國中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所侯云德等發(fā)覺中國人受病毒攻擊產(chǎn)生干擾素主要為IFN-α1b型，1992年我國第一個基因工程藥品IFN-α1b取得國家一類新藥證書。第40頁2）胰島素(Insulin,Ins)1921年，BantingFG等從胰臟中分離1955年，SangerF測序1965年，我國完成結(jié)晶牛胰島素全合成1979年，RutterW等克隆了胰島素基因1982年，第一個重組人胰島素同意上市第41頁胰島素結(jié)構(gòu)及生物合成胰島素原與胰島素人胰島素生產(chǎn)方法產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌構(gòu)建策略

第42頁第43頁(a)AB鏈分別表示法

體外折疊成功率低，通常只有10～20％(b)人胰島素原表示法

因?yàn)镃肽存在，胰島素原在復(fù)性條件下能形整天然空間構(gòu)象，為三對二硫鍵正確配對提供了良好條件，使得體外折疊率高達(dá)80％以上當(dāng)前ElyLily用這種工藝路線年產(chǎn)幾十噸重組人胰島素，其經(jīng)濟(jì)效益相當(dāng)可觀。(c)AB鏈同時表示法第44頁第45頁第46頁3）生長激素1944年，李卓浩等從牛垂體中分離出牛生長激素1956年，從人垂體中分離出hGH1969年，hGH序列報(bào)道臨床上用于垂體性侏儒癥。1956~1985年，只能從人尸體垂體中分離純化。但至1985年，共發(fā)覺50多例克-雅氏癥，5人病亡，研究結(jié)果證實(shí)由垂體起源生長激素污染有朊病毒。1985年，垂體起源被禁用，同年，rhGH上市。第47頁1985年，美國FDA同意由大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)重組人生長激素上市，隨即各種路徑生產(chǎn)重組人生長激素快速充滿市場。1997年，僅美國Genentech和ElyLily兩家企業(yè)重組人生長激素年產(chǎn)量已達(dá)20kg，年銷售額超出3.5億美元。人生長激素結(jié)構(gòu)與性質(zhì)重組人生長激素工程菌構(gòu)建第48頁第49頁（二）利用重組酵母生產(chǎn)醫(yī)用蛋白優(yōu)勢：1.最簡單真核生物，基因表示調(diào)控機(jī)理較清楚，而且遺傳操作相對較為簡單；2.含有原核無法比擬真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)3.不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌在食品工業(yè)當(dāng)中有著幾百年應(yīng)用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)；4.大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，成本低廉5.能將外源基因表示產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中劣勢：即使擁有完整蛋白質(zhì)糖基化修飾系統(tǒng)，但其修飾方式不用于高等真核生物。舉例：重組乙肝疫苗重組人血清白蛋白第50頁重組HAS制備人血清白蛋白HAS是血漿中主要成份載體蛋白。成熟人血清白蛋白為一非糖基化單一多肽鏈，由585個氨基酸組成，含有17對二硫鍵，由此維系空間構(gòu)象是血清白蛋白生物功效所必需。巴斯德畢赤酵母是迄今為止最為優(yōu)良重組人血清白蛋白表示分泌系統(tǒng)。產(chǎn)率可高達(dá)15g/L

第51頁（三）利用轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞生產(chǎn)生物大分子1.利用動物乳腺組織生產(chǎn)蛋白藥品酪蛋白、tPA、IL－22.利用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)復(fù)雜人體蛋白比如EPO第52頁促紅細(xì)胞生成素（EPO）由腎臟分泌一個唾液酸蛋白，它能促進(jìn)