ICS65.020.20

CCSB16

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T3380—2024

馬鈴薯鐮刀屬真菌病害檢測技術(shù)規(guī)程

TechnicalcodefordetectionofFusariumfungidiseaseinpotato

2024-03-15發(fā)布2024-04-15實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T3380—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC40）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏蘭察布市農(nóng)林科學(xué)研究所、內(nèi)

蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、喀喇沁旗農(nóng)牧局、武川縣農(nóng)牧技術(shù)推廣中心。

本文件主要起草人：趙遠(yuǎn)征、徐利敏、王東、周洪友、邱廷艷、張曉明、王真、王玉鳳、賈瑞芳、

謝銳、邱鑫澤、牟英男、陳文晉、肖皓文、張宇。

I

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馬鈴薯鐮刀屬真菌病害檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了馬鈴薯鐮刀屬真菌病害檢測的原理、儀器設(shè)備和用具、形態(tài)檢驗(yàn)、致病性測定、PCR

檢驗(yàn)、樣品復(fù)檢等技術(shù)要求和方法。

本文件適用于馬鈴薯鐮刀屬真菌病害的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

SN/T2729馬鈴薯炭疽病菌檢疫鑒定方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

鐮刀屬真菌(Fusariumspp.)是一種重要的植物病原菌，屬無性真菌類，有性時(shí)期為子囊菌門。鐮

刀屬真菌主要危害馬鈴薯植株和塊莖。本標(biāo)準(zhǔn)以病原菌在植株和塊莖上的危害癥狀，菌落、孢子等形態(tài)

學(xué)特征，回接致病性測定及PCR反應(yīng)結(jié)果為鑒定依據(jù)，將上述各項(xiàng)措施綜合形成一套檢測技術(shù)體系。

5儀器設(shè)備和用具

儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、顯微鏡、高壓滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、PCR儀、離心機(jī)、凝膠電泳儀、漩渦震蕩儀、水

浴鍋、凝膠成像系統(tǒng)、分析天平。

檢測工具

接種針、手術(shù)刀、鑷子、挑針、載玻片、蓋玻片、滴管、離心管、培養(yǎng)皿、三角瓶、酒精燈。

6形態(tài)檢驗(yàn)

調(diào)查取樣

選取田間萎蔫、干枯發(fā)病植株，觀察根部腐爛情況，檢查是否褐變或出現(xiàn)白色菌絲體；剖開根莖處

維管束觀察是否出現(xiàn)黃化或褐變；田間或窖藏觀察馬鈴薯塊莖病變情況，在塊莖臍部下方2cm左右處橫

1

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切，或切取表皮凹陷病斑處進(jìn)行觀察，觀察是否出現(xiàn)維管束褐變，塊莖中空或腐爛并伴隨白色菌絲層。

將具有典型特征的病株、病薯取樣。

病原菌分離培養(yǎng)和純化

將病樣表面清洗晾干，選擇病斑附近的病健交界處，切取0.3cm×0.3cm×0.1cm大小的薄片，75%

酒精消毒30s，用無菌濾紙吸干，在0.1%次氯酸鈉浸泡2min，再用無菌水沖洗3次。待組織干燥后置于

PDA培養(yǎng)基上，在25℃恒溫下光照、黑暗交替各12h培養(yǎng)5d。待組織長出菌絲后，挑取菌絲體轉(zhuǎn)移到

新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。待菌落長至培養(yǎng)皿2/3時(shí)，采用平板稀釋法進(jìn)行單孢分離，并獲得純培養(yǎng)。

病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的菌落拍照并觀察其形態(tài)，典型菌落氣生菌絲多呈絮狀或氈狀，白色、紫色、

淡粉色或黃白色。利用挑針挑取少量菌組織，載玻片上以水浮載制成玻片，顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，小

型分生孢子呈卵圓形或橢圓形，單孢，大小2μm～4μm×4μm～8μm；大型分生孢子略彎曲，鐮刀形或

月牙形，2～5個(gè)分隔，多為3個(gè)分隔，大小3μm～8μm×11μm～70μm；厚垣孢子球形，表面不光滑，

單生或串生。

7致病性測定

將純培養(yǎng)物配制成孢子懸浮液，傷口接種法進(jìn)行馬鈴薯植株和薯塊回接，接種28d后觀察馬鈴薯的

發(fā)病情況。如出現(xiàn)與病樣一致的癥狀則判定病原菌能夠引起該病害發(fā)生。

8PCR檢驗(yàn)

DNA提取

按照SN/T2729，采用CTAB法提取菌株基因組DNA。

對(duì)照設(shè)置

以馬鈴薯枯萎病病原菌DNA作為陽性對(duì)照，以不添加DNA模板反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照。

PCR擴(kuò)增

以菌株DNA為模板，利用鐮刀菌屬真菌的特異性引物EF-1H：（5?-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3?），EF-

2T：（5?-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3?）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中模板DNA1μ

L，上下游引物各1μL，2×EasyTaqPCRSuperMix12.5μL,ddH2O9.5μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃

預(yù)變性5min；95℃30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸5min。

結(jié)果判定

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增出長度介于700bp～750bp之間的清晰單一條帶，與陽性

對(duì)照一致。

9樣品復(fù)檢

2

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樣品檢測不成功需要復(fù)檢，病樣置于冰箱-20℃冷凍以備樣品檢測不成功進(jìn)行復(fù)檢，工作完成后集

中滅活處理。

3

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)配方、DNA提取方法及發(fā)病癥狀

A.1培養(yǎng)基配方

WA培養(yǎng)基：瓊脂15g，蒸餾水定容至1000mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1000mL。

A.2CTAB法

CTAB法如下所示：

a)將植物組織置于2mL離心管，加入2顆滅菌鋼珠，液氮冷凍，球磨儀研碎；

b)加入800μLCTAB提取緩沖液，65℃水浴1h，期間每隔15min顛倒混勻若干次；

c)加入800μL苯酚：氯仿：異丙醇（25:24:1），上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，將

上層水相轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管；

d)加入等體積氯仿：異丙醇（24:1），上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新

的1.5mL離心管；

e)加入0.6倍體積異丙醇，-20℃沉淀30min以上；

f)12000rpm離心10min，棄去上清，加入75%乙醇洗滌兩次；

g)真空干燥儀干燥40min左右，加水溶解DNA。

A.3病害癥狀

植株癥狀：苗期主要導(dǎo)致馬鈴薯根部腐爛，根部褐變，植株萎蔫，嚴(yán)重時(shí)根部出現(xiàn)白色菌絲層；

開花期前后主要導(dǎo)致植株萎蔫、枯萎，植株維管束出現(xiàn)褐變。

塊莖癥狀：病斑多發(fā)生于薯塊臍部。發(fā)病初期塊莖表面出現(xiàn)淺褐色病斑，病斑緩慢擴(kuò)展，隨后擴(kuò)大

形成較多輪紋狀褶皺、凹陷；后期塊莖內(nèi)部變空，干燥時(shí)內(nèi)部長滿白色菌絲，整個(gè)薯塊變硬、變輕、干

縮，易碎呈灰褐色或深棕色病變。

4

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B

B

附錄B

（資料性）

鐮刀屬真菌形態(tài)

B.1鐮刀屬真菌孢子形態(tài)圖見圖B.1。

圖B.1鐮刀屬真菌孢子形態(tài)圖

B.2鐮刀屬真菌菌落形態(tài)圖見圖B.2。