2025年上學(xué)期高三生物單克隆抗體制備流程圖分析試題一、流程圖核心步驟解析（一）免疫動物與B淋巴細(xì)胞獲取單克隆抗體制備的起始階段需對實驗動物進(jìn)行特異性免疫。以抗細(xì)菌X單克隆抗體制備為例，需多次向小鼠腹腔注射純化的細(xì)菌X抗原，每次免疫間隔2-3周以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。末次免疫后第3天，從脾臟中分離得到已免疫的B淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞具有合成并分泌針對細(xì)菌X的特異性抗體的能力，但在體外培養(yǎng)條件下僅能存活10-14天，無法持續(xù)增殖。（二）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選選擇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞作為融合伴侶，其特性為：①在體外培養(yǎng)時可無限增殖；②缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT?），無法在HAT選擇培養(yǎng)基中存活。培養(yǎng)過程中需維持37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱環(huán)境，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，確保細(xì)胞密度處于對數(shù)生長期（1×10?-1×10?個/mL）。（三）細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建融合誘導(dǎo)：采用50%聚乙二醇（PEG4000）作為融合劑，按1:1比例混合B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（總數(shù)約1×10?個），在37℃水浴中處理90秒后，緩慢加入預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。融合過程利用了細(xì)胞膜的流動性原理，可能形成的細(xì)胞類型包括：未融合的B淋巴細(xì)胞、未融合的骨髓瘤細(xì)胞、B-B融合細(xì)胞、骨髓瘤-骨髓瘤融合細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤融合細(xì)胞（即雜交瘤細(xì)胞）。HAT選擇培養(yǎng)：融合后的細(xì)胞懸液接種于96孔板，加入HAT選擇培養(yǎng)基（含次黃嘌呤H、氨基蝶呤A、胸腺嘧啶核苷T）。其中氨基蝶呤會阻斷細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的從頭合成途徑，HGPRT?的骨髓瘤細(xì)胞因無法利用補(bǔ)救途徑合成核苷酸而死亡；B淋巴細(xì)胞雖有HGPRT，但因不能無限增殖而逐漸凋亡；只有雜交瘤細(xì)胞可借助B淋巴細(xì)胞提供的HGPRT，通過補(bǔ)救途徑合成核苷酸并持續(xù)增殖。培養(yǎng)第7-10天可見克隆形成，此時需更換為HT培養(yǎng)基（去除氨基蝶呤）。（四）兩次篩選與克隆化培養(yǎng)第一次篩選（選擇性培養(yǎng)）：通過HAT培養(yǎng)基完成，目的是獲得雜交瘤細(xì)胞，排除未融合細(xì)胞及同種融合細(xì)胞。此階段約有10??-10??的融合效率，需每日觀察克隆生長情況，標(biāo)記有單個克隆的孔位。第二次篩選（抗體檢測）：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測陽性克隆。以細(xì)菌X抗原包被96孔板，加入待檢測的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，通過底物顯色反應(yīng)判斷是否產(chǎn)生特異性抗體。陽性孔細(xì)胞需進(jìn)行3-5次有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，確保最終獲得的單克隆細(xì)胞株遺傳背景均一。例如，某次實驗中對83個雜交瘤克隆進(jìn)行檢測，僅12個呈陽性反應(yīng)，陽性率約14.5%。（五）單克隆抗體的大規(guī)模制備體外培養(yǎng)法：將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，擴(kuò)大培養(yǎng)至1×10?個細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器，在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，通過ProteinA/G親和層析柱純化上清液中的抗體，純度可達(dá)95%以上，產(chǎn)量約5-10mg/L。體內(nèi)誘生法：向Balb/c小鼠腹腔注射降植烷預(yù)處理，7天后接種1×10?個雜交瘤細(xì)胞，10-14天形成腹水，收集腹水后離心取上清，抗體濃度可達(dá)5-20mg/mL，該方法成本較低但可能引入小鼠內(nèi)源蛋白雜質(zhì)。二、典型試題分析與錯誤案例（一）流程圖識圖題例題：下圖為單克隆抗體制備流程圖，回答下列問題：（1）圖中①過程所用的抗原是______，②過程常用的誘導(dǎo)劑是______。（2）③過程使用的選擇培養(yǎng)基是______，④過程的目的是______。常見錯誤：將①過程抗原答為“抗體”，混淆免疫原與免疫產(chǎn)物；②過程誘導(dǎo)劑誤答為“滅活病毒”（雖為動物細(xì)胞融合方法之一，但PEG更常用）；③過程培養(yǎng)基答為“HT培養(yǎng)基”，忽略初次篩選需用HAT；④過程目的僅答“篩選雜交瘤細(xì)胞”，未明確是“能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞”。正確答案：（1）特定抗原（如細(xì)菌X）；聚乙二醇（PEG）（2）HAT培養(yǎng)基；篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞（二）實驗分析題例題：某同學(xué)在制備抗胰島素單克隆抗體時，發(fā)現(xiàn)所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液均無抗體產(chǎn)生，可能的原因有哪些？（至少答出三點）錯誤分析：僅考慮技術(shù)操作層面，如“融合失敗”“HAT培養(yǎng)基配制錯誤”；忽略生物學(xué)因素，如“免疫劑量不足導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞未活化”“骨髓瘤細(xì)胞污染支原體”。參考答案：免疫小鼠時抗原劑量或免疫次數(shù)不足，未有效激活B淋巴細(xì)胞；融合時PEG濃度過高（如超過60%）導(dǎo)致細(xì)胞毒性過大；HAT培養(yǎng)基中氨基蝶呤濃度不足，未能抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖；骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，丟失HGPRT缺陷型特性；篩選時ELISA檢測體系中包被抗原濃度過低，無法捕獲低親和力抗體。（三）原理應(yīng)用題例題：雙特異性抗體（能同時識別兩種抗原）可通過雙雜交瘤技術(shù)制備，即讓兩種分泌不同單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞再次融合。請設(shè)計實驗篩選能產(chǎn)生雙特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。解題思路：選擇分別針對抗原A和抗原B的兩種雜交瘤細(xì)胞（A?B?和A?B?）；誘導(dǎo)融合后，使用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基篩選（利用親本雜交瘤細(xì)胞的嘌呤類似物抗性）；采用雙抗原夾心ELISA檢測：包被抗原A和抗原B，僅能同時結(jié)合兩種抗原的上清液為陽性；陽性克隆經(jīng)克隆化后，通過Westernblot驗證抗體分子量（應(yīng)為兩種親本抗體的總和）。三、技術(shù)拓展與應(yīng)用實例（一）單克隆抗體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用診斷試劑：如早孕試紙利用抗人絨毛膜促性腺激素（HCG）單克隆抗體檢測尿液中的HCG，靈敏度達(dá)10mIU/mL；新冠病毒抗原檢測試劑盒采用雙抗體夾心法，其中捕獲抗體和檢測抗體均為抗S蛋白單克隆抗體。靶向治療：利妥昔單抗（抗CD20）用于治療B細(xì)胞淋巴瘤，通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）特異性殺傷腫瘤細(xì)胞；曲妥珠單抗（抗HER2）可阻斷乳腺癌細(xì)胞的生長信號通路，聯(lián)合化療使患者5年生存率提高20%。（二）流程圖變異類型人源化單克隆抗體制備：通過基因工程技術(shù)將鼠源抗體的恒定區(qū)替換為人源序列，降低免疫原性。例如，將雜交瘤細(xì)胞的抗體基因克隆后，與人類IgG1恒定區(qū)基因重組，轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞表達(dá)。噬菌體展示技術(shù)：無需細(xì)胞融合，直接將抗體基因片段插入噬菌體外殼蛋白基因，通過抗原親和篩選獲得特異性抗體基因，該方法篩選效率比傳統(tǒng)方法高10-100倍。四、高頻考點歸納核心步驟考查角度易錯點免疫階段抗原選擇、免疫途徑混淆初次免疫與再次免疫的時間間隔細(xì)胞融合融合原理、誘導(dǎo)方法比較誤認(rèn)為滅活病毒僅用于動物細(xì)胞融合篩選過程HAT培養(yǎng)基作用機(jī)制、ELISA原理漏答克隆化培養(yǎng)的必要性抗體特性特異性強(qiáng)的原因、與多克隆抗體區(qū)別認(rèn)為單克隆抗體可直接殺滅病原體通過對單克隆抗體制備流程圖的系統(tǒng)分析，不僅需要掌握“免疫-融合-篩選-制備”的基本流程，更要理解各步驟的生物學(xué)原理及實驗操作細(xì)節(jié)。