DB22T16192011牛尿中鹽酸克倫特羅殘留量的測(cè)定液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛尿中鹽酸克倫特羅殘留量的液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛尿中鹽酸克倫特羅殘留量的測(cè)定。本方法的檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。2原理試樣中的鹽酸克倫特羅用β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶水解，經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，MCX固相萃取柱凈化，液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜法測(cè)定，外標(biāo)法定量。3試劑和材料除非另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1甲醇：色譜純。3.2乙腈：色譜純。3.3乙酸乙酯。3.4正己烷。3.5甲酸：色譜純。3.6氨水。3.7β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶：含β葡萄糖醛酸酶≥100000U/mL，芳基硫酸酯酶≥1000U/mL。3.8鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98.5%。3.9鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，18℃避光保存，有效期6個(gè)月。3.10鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成1.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存，有效期1個(gè)月。3.110.1%甲酸水溶液：取1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。3.125%氨水甲醇溶液：取5.0mL氨水，用甲醇定容至100mL。3.13MCX固相萃取柱：60mg，3mL，或相當(dāng)者。3.140.22μm有機(jī)濾膜。4儀器和設(shè)備4.1液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配電噴霧離子源（ESI）。4.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。4.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。4.4渦旋混合器。4.5氮吹儀。4.6恒溫水浴鍋。4.7固相萃取裝置。4.8pH計(jì)：精度±0.02。4.9超聲波清洗器。4.10離心管：50mL，具塞。4.11容量瓶：10mL、25mL、50mL、100mL。4.12移液器：10μL、100μL、1000μL、5000μL。5試樣制備與保存5.1試樣采集采集牛尿樣品于潔凈容器中，每份樣品不少于50mL。5.2試樣保存5.3試樣處理5.3.1取解凍后的牛尿樣品5.0mL于50mL離心管中，加入0.2mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH5.2）2.0mL，渦旋混勻。5.3.2加入β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶50μL，渦旋混勻，于37℃水浴中水解16h。5.3.3水解完成后，加入乙酸乙酯10mL，渦旋提取3min，以4000r/min離心5min。5.3.4將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相。5.3.5向合并的有機(jī)相中加入正己烷5mL，渦旋混勻，以4000r/min離心5min，棄去上層正己烷層。5.3.6將下層乙酸乙酯相于40℃水浴中氮吹至近干，加入3mL0.1%甲酸水溶液溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，待凈化。5.3.7將MCX固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，將待凈化溶液上柱，控制流速不超過(guò)1mL/min。5.3.8依次用3mL水、3mL甲醇淋洗，抽干。用5mL5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液。5.3.9將洗脫液于40℃水浴中氮吹至干，用1.0mL甲醇水（10+90，v/v）溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜測(cè)定。6測(cè)定步驟6.1.1色譜柱：C18柱，150mm×2.1mm，3.5μm，或相當(dāng)者。6.1.2流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。6.1.3梯度洗脫程序：0min時(shí)A為90%，B為10%；5min時(shí)A為10%，B為90%；7min時(shí)A為10%，B為90%；7.1min時(shí)A為90%，B為10%；10min時(shí)A為90%，B為10%。6.1.4流速：0.3mL/min。6.1.5柱溫：30℃。6.1.6進(jìn)樣量：10μL。6.2.1離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式。6.2.2檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。6.2.3噴霧電壓：5500V。6.2.4霧化氣壓力：50psi。6.2.5干燥氣溫度：550℃。6.2.6干燥氣流速：10L/min。6.2.7鹽酸克倫特羅的監(jiān)測(cè)離子對(duì)：m/z277→203（定量離子），m/z277→259（定性離子）。6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備吸取適量鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇水（10+90，v/v）稀釋成0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按6.1和6.2的條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.4樣品測(cè)定取待測(cè)樣品溶液，按6.1和6.2的條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中鹽酸克倫特羅的含量。7結(jié)果計(jì)算試樣中鹽酸克倫特羅的含量按式（1）計(jì)算：X=(c×V)/m式中：X——試樣中鹽酸克倫特羅的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣液中鹽酸克倫特羅的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。8精密度和準(zhǔn)確度8.1精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果