ICS65.020.30

CCSB44

22

吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB22/T3678—2024

普通級實(shí)驗(yàn)用貓金黃色葡萄球菌檢測PCR

法

DetectionofconventionalexperimentalcatStaphylococcusaureusPCRmethod

2024-12-31發(fā)布2025-02-10實(shí)施

吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布

DB22/T3678—2024

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)

定起草。

請注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由吉林省科學(xué)技術(shù)廳提出并歸口。

本文件由吉林省科學(xué)技術(shù)廳組織實(shí)施。

本文件標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林大學(xué)。

本文件標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：高飛、袁寶、任文陟、劉殿峰、張嘉保、高巍、陳健、胡進(jìn)平、權(quán)福實(shí)。

I

DB22/T3678—2024

普通級實(shí)驗(yàn)用貓金黃色葡萄球菌檢測PCR法

1范圍

本文件描述了普通級實(shí)驗(yàn)用貓金黃色葡萄球菌的PCR檢測方法，給出了試驗(yàn)原理、材料、樣品、試

驗(yàn)步驟和結(jié)果判定。

本文件適用于普通級實(shí)驗(yàn)用貓金黃色葡萄球菌檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過凝膠電泳檢測，判定檢測結(jié)

果。

5儀器設(shè)備

儀器設(shè)備包括但不限于：

a)高速離心機(jī)，離心速度：1000r/min～20000r/min；

a)PCR擴(kuò)增儀；

b)電泳儀；

c)凝膠成像系統(tǒng)；

d)恒溫培養(yǎng)箱，溫度：36℃±1℃；

e)微量移液器（量程：5μL～50μL，50μL～200μL，100μL～1000μL）；

f)均質(zhì)器。

6材料

材料包括但不限于：

a)陽性對照品：金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25923）；

1

DB22/T3678—2024

b)陰性對照品：無菌水；

c)7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯，配制方法按A.1配制；

d)1.5%瓊脂糖凝膠，配制方法按A.2配制；

e)DNA染料；

f)1%溴酚藍(lán)，配制方法按A.3配制；

g)50×TAE電泳緩沖液，配制方法按A.4配制；

h)無RNase去離子水，配制方法按A.5配制；

i)DNA標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物：100bp～2000bp；

j)70%乙醇溶液（用無RNase去離子水配制）；

k)核苷酸混合物（dNTPs）。

7樣品

采集

7.1.1死亡貓

7.1.1.1無菌采集胃、腸道等典型病灶組織或內(nèi)容物。

7.1.1.2用滅菌接種環(huán)挑取適量7.1.1.1樣品，加入4mL7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯，均質(zhì)后置于

（36℃±1℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h～24h，取上清液，注明編號后備用。

7.1.2活體貓

7.1.2.1采集中段糞便，干糞便加入7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯均質(zhì)后進(jìn)行接種，稀便直接接種培養(yǎng)。置于

培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18h～24h，取上清液，注明編號后備用。

7.1.2.2無菌采集分泌物或濃汁接種在7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯中，置于培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)18h～

24h，取上清液，注明編號后備用。

存放

采集或處理的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；如需長期保存，應(yīng)放置在-80℃

冰箱中。

運(yùn)輸

按照NY/T541的規(guī)定操作。

8試驗(yàn)步驟

DNA的提取

采用商品化DNA提取試劑盒，按說明書方法進(jìn)行操作；或采用等效方法提取。

PCR擴(kuò)增目的片段

8.2.1反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表1。上游引物為5’-GCTTGCTATGATTGTGGTAGCC-3’，下游引物為5’-

CTCTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3’，產(chǎn)物DNA片段長度為423bp，產(chǎn)物基因序列應(yīng)符合B.1。

2

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表1PCR反應(yīng)體系

試劑用量/μL

10×Buffer2.5

dNTP（2.5μmol/L）0.7

上游引物（20μmol/L）0.25

下游引物（20μmol/L）0.25

DNA模板（20ng/μL～50ng/μl）2.0

TaqE（5U/μL）0.7

ddH2O（去離子水）18.6

總體積25

8.2.2PCR反應(yīng)參數(shù)

PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。

表2PCR反應(yīng)參數(shù)

序號步驟溫度/℃時(shí)間循環(huán)數(shù)

1預(yù)變性955min1

2變性9540s

35

3退火6030s

4延伸7260s

5再延伸728min1

注：可使用其他等效PCR檢測試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相應(yīng)調(diào)整。

8.2.3質(zhì)量控制

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陽性對照；用不含有金黃色葡萄球菌的其他細(xì)菌DNA作為陰

性對照；用無菌水代替DNA模板作為空白對照。

8.2.4電泳檢測

配制含DNA染料的1.5%瓊脂糖凝膠，取7μL～15μL混有溴酚藍(lán)的PCR產(chǎn)物加入到凝膠孔中，

與適合的DNA標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物做對比；電壓60V～100V進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下緣1cm

處時(shí)，停止電泳。將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。

結(jié)果判定

8.3.1陰性對照和空白對照未出現(xiàn)目的條帶，陽性對照出現(xiàn)423bp特異性目的條帶，試驗(yàn)成立；否

則重新檢驗(yàn)。

8.3.2檢測樣品未觀察到423bp處有擴(kuò)增條帶，樣品檢測結(jié)果為陰性；檢測樣品觀察到423bp處

有擴(kuò)增條帶，樣品檢測結(jié)果為陽性，應(yīng)符合圖B.2。

3

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

溶液的配制

A.17.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯

稱取蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化鈉75g，放入燒杯中，用1L雙蒸水加熱攪拌充分溶解，

調(diào)整pH7.4±0.2；121℃高壓滅菌15min，密封冷卻備用。

A.2含DNA染料的1.5%瓊脂糖凝膠

稱取1.5g瓊脂糖放入燒杯中，加入100mL1×TAE電泳緩沖液，混合后加熱至完全融化，放在

室溫冷卻至50℃～55℃時(shí)，向其中加入DNA染料，輕輕晃動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，將電泳梳子置入

制膠板中，然后將瓊脂糖溶液倒入制膠板，凝膠適宜厚度為3mm～5mm，需確認(rèn)在梳齒下或梳齒間沒

有氣泡，待凝固后取下梳子備用。

A.31%溴酚藍(lán)

稱取1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)放入燒杯中，再向燒杯中加入100mL雙蒸水，攪拌或渦旋混合直到

完全溶解。

A.450×TAE電泳緩沖液

稱取242g羥基甲基氨基甲烷（Tris）和37.2gEDTANa2·2H2O放入1L燒杯中，再向燒杯中

加入800mL雙蒸水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍患尤?7.1mL冰醋酸；用NaOH調(diào)至pH8.3，加雙蒸水定容

至1L，室溫保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r(shí)用雙蒸水稀釋至1×使用。

A.5無RNase去離子水

去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

4

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

標(biāo)準(zhǔn)對照圖和參考基因序列

B.1參考基因序列

A

GCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAATTTATGAATCATAC