DB13T10802009乳及乳制品中β內(nèi)酰胺酶的測定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳及乳制品中β內(nèi)酰胺酶的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮乳、滅菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、乳粉、煉乳、奶油、干酪等乳及乳制品中β內(nèi)酰胺酶的測定。2原理β內(nèi)酰胺酶能夠水解β內(nèi)酰胺類抗生素的β內(nèi)酰胺環(huán)，使其失去抗菌活性。本方法基于β內(nèi)酰胺酶對頭孢硝噻吩的顯色反應(yīng)原理，利用頭孢硝噻吩作為底物，在β內(nèi)酰胺酶的作用下水解產(chǎn)生有色化合物，通過分光光度法測定其吸光度值，從而計算出樣品中β內(nèi)酰胺酶的活性。3試劑和材料除非另有說明，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級水。3.1頭孢硝噻吩（Nitrocefin）：純度≥90%。3.2磷酸二氫鉀（KH?PO?）。3.3磷酸氫二鈉（Na?HPO?·12H?O）。3.4二甲基亞砜（DMSO）。3.5磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：稱取磷酸二氫鉀0.68g，磷酸氫二鈉1.42g，溶于900mL水中，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1000mL。3.6頭孢硝噻吩溶液（0.5mg/mL）：準(zhǔn)確稱取5mg頭孢硝噻吩，用10mL二甲基亞砜溶解，臨用現(xiàn)配。3.7β內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥1000U/mg。3.8β內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000U/mL）：準(zhǔn)確稱取10mgβ內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至10mL，4℃保存，有效期1個月。3.9β內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)工作液：用磷酸鹽緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成10U/mL、20U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，臨用現(xiàn)配。4儀器和設(shè)備4.1分光光度計：波長范圍340800nm，配備1cm比色皿。4.2恒溫水浴鍋：控溫精度±0.5℃。4.3電子天平：感量0.0001g。4.4均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速800015000r/min。4.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。4.6渦旋混合器。4.7微量移液器：10100μL、1001000μL。4.8pH計：精度±0.01。4.9超聲波清洗器。4.10恒溫培養(yǎng)箱：控溫精度±1℃。5試樣的制備與保存5.1液體乳制品（生鮮乳、滅菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳等）：取代表性樣品約50mL，充分混勻后備用。如需保存，應(yīng)置于4℃冷藏條件下，不超過24h。5.2乳粉：取代表性樣品約10g，加入90mL40℃溫水，充分溶解后冷卻至室溫，定容至100mL，混勻備用。5.3煉乳：取代表性樣品約10g，加入90mL水，充分混勻后備用。5.4奶油：取代表性樣品約10g，置于40℃水浴中加熱融化，混勻后冷卻至室溫備用。5.5干酪：取代表性樣品約10g，切碎后加入90mL磷酸鹽緩沖液，用均質(zhì)器以10000r/min均質(zhì)2min，混勻備用。5.6所有試樣在測定前應(yīng)恢復(fù)至室溫（20±2℃），并充分混勻。6分析步驟6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取β內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)工作液（10U/mL、20U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL）各100μL，置于10mL比色管中，加入2.9mL磷酸鹽緩沖液，混勻。加入1mL頭孢硝噻吩溶液，立即混勻，置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)10min。以磷酸鹽緩沖液為空白對照，在4nm波長處測定吸光度值。以β內(nèi)酰胺酶活性為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.2試樣測定6.3結(jié)果計算試樣中β內(nèi)酰胺酶活性按式（1）計算：X=(AA?)×V×N/(m×k)式中：X——試樣中β內(nèi)酰胺酶活性，單位為U/g或U/mL；A——試樣溶液的吸光度值；A?——試劑空白的吸光度值；V——試樣溶液總體積，單位為mL；N——稀釋倍數(shù)；m——試樣質(zhì)量或體積，單位為g或mL；k——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7精密度7.1重復(fù)性在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。7.2再現(xiàn)性在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。8檢出限和定量限本方法的檢出限為0.5U/g（或U/mL），定量限為1.5U/g（或U/mL）。9注意事項9.1頭孢硝噻吩溶液應(yīng)臨用現(xiàn)配，避光保存，避免反復(fù)凍融。9.2反應(yīng)溫度和時間應(yīng)嚴(yán)格控制，溫度波動不應(yīng)超過±0.5℃，反應(yīng)時間應(yīng)準(zhǔn)確計時