2025年P(guān)CR上崗證考試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（共20題，每題2分，共40分）1.以下關(guān)于PCR技術(shù)基本原理的描述，錯(cuò)誤的是：A.通過高溫變性使雙鏈DNA解旋為單鏈B.引物與模板的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則C.TaqDNA聚合酶在72℃時(shí)活性最高D.延伸階段的主要作用是完成引物的退火答案：D（延伸階段是在DNA聚合酶作用下合成新鏈，退火階段完成引物結(jié)合）2.實(shí)時(shí)熒光PCR中，SYBRGreenI染料的作用機(jī)制是：A.特異性結(jié)合雙鏈DNA的小溝區(qū)域B.與引物5’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)發(fā)生FRETC.僅在PCR延伸階段釋放熒光D.與目標(biāo)序列的特定區(qū)域共價(jià)結(jié)合答案：A（SYBRGreenI非特異性插入雙鏈DNA小溝，發(fā)出熒光）3.進(jìn)行RNA病毒的PCR檢測(cè)時(shí)，關(guān)鍵的預(yù)處理步驟是：A.加入EDTA抑制DNA酶活性B.使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNAC.提高變性溫度至98℃破壞病毒衣殼D.用RNaseA消化樣本中的雜RNA答案：B（RNA需先通過逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增）4.引物設(shè)計(jì)時(shí)，若目標(biāo)序列GC含量為65%，推薦的引物Tm值范圍應(yīng)為：A.5055℃B.5560℃C.6065℃D.6570℃答案：C（GC含量高時(shí)，引物Tm值需相應(yīng)提高以保證特異性，通常6065℃較適宜）5.實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，若陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，最可能的原因是：A.樣本核酸提取效率過低B.擴(kuò)增儀溫度校準(zhǔn)偏差C.氣溶膠污染D.引物與內(nèi)參基因發(fā)生交叉反應(yīng)答案：C（陰性對(duì)照擴(kuò)增提示外來核酸污染，氣溶膠是常見污染源）6.數(shù)字PCR（dPCR）與實(shí)時(shí)熒光PCR（qPCR）的主要區(qū)別在于：A.dPCR不需要引物設(shè)計(jì)B.dPCR通過終點(diǎn)熒光強(qiáng)度定量C.qPCR采用絕對(duì)定量方法D.qPCR對(duì)儀器溫度精度要求更低答案：B（dPCR通過統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性微滴比例實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，qPCR通過Ct值相對(duì)定量）7.以下哪種物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重抑制TaqDNA聚合酶活性？A.0.5%TritonX100B.10mMMg2+C.50mMKClD.血液中的血紅蛋白答案：D（血紅蛋白含金屬離子螯合物，可強(qiáng)烈抑制Taq酶活性）8.進(jìn)行多重PCR時(shí)，關(guān)鍵的優(yōu)化措施是：A.增加引物濃度至1μM以上B.統(tǒng)一所有引物的Tm值（±2℃）C.延長(zhǎng)變性時(shí)間至2分鐘D.使用高濃度的dNTP（>500μM）答案：B（多重PCR需引物Tm值接近，避免擴(kuò)增效率差異過大）9.核酸提取過程中，苯酚氯仿抽提的主要目的是：A.裂解細(xì)胞釋放核酸B.沉淀RNA選擇性去除DNAC.去除蛋白質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)D.濃縮核酸提高濃度答案：C（苯酚氯仿可有效分離蛋白質(zhì)與核酸，通過離心形成有機(jī)相界面水相三層）10.以下關(guān)于PCR擴(kuò)增儀溫度均勻性的要求，正確的是：A.各孔間溫度差異應(yīng)≤±0.5℃B.僅需保證95℃變性溫度的準(zhǔn)確性C.4℃保溫時(shí)溫度偏差不影響結(jié)果D.溫度均勻性對(duì)終點(diǎn)PCR無影響答案：A（溫度均勻性直接影響擴(kuò)增效率，ISO標(biāo)準(zhǔn)要求各孔間差異≤±0.5℃）11.檢測(cè)人乳頭瘤病毒（HPV）的分型PCR中，常用的靶基因是：A.16SrRNA基因B.L1衣殼蛋白基因C.逆轉(zhuǎn)錄酶基因D.核衣殼蛋白基因答案：B（HPVL1基因保守且具有型特異性，是分型檢測(cè)的常用靶標(biāo)）12.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性條帶？A.模板DNA濃度過低B.退火溫度過高C.引物濃度過高D.dNTP濃度低于50μM答案：C（引物濃度過高易引發(fā)引物二聚體或非特異性結(jié)合）13.實(shí)時(shí)熒光PCR的Ct值與初始模板量的關(guān)系是：A.Ct值越大，初始模板量越多B.Ct值與初始模板量呈指數(shù)正相關(guān)C.Ct值與初始模板量的對(duì)數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)D.Ct值與初始模板量無直接關(guān)聯(lián)答案：C（Ct值=log(初始模板量)×(k)+b，k為擴(kuò)增效率相關(guān)常數(shù)）14.實(shí)驗(yàn)室開展PCR檢測(cè)前，需進(jìn)行的方法學(xué)驗(yàn)證不包括：A.精密度（重復(fù)性、再現(xiàn)性）B.分析靈敏度（最低檢測(cè)限）C.儀器外觀清潔度D.分析特異性（交叉反應(yīng)）答案：C（方法學(xué)驗(yàn)證需涵蓋性能指標(biāo)，儀器清潔度屬于日常維護(hù)范疇）15.以下關(guān)于內(nèi)參基因的描述，錯(cuò)誤的是：A.用于監(jiān)測(cè)樣本核酸提取效率B.應(yīng)選擇在樣本中穩(wěn)定表達(dá)的基因C.內(nèi)參擴(kuò)增失敗提示樣本可能被抑制D.內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率需顯著低于目標(biāo)基因答案：D（內(nèi)參基因與目標(biāo)基因擴(kuò)增效率應(yīng)接近，否則無法準(zhǔn)確校正）16.進(jìn)行病原體定量檢測(cè)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的制備要求不包括：A.與待測(cè)樣本具有相同的核酸類型（DNA/RNA）B.經(jīng)過準(zhǔn)確濃度標(biāo)定（如數(shù)字PCR定量）C.含有目標(biāo)基因以外的無關(guān)序列D.穩(wěn)定性驗(yàn)證（長(zhǎng)期保存后濃度變化≤10%）答案：C（標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)僅含目標(biāo)序列或與目標(biāo)序列一致的片段，避免無關(guān)序列干擾）17.以下哪種PCR污染消除方法不適用于實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面？A.10%次氯酸鈉溶液擦拭B.紫外線照射（254nm）30分鐘C.75%乙醇噴灑D.DNA酶（DNaseI）處理答案：D（DNaseI需在特定緩沖液中作用，且處理后需徹底清除酶，不適合臺(tái)面常規(guī)消毒）18.提取全血樣本DNA時(shí)，常用的抗凝劑是：A.肝素鈉（heparin）B.乙二胺四乙酸（EDTA）C.枸櫞酸鈉（sodiumcitrate）D.草酸鉀（potassiumoxalate）答案：B（肝素會(huì)抑制Taq酶活性，EDTA通過螯合Mg2+抗凝且不影響后續(xù)PCR）19.數(shù)字PCR中，微滴生成的關(guān)鍵參數(shù)是：A.微滴體積的均一性B.擴(kuò)增儀的升降溫速率C.熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)D.引物的GC含量答案：A（微滴體積差異過大會(huì)影響定量準(zhǔn)確性，需控制CV<5%）20.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)的要求，錯(cuò)誤的是：A.試劑準(zhǔn)備區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)嚴(yán)格物理隔離B.各區(qū)空氣流向應(yīng)為試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)C.樣本處理區(qū)可兼作擴(kuò)增區(qū)使用D.各區(qū)應(yīng)配備專用儀器和消耗品答案：C（樣本處理區(qū)（含核酸提?。┡c擴(kuò)增區(qū)需嚴(yán)格分區(qū)，避免擴(kuò)增產(chǎn)物污染前區(qū)）二、多項(xiàng)選擇題（共10題，每題3分，共30分，多選、少選、錯(cuò)選均不得分）1.PCR反應(yīng)體系的基本組成包括：A.模板核酸B.熱穩(wěn)定DNA聚合酶C.dNTP混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）D.緩沖液（含Mg2+）答案：ABCD（所有選項(xiàng)均為PCR反應(yīng)必需成分）2.可能導(dǎo)致實(shí)時(shí)熒光PCR無Ct值的原因有：A.探針?biāo)饷福ㄈ鏣aq酶）活性喪失B.模板核酸降解（如RNA樣本未加RNase抑制劑）C.熒光采集通道設(shè)置錯(cuò)誤（如使用FAM通道檢測(cè)HEX標(biāo)記探針）D.擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不足（<35個(gè)循環(huán)）答案：ABC（循環(huán)數(shù)不足可能導(dǎo)致Ct值延遲，但一般3540循環(huán)可檢測(cè)到；ABC均會(huì)導(dǎo)致完全無信號(hào)）3.實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR質(zhì)量控制時(shí)，需包含的對(duì)照有：A.陽(yáng)性對(duì)照（已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品）B.陰性對(duì)照（無核酸模板的反應(yīng)體系）C.內(nèi)參對(duì)照（樣本內(nèi)源性穩(wěn)定基因）D.抑制對(duì)照（加入已知量標(biāo)準(zhǔn)品的樣本核酸）答案：ABCD（四者分別監(jiān)測(cè)擴(kuò)增有效性、污染、提取效率和抑制物存在）4.引物設(shè)計(jì)的基本原則包括：A.避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）B.引物3’端避免連續(xù)3個(gè)G/C堿基C.引物長(zhǎng)度推薦1825個(gè)核苷酸D.引物與非目標(biāo)序列的同源性應(yīng)>70%答案：ABC（引物需與非目標(biāo)序列同源性低，避免交叉反應(yīng)，D錯(cuò)誤）5.以下屬于PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全范疇的措施有：A.樣本處理時(shí)佩戴N95口罩和雙層手套B.陽(yáng)性樣本離心時(shí)使用帶蓋離心管C.廢棄的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)高壓蒸汽滅菌后處理D.實(shí)驗(yàn)人員定期進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)答案：ABCD（均為生物安全基本要求）6.實(shí)時(shí)熒光PCR中，常見的熒光標(biāo)記技術(shù)包括：A.TaqMan探針（水解探針）B.分子信標(biāo)（MolecularBeacon）C.蝎形引物（ScorpionPrimer）D.SYBRGreenI染料答案：ABCD（均為常用熒光標(biāo)記方法）7.核酸提取過程中，可能導(dǎo)致產(chǎn)量降低的因素有：A.樣本量超過提取試劑的處理能力B.裂解時(shí)間不足（如組織樣本未充分勻漿）C.洗滌步驟中乙醇?xì)埩粑磸氐兹コ鼶.洗脫緩沖液pH偏離7.08.5（DNA）或7.58.5（RNA）答案：ABCD（均會(huì)影響核酸結(jié)合或洗脫效率）8.以下關(guān)于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)的描述，正確的是：A.瓊脂糖濃度需根據(jù)目標(biāo)片段大小選擇（如100bp片段用2%瓊脂糖）B.上樣時(shí)需加入DNA上樣緩沖液（含溴酚藍(lán)和甘油）C.電泳電壓應(yīng)控制在510V/cm凝膠長(zhǎng)度D.紫外透射儀觀察時(shí)需佩戴防紫外線護(hù)目鏡答案：ABCD（均為電泳操作規(guī)范）9.實(shí)驗(yàn)室發(fā)生PCR污染事件時(shí)，應(yīng)采取的措施包括：A.立即停止實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記污染區(qū)域B.用10%次氯酸鈉擦拭臺(tái)面和儀器表面C.更換所有實(shí)驗(yàn)服、手套等個(gè)人防護(hù)裝備D.對(duì)污染原因進(jìn)行溯源（如檢查移液器、離心管密封性）答案：ABCD（均為污染處理的關(guān)鍵步驟）10.以下關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）的描述，正確的是：A.逆轉(zhuǎn)錄酶需要Mg2+作為輔助因子B.隨機(jī)引物可用于擴(kuò)增所有RNA（包括mRNA、rRNA、tRNA）C.特異性引物逆轉(zhuǎn)錄可提高目標(biāo)cDNA的純度D.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度通常為3750℃（取決于酶的熱穩(wěn)定性）答案：ABCD（均符合RTPCR基本原理）三、判斷題（共10題，每題1分，共10分，正確打“√”，錯(cuò)誤打“×”）1.PCR反應(yīng)中，dNTP濃度過高會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤摻入率增加。（√）2.實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增效率（E）應(yīng)控制在90%110%之間（通過標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算）。（√）3.為提高靈敏度，PCR反應(yīng)中模板添加量越多越好。（×）（模板過多會(huì)引入抑制物，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增）4.紫外線（UV）可有效破壞DNA/RNA的嘧啶二聚體，因此PCR實(shí)驗(yàn)室需定期用UV照射臺(tái)面和空氣。（√）5.進(jìn)行RNA檢測(cè)時(shí)，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面需用RNaseZAP等試劑處理以滅活RNA酶。（√）6.多重PCR中，目標(biāo)片段長(zhǎng)度差異應(yīng)≥50bp，以便電泳區(qū)分。（√）7.TaqDNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，因此有校正功能。（×）（Taq酶無3’→5’外切酶活性，Pfu酶有校正功能）8.數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。（√）9.核酸提取時(shí)，70%乙醇洗滌的目的是去除鹽離子和小分子雜質(zhì)。（√）10.PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)的工作服可通用，只需每次實(shí)驗(yàn)后清洗。（×）（各區(qū)需配備專用工作服，避免交叉污染）四、簡(jiǎn)答題（共3題，每題5分，共15分）1.簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光PCR中“Ct值”的定義及其臨床意義。答案：Ct值（CycleThreshold）指熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。臨床意義：①Ct值與初始模板量的對(duì)數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)，可用于定量分析；②Ct值越小，樣本中目標(biāo)核酸含量越高；③通過設(shè)定陽(yáng)性判斷閾值（如Ct≤35），可區(qū)分陽(yáng)性與陰性結(jié)果；④監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率（標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率反映E=10^(1/斜率)1）。2.列舉PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)需避免的常見錯(cuò)誤，并說明原因。答案：①引物二聚體：引物3’端互補(bǔ)導(dǎo)致自身配對(duì)，消耗反應(yīng)體系成分，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；②發(fā)夾結(jié)構(gòu)：引物內(nèi)部互補(bǔ)形成莖環(huán)，影響與模板結(jié)合效率；③3’端為A/T堿基：連續(xù)G/C可能導(dǎo)致錯(cuò)配（G/C配對(duì)穩(wěn)定性高），而3’端為A/T可降低非特異性；④引物與非目標(biāo)序列同源性過高：可能擴(kuò)增出無關(guān)基因，導(dǎo)致假陽(yáng)性；⑤Tm值差異過大（>5℃）：影響引物退火效率，導(dǎo)致擴(kuò)增不平衡（多重PCR中尤為重要）。3.簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)室“四區(qū)兩緩”的功能分區(qū)及氣流方向要求。答案：“四區(qū)”指試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)（含核酸提?。?、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)；“兩緩”指各區(qū)之間的緩沖間（如試劑準(zhǔn)備區(qū)與樣本處理區(qū)之間的緩沖間）。氣流方向：需嚴(yán)格遵循從清潔區(qū)到污染區(qū)，即試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)，各區(qū)保持微負(fù)壓（產(chǎn)物分析區(qū)負(fù)壓最大），避免擴(kuò)增產(chǎn)物逆向擴(kuò)散污染前區(qū)。五、案例分析題（共1題，15分）某臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室開展新型冠狀病毒（SARSCoV2）核酸檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)以下情況：當(dāng)天檢測(cè)的50份樣本中，有8份樣本的ORF1ab基因Ct值為3840，N基因無Ct值；陽(yáng)性對(duì)照（1000拷貝/μL）Ct值為22（預(yù)期20±1）；陰性對(duì)照無Ct值；內(nèi)參基因（人RP基因）均正常擴(kuò)增（Ct值2528）。請(qǐng)分析可能的原因，并提出改進(jìn)措施。答案：可能原因分析：（1）樣本中病毒