DB37T17802011水產(chǎn)苗種中孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)苗種中孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留量的液相色譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于魚、蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)苗種中孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及其代謝物殘留量的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限：孔雀石綠為0.5μg/kg，結(jié)晶紫為0.5μg/kg，亞甲基藍(lán)為1.0μg/kg，隱性孔雀石綠為0.5μg/kg，隱性結(jié)晶紫為0.5μg/kg。原理：試樣中的孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及其代謝物經(jīng)乙腈提取，中性氧化鋁固相萃取柱凈化，液相色譜分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。試劑和材料：除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。4.1乙腈：色譜純。4.2甲醇：色譜純。4.3乙酸銨：色譜純。4.4中性氧化鋁固相萃取柱：500mg/3mL，或相當(dāng)者。4.5孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。4.6結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。4.7亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。4.8隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%。4.9隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%。4.10標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、隱性孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于18℃避光保存，有效期3個(gè)月。4.11混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別吸取孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、隱性孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.0mL，用乙腈定容至100mL，配制成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4℃避光保存，有效期1個(gè)月。儀器和設(shè)備：5.1液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。5.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。5.3均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。5.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。5.5氮吹儀。5.6渦旋混合器。5.7固相萃取裝置。5.8超聲波清洗器。5.9pH計(jì)：精度±0.02。5.10有機(jī)濾膜：0.22μm。樣品的制備與保存：6.2樣品提?。悍Q取5.00g（精確至0.01g）均質(zhì)后的樣品于50mL離心管中，加入10mL乙腈，渦旋混合2min，超聲提取10min，以4000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。殘?jiān)偌尤?0mL乙腈，重復(fù)提取一次，合并上清液。6.3樣品凈化：將提取液通過(guò)中性氧化鋁固相萃取柱（使用前用5mL乙腈活化），收集流出液。用5mL乙腈洗滌固相萃取柱，合并流出液，于40℃水浴中氮吹至近干，用1.0mL乙腈溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相色譜分析。測(cè)定步驟：7.1色譜條件：a)色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或相當(dāng)者；b)流動(dòng)相：乙腈乙酸銨溶液（5mmol/L）（75:25，V/V）；c)流速：1.0mL/min；d)柱溫：30℃；e)檢測(cè)波長(zhǎng)：孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性孔雀石綠、隱性結(jié)晶紫為588nm，亞甲基藍(lán)為664nm；f)進(jìn)樣量：20μL。7.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.3樣品測(cè)定：按色譜條件測(cè)定樣品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中待測(cè)物的含量。結(jié)果計(jì)算：8.1試樣中孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及其代謝物的殘留量按式（1）計(jì)算：X=(c×V)/m式中：X——試樣中待測(cè)物的殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的待測(cè)物濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。8.2計(jì)算結(jié)果表示至小數(shù)點(diǎn)后一位。精密度：9.1在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。回收率：10.1本方法的添加回收率范圍為80%~110%。附錄A（資料性附錄）標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖A.1孔雀石綠、結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖[1]GB/T66822008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法[2]農(nóng)業(yè)部