ICS65.020.30

CCSB41

4106

鶴壁市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB4106/T90—2022

種雞場禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范

2022-09-26發(fā)布2022-10-16實(shí)施

鶴壁市市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB4106/T90—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由鶴壁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。

本文件起草單位：鶴壁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心、淇縣動(dòng)物防疫檢疫中心、淇縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)

中心、淇縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)、鶴壁市農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測中心。

本文件主要起草人：郭瑞英、王瑞平、張燕芳、路緒玲、張梅山、高娟玉、孫文波、王永鵬、程寶

娟、高強(qiáng)、來淑云、周云飛。

I

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種雞場禽白血病凈化技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了種雞場禽白血病凈化檢測、凈化周期與終止、凈化狀態(tài)維持等技術(shù)要求。

本文件適用于原種雞群（核心群）各生長階段的凈化檢測技術(shù)，其他類型雞群可參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T26436禽白血病診斷技術(shù)

NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

種雞breedingchicken

經(jīng)過不斷選種、選育，按育種組織制訂的文件鑒定承認(rèn)的雞品種。根據(jù)其經(jīng)濟(jì)用途，分為蛋雞系和

肉雞系。

禽白血病avianleukosis,AL

由禽白血病病毒(ALV)引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的禽類多種腫瘤性疾病的總稱。特點(diǎn)是呈漸

進(jìn)性發(fā)生和持續(xù)性死亡。禽白血病病毒感染雞群后，導(dǎo)致雞群生產(chǎn)性能下降，免疫失敗，死淘率增加，

尤其是產(chǎn)蛋率和蛋的品質(zhì)下降，雞苗的品質(zhì)下降等。ALV既可通過種蛋垂直感染，也可以水平傳播，因

此該病一直是種雞和蛋雞生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的疫病。

禽白血病病毒avianleukosisvirus,ALV

歸屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科反轉(zhuǎn)錄病毒屬。病毒粒子為一直徑為80nm～120nm，平均是90nm的球狀物，

其外周是囊膜糖蛋白，其中g(shù)p85基因是囊膜蛋白表面的主要成分，主要決定了病毒亞群的特性，內(nèi)部病

毒子核心有一主要的群特異性抗原p27蛋白，其為核衣殼蛋白，主要用于群特異性抗原的檢測。

動(dòng)物疫病凈化animaldiseaseeradication

在特定區(qū)域或場所對某種或某些重要?jiǎng)游镆卟∮杏?jì)劃的通過監(jiān)測、檢驗(yàn)檢疫、隔離、撲殺、生物安

全等一系列綜合措施，最終達(dá)到在該范圍內(nèi)動(dòng)物個(gè)體不發(fā)病和無感染狀態(tài)的根除消滅疫病病原的過程，

目的是消滅或清除傳染源，從而達(dá)到并維持動(dòng)物個(gè)體和群體健康。這個(gè)特定區(qū)域或場所是人為確定的一

個(gè)固定范圍，可以是一個(gè)養(yǎng)殖場、一個(gè)自然區(qū)域、一個(gè)行政區(qū)，也可以是一個(gè)國家。本文件所指凈化主

要指在種雞群中（通常為一個(gè)種雞場），通過雛雞胎糞檢測、不同日齡雞血液病毒分離、公雞精液中病

毒分離等方法，發(fā)現(xiàn)并淘汰雞群中感染禽白血病的雞只，最終達(dá)到雞群消除該病的過程。

1

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4凈化檢測程序

出殼雛雞胎糞檢測與淘汰

4.1.1將種蛋置于出殼紙袋（紙盒）中隔離孵化，每只種雞所產(chǎn)種蛋單獨(dú)使用一個(gè)出殼紙袋（紙盒），

以免出雛時(shí)發(fā)生橫向傳播。

4.1.2出殼后將雛雞胎糞擠壓于滅菌的2mL離心管中，離心管中預(yù)先加入0.6mL樣品稀釋液（商品

化試劑盒中專用稀釋液），充分震蕩混勻。對每只雛雞采集完胎糞后，要更換一次性手套或?qū)﹄p手酒精

消毒，然后再采集下一只雛雞的胎糞。

4.1.3將雛雞胎糞樣品置入液氮中快速冷凍后取出，放入25℃～37℃水浴中融化，反復(fù)凍融三次，

離心，取上清液用于檢測胎糞中禽白血病病毒p27抗原。

4.1.4禽白血病病毒p27抗原檢測，按照NY/T680的規(guī)定或采用等效的商品化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

（ELISA）試劑盒進(jìn)行，也可采用針對禽白血病病毒p27抗原的單克隆抗體建立的膠體金試紙條等快速

檢測方法。

4.1.5同一只母雞所產(chǎn)的雛雞中，若有一只雛雞胎糞檢測為禽白血病病毒p27抗原陽性，則該紙袋（紙

盒）中所有雛雞視為陽性，相應(yīng)雛雞及其對應(yīng)母雞應(yīng)全部淘汰。

4.1.6陰性雞作為育種選留進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，來源于同一母雞的陰性雛雞放于同一籠中。在育雛期間每

個(gè)籠具之間應(yīng)采取阻隔措施以避免水平傳播。為避免籠間直接接觸和直接氣流的對流，可在每個(gè)籠具之

間用紙板阻隔，在不影響通風(fēng)的情況下紙板高度應(yīng)盡量高。

開產(chǎn)初期的檢測與淘汰

4.2.1每只母雞取開產(chǎn)后的初產(chǎn)蛋2枚～3枚采集蛋清，蛋清反復(fù)凍融三次，按照4.1.4規(guī)定的方法

逐個(gè)檢測禽白血病病毒p27抗原。也可無菌采集母雞抗凝血，按照GB/T26436的規(guī)定接種DF-1細(xì)胞進(jìn)

行病毒分離，培養(yǎng)7d～9d后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照4.1.4規(guī)定的方法檢測禽白血病病毒p27抗原。

4.2.2公雞分別采集抗凝血和精液同時(shí)接種DF-1細(xì)胞，按照4.2.1規(guī)定的方法進(jìn)行禽白血病病毒分離

鑒定。精液病毒分離檢測可按附錄A的規(guī)定進(jìn)行，也可無菌采集血清、精液或肛拭子進(jìn)行PCR-HRM檢測。

4.2.3檢測為陽性的雞應(yīng)淘汰，不再作為育種選育個(gè)體。對檢測為陰性的選留后備種雞，繼續(xù)維持小

群隔離飼養(yǎng)。

留種前的檢測與淘汰

4.3.1取每只母雞所產(chǎn)種蛋2枚～3枚采集蛋清，按4.2.1的規(guī)定進(jìn)行檢測。

4.3.2公雞按4.2.2的規(guī)定進(jìn)行檢測。

4.3.3檢測為陽性的雞應(yīng)淘汰，不再作為育種選育個(gè)體。對檢測為陰性的選留后備種雞，繼續(xù)維持小

群隔離飼養(yǎng)。

種蛋的選留和孵化

按照本文件4.1～4.3的要求淘汰所有陽性雞后，每只母雞僅選用1只檢測為陰性公雞的精液進(jìn)行人

工授精。按育種規(guī)定時(shí)間留足種蛋，每只母雞的種蛋均標(biāo)號(hào)。將每只母雞的種蛋置于寫有該母雞標(biāo)號(hào)的

專用孵化紙袋（紙盒）中，防止不同母雞的種蛋直接接觸，置于出雛箱中出雛。

不同世代的持續(xù)檢測

經(jīng)檢測合格的種蛋孵出的雛雞作為凈化后第二世代雞，按照本文件4.1～4.4的要求實(shí)施第二世代的

檢測和凈化。后續(xù)世代按此程序繼續(xù)循環(huán)進(jìn)行，直至評(píng)估《動(dòng)物疫病凈化示范場評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（2021

版）的要求。

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5凈化周期與終止

凈化周期確定

凈化可根據(jù)種雞所處育種時(shí)期，對照本文件4.1～4.4的任何一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)啟動(dòng)凈化程序。不同種雞

場可根據(jù)其技術(shù)條件分別選擇本文件4.1～4.4的任何一時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測，但按照本文件4.1～4.4從出

殼開始至留種過程中所有時(shí)間節(jié)點(diǎn)全部進(jìn)行檢測是實(shí)現(xiàn)凈化的最短周期。

凈化效果評(píng)估

凈化效果評(píng)估應(yīng)按照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)行政主管部門制定的禽白血病凈化評(píng)估程序和《動(dòng)物疫病凈化示

范場評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（2021版）的要求進(jìn)行。

達(dá)到凈化雞群的檢測比例調(diào)整

對按照本文件5.2的要求進(jìn)行評(píng)估，達(dá)到凈化要求的原種場可不再按照本文件4.1～4.4的要求進(jìn)行

普遍性檢測，可按照本文件5.2的要求或不低于10%的比例進(jìn)行抽樣監(jiān)測。檢測結(jié)果不符合《動(dòng)物疫病凈

化示范場評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（2021版）的要求，則按照本文件4.1～4.4的要求重新進(jìn)入檢測凈化程序。

6已凈化雞群的凈化狀態(tài)維持措施

種源的選擇

對飼養(yǎng)進(jìn)口祖代及其以下代次的雞場，應(yīng)從無外源性禽白血病病毒感染的育種公司購入雞苗。應(yīng)要

求供應(yīng)商提供初產(chǎn)種蛋100枚～200枚，檢測蛋清中p27抗原為陰性。同時(shí)，要求供應(yīng)商提供相關(guān)種雞群

在23周齡后的禽白血病病毒血清抗體檢測報(bào)告和留種孵化前所產(chǎn)種蛋的蛋清p27抗原檢測報(bào)告。

禽白血病凈化維持監(jiān)測

種雞群在飼養(yǎng)過程中應(yīng)進(jìn)行禽白血病定期監(jiān)測，以了解雞群禽白血病病毒的感染狀態(tài)?？稍诜N雞群

開產(chǎn)后、留種蛋前，采集500份左右血清樣品，用ELISA方法檢測禽白血病病毒A/B亞群及J亞群抗體。同

時(shí)，采集種蛋用ELISA方法檢測蛋清中的禽白血病p27抗原。如果血清抗體陽性率或蛋清p27抗原陽性率

超過1%時(shí)，應(yīng)對雞群采集抗凝血接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離鑒定或采集血清或肛拭子進(jìn)行PCR-HRM檢測。

種雞場生物安全措施

6.3.1種雞場應(yīng)執(zhí)行全進(jìn)全出制度。飼養(yǎng)已經(jīng)凈化的品系時(shí)，應(yīng)避免不同來源的種雞在同一雞場飼養(yǎng)

而發(fā)生交叉感染。一個(gè)雞場在同一時(shí)期只能飼養(yǎng)同一批來源的種雞。不同來源的種蛋在孵化和出雛之時(shí)

應(yīng)分開，避免與其他雞群（特別是非凈化雞群）同時(shí)孵化和出殼，以減少禽白血病水平傳播風(fēng)險(xiǎn)。

6.3.2種雞場地理位置應(yīng)相對隔離，遠(yuǎn)離其他雞場。運(yùn)送物品車輛以及人員出入，均應(yīng)消毒，同時(shí)應(yīng)

盡可能降低種雞場所需物品與外界的交流。接觸核心群的工作人員應(yīng)固定化，避免其他雞群的飼養(yǎng)員進(jìn)

入實(shí)施凈化的雞群中工作。種雞場應(yīng)在雞舍安裝防鳥網(wǎng)或其他防鳥設(shè)施，并定期檢查維護(hù)。

疫苗的管理和使用

凈化雞群使用的針對各種雞病的弱毒疫苗，應(yīng)是經(jīng)過《中國獸藥典》規(guī)定程序檢測合格的疫苗，確

保無外源性禽白血病毒污染。用雞胚或雞胚來源的細(xì)胞作為原材料生產(chǎn)的疫苗，以及對1日齡雛雞通過

注射法（包括皮膚刺種）使用的疫苗，使用前應(yīng)進(jìn)行檢測。雞用弱毒活疫苗中禽白血病病毒污染檢測按

附錄B的規(guī)定進(jìn)行。

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A

A

附錄A

（資料性）

ALV的分離和分離培養(yǎng)物的檢測

A.1分離病毒用細(xì)胞

在分離外源性ALV時(shí)，考慮到E亞型的內(nèi)源ALV的干擾，應(yīng)選用C/E細(xì)胞對內(nèi)源性ALV-E有抵抗力的細(xì)

胞，如0系SPF的雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或來自0系雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的傳代細(xì)胞系DF-1細(xì)胞。

A.2樣品采集和處理

A.2.1血漿

p27抗原檢測陽性率降低到1%以下時(shí)，選取400只～600只雞的小群，全群無菌采集抗凝血（用肝素

鈉做抗凝劑），1500rpm離心15min后，取上清液接種于DF-1細(xì)胞。

A.2.2精液

使用75%乙醇將泄殖腔周圍擦拭干凈，將公雞精液采集到1.5mL已滅菌的離心管中，一只公雞的精

液對應(yīng)一個(gè)離心管，編號(hào)后放入冰盒中暫存。采集的精液，用含有青鏈霉素（青霉素100U/mL，鏈霉素

0.1mg/mL）的細(xì)胞維持液，按照最終稀釋度為1∶28～1∶56充分混勻后接種DF-1細(xì)胞。

A.2.3疑似ALV污染的活疫苗檢測

馬立克氏病細(xì)胞結(jié)合疫苗從液氮中取出后，在含有疫苗的細(xì)胞懸液中加入9倍～10倍的滅菌注射用

水，將細(xì)胞懸液移至小試管混勻，4℃放置10min，讓細(xì)胞在低滲下裂解死亡后接種于DF-1細(xì)胞。

A.3病毒接種細(xì)胞的方法

A.3.1在37℃水浴中提前預(yù)熱消化液（0.25%胰酶）和DMEM（high-glucose）。

A.3.2棄去細(xì)胞瓶中長滿的細(xì)胞培養(yǎng)液上清。

A.3.3加入PBS清洗兩遍后，25cm2的培養(yǎng)瓶中加入5ml胰酶。在加入胰酶2min后消化完全，再加入

10mL的含有10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。

A.3.41200rpm離心5min后棄去上清，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞濃度達(dá)到1×104～2×104個(gè)細(xì)胞。

A.3.5將細(xì)胞懸液加入到24孔板中，每孔0.5mL，培養(yǎng)24h～36h，待細(xì)胞長滿。

A.3.6每孔加入分離好的50μL血漿樣品以及陰陽性對照。

A.3.7在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%的CO2中培養(yǎng)細(xì)胞24h。

A.3.824h后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有2%FBS的DMEM的細(xì)胞維持液，培養(yǎng)7d～9d。

A.3.97d～9d后將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，最后一次凍融后，收集每一個(gè)樣品培養(yǎng)物。

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

PCR-HRM檢測ALV-J

B.1引物序列

B.1.1上游引物：CAGGAAACGTGTGGGTCACC。

B.1.2下游引物：TTATTGGACTTACCATCG。

B.2實(shí)驗(yàn)步驟

B.2.1從樣品中提取病毒RNA。

B.2.1.1樣品中加入TRIZOL后反復(fù)吹打幾次，使樣品充分裂解。室溫放置5min。

B.2.1.2向以上溶液中加入氯仿，每使用1mL的TRIZOL加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，

室溫放置2min～3min。

B.2.1.34℃條件下，12000rpm離心15min，此時(shí)樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無色

水相，RNA主要在水相中，把600μL水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的RNase-Free離心管