(2025年)(完整版)高效液相試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.高效液相色譜（HPLC）中，以下哪種因素對反相色譜保留影響最小？A.流動相pH值B.固定相碳載量C.柱溫D.檢測器波長2.某色譜柱的理論塔板數(shù)（N）為20000，柱長為150mm，則其理論塔板高度（H）約為：A.0.0075mmB.0.075mmC.0.75mmD.7.5mm3.梯度洗脫時(shí)，若初始流動相為20%乙腈（水相），最終為80%乙腈，總時(shí)間30min，線性梯度下第10min時(shí)流動相中乙腈比例為：A.30%B.40%C.50%D.60%4.以下檢測器中，不屬于質(zhì)量型檢測器的是：A.蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）B.示差折光檢測器（RID）C.火焰離子化檢測器（FID，需接口）D.電噴霧離子化質(zhì)譜檢測器（ESI-MS）5.分析強(qiáng)極性小分子化合物（如氨基酸）時(shí)，優(yōu)先選擇的色譜模式是：A.反相色譜（RPC）B.正相色譜（NPC）C.親水作用色譜（HILIC）D.離子交換色譜（IEC）6.色譜峰出現(xiàn)前延（前沿峰）的主要原因可能是：A.柱超載B.流動相pH與樣品pKa不匹配（酸性樣品在低pH流動相）C.色譜柱污染（柱頭塌陷）D.進(jìn)樣量過大7.以下關(guān)于HPLC泵的描述，錯誤的是：A.串聯(lián)式雙柱塞泵的流量精度高于并聯(lián)式B.泵的壓力波動會影響保留時(shí)間重復(fù)性C.梯度洗脫時(shí)需使用等度泵D.泵的最大工作壓力與色譜柱填料粒徑相關(guān)8.某樣品在C18色譜柱上的保留時(shí)間（tR）為12min，死時(shí)間（t0）為2min，則其容量因子（k）為：A.4B.5C.6D.79.為提高分離度（R），以下操作最有效的是：A.增加柱長（L）B.降低流動相流速（u）C.優(yōu)化流動相組成（調(diào)整k）D.提高柱溫（T）10.以下哪種固定相適用于分離手性化合物？A.氰基鍵合相（CN）B.環(huán)糊精鍵合相C.苯基鍵合相（Ph）D.二醇基鍵合相（Diol）11.流動相過濾的主要目的是：A.去除溶解氧B.防止色譜柱堵塞C.調(diào)節(jié)pH值D.提高檢測器靈敏度12.梯度洗脫與等度洗脫相比，優(yōu)勢不包括：A.縮短復(fù)雜樣品分析時(shí)間B.改善強(qiáng)保留組分峰形C.提高弱保留組分分離度D.減少流動相消耗13.蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的響應(yīng)與樣品的：A.紫外吸收特性相關(guān)B.分子量大小相關(guān)C.揮發(fā)性相關(guān)D.電導(dǎo)率相關(guān)14.色譜柱使用后需用甲醇-水（90:10）沖洗，主要目的是：A.去除強(qiáng)保留雜質(zhì)B.平衡固定相C.防止微生物生長D.降低柱壓15.以下哪種情況會導(dǎo)致基線漂移？A.流動相脫氣不徹底B.柱溫箱溫度波動C.進(jìn)樣量過大D.色譜柱柱效下降二、填空題（每空1分，共20分）1.高效液相色譜的核心分離部件是______，其性能主要由______、______和______決定。2.范第姆特方程（H=A+B/u+Cu）中，A項(xiàng)代表______，B項(xiàng)代表______，C項(xiàng)代表______。3.反相色譜中，常用的強(qiáng)洗脫溶劑是______和______，弱洗脫溶劑是______。4.離子對色譜中，常用的離子對試劑對酸性樣品為______（如______），對堿性樣品為______（如______）。5.色譜峰的保留時(shí)間主要由______和______的相互作用決定，峰寬主要由______和______決定。6.檢測器的靈敏度通常用______表示，線性范圍指______與______的比值。三、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述反相色譜中流動相pH對酸性化合物保留的影響（以苯甲酸為例，pKa=4.2）。2.比較C18色譜柱與C8色譜柱的適用場景，并說明原因。3.梯度洗脫方法開發(fā)時(shí)，如何確定初始流動相比例和梯度斜率？4.色譜柱柱壓升高的可能原因及解決方法。5.紫外檢測器（UV）與二極管陣列檢測器（DAD）的主要區(qū)別及各自優(yōu)勢。四、綜合分析題（共20分）某實(shí)驗(yàn)室需建立一種HPLC方法檢測人血漿中的某藥物（弱堿性，pKa=7.8，分子量320，紫外吸收峰254nm），要求分離其主要代謝物（極性比原藥大，紫外吸收相近）。已知：-可用色譜柱：C18（5μm，4.6×250mm）、HILIC（3μm，2.1×100mm）、C8（3.5μm，4.6×150mm）；-檢測器：UV、ELSD、ESI-MS；-流動相可選：水（含0.1%甲酸）、乙腈、甲醇、磷酸鹽緩沖液（pH=3.0、7.0）。請回答以下問題：（1）選擇最合適的色譜柱，并說明理由；（2）選擇檢測器類型，說明原因；（3）設(shè)計(jì)流動相組成（是否梯度、pH范圍、有機(jī)相類型），并解釋依據(jù)；（4）列出需優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)（至少3項(xiàng)），并說明優(yōu)化目標(biāo)。參考答案一、單項(xiàng)選擇題1.D（檢測器波長影響檢測靈敏度，不直接影響保留）2.A（H=L/N=150mm/20000=0.0075mm）3.B（(80%-20%)/30min×10min+20%=40%）4.B（RID為濃度型檢測器）5.C（HILIC適用于強(qiáng)極性化合物）6.B（酸性樣品在低pH流動相中呈分子態(tài)，與固定相作用強(qiáng)，若固定相吸附位點(diǎn)不足會導(dǎo)致前延）7.C（梯度洗脫需二元或多元泵）8.B（k=(tR-t0)/t0=(12-2)/2=5）9.C（分離度公式R=√N(yùn)/4×(α-1)/α×k/(1+k)，優(yōu)化k（調(diào)整流動相）比增加柱長或降低流速更高效）10.B（環(huán)糊精鍵合相具有手性空腔）11.B（過濾去除顆粒雜質(zhì)，防止柱堵塞）12.D（梯度洗脫流動相消耗更多）13.B（ELSD響應(yīng)與樣品質(zhì)量相關(guān)，分子量影響散射強(qiáng)度）14.A（甲醇-水（90:10）可洗脫強(qiáng)疏水雜質(zhì)）15.B（柱溫波動導(dǎo)致流動相粘度和保留變化，基線漂移）二、填空題1.色譜柱；固定相類型；粒徑；鍵合相覆蓋率2.渦流擴(kuò)散項(xiàng)；分子擴(kuò)散項(xiàng)；傳質(zhì)阻力項(xiàng)3.乙腈；甲醇；水（或緩沖鹽溶液）4.季銨鹽類；四丁基溴化銨；烷基磺酸鹽類；十二烷基磺酸鈉5.樣品；固定相；柱效；流動相流速6.檢測限（或靈敏度系數(shù)）；最大響應(yīng)濃度；最小檢測濃度三、簡答題1.苯甲酸在反相色譜中，流動相pH影響其解離狀態(tài)：-當(dāng)pH<<pKa（如pH=2），苯甲酸主要以分子態(tài)存在，疏水性強(qiáng)，與C18固定相作用強(qiáng)，保留時(shí)間長；-當(dāng)pH≈pKa（如pH=4），分子態(tài)與離子態(tài)共存，保留時(shí)間中等；-當(dāng)pH>>pKa（如pH=6），苯甲酸主要以離子態(tài)（苯甲酸鹽）存在，疏水性弱，保留時(shí)間短。因此，降低流動相pH可增加酸性化合物保留，提高pH則減少保留。2.C18與C8色譜柱的區(qū)別及適用場景：-C18固定相碳鏈更長（18個(gè)碳），碳載量更高，疏水性更強(qiáng)，適用于中等極性至強(qiáng)極性化合物（如大分子、疏水性藥物）；-C8固定相碳鏈較短（8個(gè)碳），疏水性較弱，適用于強(qiáng)極性或分子量較小的化合物（如極性代謝物、小分子酸/堿），避免過度保留導(dǎo)致峰展寬或洗脫時(shí)間過長。3.梯度洗脫初始比例和斜率的確定方法：-初始比例：通過等度預(yù)實(shí)驗(yàn)（如10%、50%、90%有機(jī)相）確定樣品保留范圍，初始有機(jī)相比例應(yīng)使最早出峰組分k>2（避免死體積干擾），最晚出峰組分k<20（避免過度保留）；-梯度斜率：斜率=（最終有機(jī)相%-初始有機(jī)相%）/梯度時(shí)間，斜率越小（梯度越平緩），分離度越高但時(shí)間越長；斜率越大（梯度越陡），分析時(shí)間越短但可能丟失分離度。通常先嘗試較陡梯度（如1%/min）確定洗脫窗口，再優(yōu)化為平緩梯度（如0.5%/min）提高分離。4.柱壓升高的可能原因及解決：-原因1：流動相未過濾，顆粒堵塞柱頭；解決：過濾流動相（0.22μm濾膜），更換保護(hù)柱。-原因2：緩沖鹽結(jié)晶（如磷酸鹽在高有機(jī)相比例下析出）；解決：梯度結(jié)束后用高水相沖洗（如90%水），避免直接切換高有機(jī)相。-原因3：生物樣品中的蛋白質(zhì)吸附（如未除蛋白）；解決：樣品前處理（沉淀蛋白、固相萃?。褂媚蜕镂廴旧V柱（如親水封端C18）。-原因4：色譜柱填料塌陷（長期高壓或pH超出范圍）；解決：更換色譜柱，避免在極端pH（<2或>8）下使用。5.UV與DAD的區(qū)別及優(yōu)勢：-區(qū)別：UV檢測器僅檢測單一波長（或幾個(gè)固定波長）；DAD可同時(shí)采集全波長（190-800nm）吸收光譜。-優(yōu)勢：UV檢測器結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度高（適合已知波長的常規(guī)分析）；DAD可提供光譜信息（用于峰純度判斷、未知物定性），并能選擇最佳檢測波長（提高靈敏度）。四、綜合分析題（1）色譜柱選擇：C18（5μm，4.6×250mm）。理由：藥物為弱堿性，反相色譜（C18）可通過調(diào)節(jié)流動相pH使其呈分子態(tài)（pH=3.0時(shí)，pKa=7.8，藥物主要以分子態(tài)存在），與C18固定相作用保留；代謝物極性更大，在C18上保留弱于原藥，可實(shí)現(xiàn)分離。HILIC適用于強(qiáng)極性化合物（代謝物雖極性大但原藥可能保留過強(qiáng)），C8疏水性較弱可能導(dǎo)致原藥保留不足（需更長柱或更高有機(jī)相，影響分離）。（2）檢測器選擇：UV（254nm）。原因：藥物和代謝物均有紫外吸收（254nm），UV檢測器靈敏度高、操作簡單，適合血漿樣品中痕量藥物檢測；ELSD響應(yīng)與質(zhì)量相關(guān)但靈敏度低于UV；ESI-MS雖靈敏但需復(fù)雜前處理（脫鹽），血漿基質(zhì)干擾大，UV更經(jīng)濟(jì)高效。（3）流動相設(shè)計(jì)：-梯度洗脫：因樣品含原藥（弱保留？不，原藥弱堿性，pH=3.0時(shí)分子態(tài)，疏水性強(qiáng)）和代謝物（極性大，疏水性弱），梯度可縮短分析時(shí)間并改善峰形；-pH=3.0（磷酸鹽緩沖液）：藥物pKa=7.8，pH=3.0時(shí)主要以分子態(tài)存在（減少離子化，增強(qiáng)與C18作用），同時(shí)避免堿性條件下C18固定相水解（pH>8易損壞硅膠基質(zhì)）；-有機(jī)相：乙腈（相比甲醇，洗脫強(qiáng)度更高、粘度更低，降低柱壓）。示例流動相：A相（0.1%甲酸水，pH=3.0），B相（乙腈）；梯度：0-5min10%B→5-20min30%B→20-25min90%B（具體需預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整）。（4）