自考本科生物技術(shù)2025年生物化學(xué)實驗試卷（含答案）考試時間：______分鐘總分：______分姓名：______一、選擇題（每小題2分，共20分）1.在蛋白質(zhì)電泳中，SDS（十二烷基硫酸鈉）的主要作用是（）。A.提供電場B.使蛋白質(zhì)變性并帶負(fù)電荷C.穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)D.縮短電泳時間2.測定酶活力時，加入酶的最適pH緩沖液通常在（）。A.底物加入之后B.催化反應(yīng)開始之前C.產(chǎn)物生成之后D.協(xié)同因子加入之后3.下列哪種方法常用于分離和純化分子量大小不同的蛋白質(zhì)？（）A.離子交換層析B.凝膠過濾層析C.親和層析D.等電點沉淀4.DNA變性時，其吸收光譜的變化特征是（）。A.在240nm附近吸收峰降低B.在260nm附近吸收峰升高C.在280nm附近吸收峰降低D.在280nm附近吸收峰升高5.在進(jìn)行分光光度法測定時，選擇參比波長（空白管讀數(shù)波長）的主要依據(jù)是（）。A.該波長處樣品溶液和空白溶液的吸光度之和最大B.該波長處樣品溶液的吸光度最大C.該波長處空白溶液的吸光度和樣品溶液的吸光度之差最大D.該波長處溶劑的吸收最大6.下列關(guān)于同工酶的敘述，錯誤的是（）。A.不同同工酶的氨基酸序列可能不同B.同工酶催化的化學(xué)反應(yīng)相同C.同工酶的Km值通常相同D.同工酶在生理功能上可能存在差異7.提取植物葉片總RNA時，通常需要加入鹽酸胍或異硫氰酸胍，其主要作用是（）。A.沉淀蛋白質(zhì)B.變性蛋白質(zhì)C.保護(hù)RNA免受降解D.提高RNA溶解度8.糖酵解過程中，哪個酶催化的反應(yīng)是不可逆的？（）A.磷酸葡萄糖異構(gòu)酶B.丙酮酸激酶C.甘油醛-3-磷酸脫氫酶D.己糖激酶9.在測定酶的最適pH時，應(yīng)設(shè)置多少個不同pH值的緩沖液梯度？（）A.2-3個B.4-5個C.6-7個D.8-10個10.下列哪種技術(shù)常用于檢測樣品中特定DNA片段的存在？（）A.凝膠過濾層析B.DNA測序C.DNA雜交D.離子交換層析二、填空題（每空1分，共15分）1.蛋白質(zhì)在等電點時，其凈電荷為________。2.酶促反應(yīng)的速度通常用________來表示。3.SDS是利用蛋白質(zhì)分子_______和_______的雙重作用進(jìn)行分離的。4.DNA變性后，其二級結(jié)構(gòu)被破壞，通常表現(xiàn)為_______的解旋。5.測定酶活力時，必須設(shè)置_______才能排除其他因素對產(chǎn)量的影響。6.纖維素酶和淀粉酶都能水解_______鏈，但它們對底物的_______識別不同。7.提取和純化核酸時，常用的試劑_______可以使蛋白質(zhì)變性沉淀。8.糖酵解的最終產(chǎn)物是_______和_______。9.核酸分子雜交的原理是_______之間堿基互補(bǔ)配對。10.實驗室常用的分光光度計通常是_______型。三、名詞解釋（每小題3分，共12分）1.米氏常數(shù)（Km）2.同工酶3.等電點（pI）4.DNA雜交四、簡答題（每小題5分，共20分）1.簡述影響酶促反應(yīng)速度的主要因素。2.簡述蛋白質(zhì)電泳的原理及其主要應(yīng)用。3.簡述提取植物組織總RNA的主要步驟和關(guān)鍵注意事項。4.簡述糖酵解途徑中的兩個關(guān)鍵（不可逆）反應(yīng)及其意義。五、實驗操作與原理題（每小題10分，共20分）1.寫出測定某酶（如過氧化氫酶）活力的大致實驗步驟，并簡述其中加入肝臟提取液、過氧化氫、硫酸鉀溶液（終止反應(yīng)）的作用。2.簡述凝膠過濾層析（凝膠滲透色譜）的分離原理，并說明如何用它來分離蛋白質(zhì)混合物。六、結(jié)果分析與討論題（10分）實驗背景：某同學(xué)進(jìn)行了不同溫度下（30°C、40°C、50°C）某酶的活力測定實驗，得到如下數(shù)據(jù)（酶濃度、底物濃度、緩沖液等條件均相同）：在30°C時，酶活力為100%；在40°C時，酶活力為80%；在50°C時，酶活力為20%。請分析該酶在40°C和50°C時活力變化的原因，并討論溫度對該酶穩(wěn)定性的影響。試卷答案一、選擇題1.B2.B3.B4.B5.C6.C7.B8.D9.C10.C二、填空題1.零2.反應(yīng)速率（或酶活性）3.凈電荷；分子大小4.雙螺旋5.空白（對照）6.淀粉；糖苷鍵7.高鹽（如氯化銫、氯化鈉或聚乙二醇）8.丙酮酸；[ATP]+Pi9.單鏈DNA（或RNA）；單鏈DNA（或RNA）10.單光束三、名詞解釋1.米氏常數(shù)（Km）：酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大速率（Vmax）一半時的底物濃度。它反映了酶與底物的親和力，Km值越小，親和力越大。2.同工酶：催化的化學(xué)反應(yīng)相同，但酶的分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、理化性質(zhì)（如等電點、Km值）不同的一類酶。3.等電點（pI）：蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時的pH值。在此pH下，蛋白質(zhì)的溶解度通常最小。4.DNA雜交：指兩條互補(bǔ)的單鏈DNA（或RNA）分子，通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合形成雙鏈分子的過程。四、簡答題1.影響酶促反應(yīng)速度的主要因素包括：*底物濃度：在底物濃度較低時，反應(yīng)速率隨底物濃度增加而增加；當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐蚋邥r，反應(yīng)速率達(dá)到最大值（Vmax）并趨于恒定。*酶濃度：在底物濃度恒定且超過足夠高時，反應(yīng)速率與酶濃度成正比。*pH：每種酶都有其最適pH，在此pH下酶活性最高。偏離最適pH，酶活性會下降。*溫度：溫度升高，反應(yīng)速率加快；但超過最適溫度，酶的構(gòu)象會改變（變性），導(dǎo)致活性下降。*抑制劑：抑制劑能與酶或酶-底物復(fù)合物結(jié)合，降低酶活性?？煞譃楦偁幮?、非競爭性和反競爭性抑制。*激動劑：某些物質(zhì)能提高酶的活性，稱為激動劑。*協(xié)同效應(yīng)：某些酶需要多種底物或輔助因子才能發(fā)揮活性，存在別構(gòu)調(diào)節(jié)。2.蛋白質(zhì)電泳是利用帶電蛋白質(zhì)分子在電場中向其電荷相反的電極遷移的原理進(jìn)行分離的技術(shù)。主要應(yīng)用包括：*分析蛋白質(zhì)的分子量大小。*分離混合樣品中的不同蛋白質(zhì)。*純化特定蛋白質(zhì)。*鑒定蛋白質(zhì)（如進(jìn)行WesternBlot）。*研究蛋白質(zhì)的亞基組成和電泳行為。常見的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)有SDS（利用SDS變性蛋白質(zhì)并賦予負(fù)電荷，主要根據(jù)分子量分離）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE，可結(jié)合非變性條件根據(jù)分子量和構(gòu)象分離）等。3.提取植物組織總RNA的主要步驟和關(guān)鍵注意事項：*步驟：①細(xì)胞裂解：通常使用研磨（加入研磨介質(zhì)如CTAB、PVP、鹽、EDTA等）或組織破碎儀破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放RNA。②蛋白質(zhì)去除：加入高鹽溶液（如0.5-1.0MNaCl或CsCl）或變性劑（如甲醛-酚-氯仿混合液）使蛋白質(zhì)變性并沉淀，或使用核酸沉淀試劑（如異硫氰酸胍-鹽酸胍）裂解細(xì)胞并抑制DNase活性，同時使蛋白質(zhì)變性沉淀。③RNA提取：離心后收集上清液（含RNA），可能需要用高純度乙醇或異丙醇沉淀RNA。④RNA洗滌：用70-75%乙醇洗滌RNA沉淀，去除殘留的鹽分和蛋白質(zhì)。⑤RNA溶解：將RNA沉淀溶于無RNase的水或緩沖液（如TE緩沖液）中。*關(guān)鍵注意事項：①無RNase操作：RNA極易被RNase降解，實驗全程需使用無RNase的試劑、器皿和手套，并在無菌、無RNase環(huán)境中操作。②完整性保護(hù)：避免劇烈研磨或加熱，使用酸性條件下（如加入醋酸）的酚-氯仿抽提或使用試劑盒，以保護(hù)RNA的完整性（特別是防止3'末端降解）。③蛋白質(zhì)去除要徹底：確保蛋白質(zhì)充分變性并沉淀，以避免污染RNA。④沉淀與洗滌要充分：保證RNA有效沉淀并徹底洗滌。4.糖酵解途徑中的兩個關(guān)鍵（不可逆）反應(yīng)及其意義：*①己糖激酶催化的反應(yīng)：葡萄糖+ATP→磷酸葡萄糖+ADP。該反應(yīng)由己糖激酶催化，是糖酵解的第一個不可逆步驟。意義：耗能（消耗ATP）將葡萄糖磷酸化，使其無法輕易通過細(xì)胞膜擴(kuò)散出去，從而“捕獲”葡萄糖并啟動糖酵解過程。*②丙酮酸激酶催化的反應(yīng)：磷酸丙酮酸+ATP→丙酮酸+ADP。該反應(yīng)由丙酮酸激酶催化，是糖酵解的第二個不可逆步驟。意義：耗能（消耗ATP）將磷酸丙酮酸進(jìn)一步磷酸化，同樣阻止產(chǎn)物丙酮酸輕易離開細(xì)胞（尤其是在動物細(xì)胞中），確保糖酵解向最終產(chǎn)物方向進(jìn)行，并再次產(chǎn)生ATP。五、實驗操作與原理題1.測定某酶（如過氧化氫酶）活力的大致實驗步驟：準(zhǔn)備一系列含有不同濃度底物（過氧化氫）的反應(yīng)體系（含酶、緩沖液等），在指定溫度下保溫一定時間（如幾分鐘），加入顯色劑（如愈創(chuàng)木酚，在過氧化氫作用下產(chǎn)生有色物質(zhì)），測定顏色深度的變化（如用分光光度計在特定波長下讀數(shù)），以吸光度變化速率表示酶活力。同時設(shè)置不加酶的空白對照（只含底物、緩沖液、顯色劑等）。計算酶活力。加入肝臟提取液的作用：提供過氧化氫酶，是反應(yīng)物。加入過氧化氫的作用：提供反應(yīng)底物。加入硫酸鉀溶液（終止反應(yīng)）的作用：高濃度的硫酸鉀能使過氧化氫酶變性失活，同時可能使過氧化氫分解，從而迅速終止反應(yīng)，使后續(xù)顏色發(fā)展停止，便于在特定時間點測定吸光度。2.凝膠過濾層析（凝膠滲透色譜）的分離原理：該技術(shù)利用填充劑（多孔凝膠珠，如葡聚糖、聚丙烯酰胺等）顆粒內(nèi)部孔隙的大小進(jìn)行分離。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物加入層析柱時，分子較小的蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠珠的孔隙內(nèi)部，其路徑曲折較長，流動緩慢；分子較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入孔隙，只能沿著凝膠珠顆粒之間的空隙（排阻層）流動，路徑短，流動快。因此，不同大小的蛋白質(zhì)根據(jù)其在凝膠孔隙中的停留時間不同而被分離，分子量大的先流出，分子量小的后流出。如何用它來分離蛋白質(zhì)混合物：將含有不同分子量蛋白質(zhì)的混合物樣品加到凝膠過濾層析柱的頂端，讓樣品溶液緩慢流經(jīng)填充有凝膠珠的層析柱。不同分子量的蛋白質(zhì)由于在層析柱中停留時間不同，會以不同的順序從柱底流出。收集流出液（洗脫液），按時間分段，每個組分通常呈狹窄的峰形?？梢酝ㄟ^分部收集或在線檢測（如UV檢測器）將不同組分分開，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。六、結(jié)果分析與討論題該酶在40°C時活力較30°C降低（為80%），表明溫度升高酶活性有所下降；在50°C時活力顯著降低至20%，遠(yuǎn)低于40°C和30°C，表明酶已受到明顯熱變性。原因分析：酶是蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和功能對溫度敏感。在30°C時，溫度接近最適溫度，酶活性最高。當(dāng)溫度升高