基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的新生仔豬源大腸桿菌毒力因子精準(zhǔn)檢測(cè)體系構(gòu)建與實(shí)踐一、引言1.1研究背景仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種常見的仔豬腸道傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。大腸桿菌在自然界中廣泛存在，新生仔豬由于自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，腸道菌群也不穩(wěn)定，對(duì)大腸桿菌的抵抗力較弱，極易感染發(fā)病。仔豬感染大腸桿菌后，常出現(xiàn)腹瀉、脫水、生長發(fā)育受阻等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)資料顯示，在一些養(yǎng)豬場(chǎng)中，仔豬大腸桿菌病的發(fā)病率可高達(dá)50%以上，死亡率也在10%-30%左右，這不僅影響了仔豬的成活率和生長性能，還增加了養(yǎng)殖成本，降低了養(yǎng)殖效益。傳統(tǒng)的新生仔豬大腸桿菌病檢測(cè)方法主要包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)檢測(cè)等。細(xì)菌分離培養(yǎng)是檢測(cè)大腸桿菌的經(jīng)典方法，它通過將病料接種到特定的培養(yǎng)基上，進(jìn)行細(xì)菌的分離和培養(yǎng)，然后根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、菌落特征以及生化反應(yīng)等進(jìn)行鑒定。然而，這種方法操作繁瑣，需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備，而且培養(yǎng)時(shí)間較長，通常需要2-3天才能得到結(jié)果，這對(duì)于需要及時(shí)采取防控措施的養(yǎng)殖場(chǎng)來說，往往延誤了最佳治療時(shí)機(jī)。生化鑒定則是利用細(xì)菌對(duì)各種生化底物的代謝能力差異來進(jìn)行鑒定，雖然具有一定的準(zhǔn)確性，但也存在檢測(cè)時(shí)間長、步驟復(fù)雜等問題。血清學(xué)檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）等，雖然具有快速、靈敏的特點(diǎn)，但存在交叉反應(yīng)、假陽性率較高等問題，且只能檢測(cè)豬是否感染過大腸桿菌，無法區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，也不能準(zhǔn)確檢測(cè)出大腸桿菌的毒力因子。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）應(yīng)運(yùn)而生。LAMP技術(shù)是由日本學(xué)者Notomi等于2000年首次報(bào)道的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶（BstDNApolymerase）的作用下，于60-65℃恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，15-60分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)10^9-10^10倍的核酸擴(kuò)增。與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相比，LAMP技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，LAMP技術(shù)具有高特異性，由于其使用了4條特異性引物，能夠特異性地識(shí)別靶基因的6個(gè)區(qū)域，大大降低了非特異性擴(kuò)增的概率，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。其次，LAMP技術(shù)具有高敏感性，能夠檢測(cè)到極低濃度的靶核酸，其靈敏度通常比PCR技術(shù)高10-100倍。再者，LAMP技術(shù)操作簡單，不需要昂貴的PCR儀等特殊設(shè)備，只需一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱即可完成反應(yīng)，這使得它非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)。此外，LAMP技術(shù)的反應(yīng)時(shí)間短，一般在1小時(shí)內(nèi)即可完成擴(kuò)增，能夠快速得到檢測(cè)結(jié)果，為及時(shí)采取防控措施提供了有力支持。而且，LAMP技術(shù)的結(jié)果判斷也非常直觀，可以通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷結(jié)果，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員。近年來，LAMP技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，如非洲豬瘟、禽流感、口蹄疫等疫病的檢測(cè)，都取得了良好的效果，但在新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子的檢測(cè)方面，相關(guān)研究還相對(duì)較少。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，對(duì)于及時(shí)診斷和防控仔豬大腸桿菌病具有重要的意義。1.2研究目的與意義本研究旨在建立一種針對(duì)新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，并對(duì)其特異性、敏感性和重復(fù)性等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，將該方法應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)，為新生仔豬大腸桿菌病的快速診斷和防控提供有力的技術(shù)支持。仔豬大腸桿菌病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)大腸桿菌及其毒力因子，對(duì)于及時(shí)采取有效的防控措施至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，而LAMP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)使其成為一種極具潛力的替代方法。建立新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子的LAMP檢測(cè)方法具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。通過快速準(zhǔn)確地檢測(cè)大腸桿菌及其毒力因子，養(yǎng)殖場(chǎng)可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染豬只，采取隔離、治療等措施，有效減少疾病的傳播，降低仔豬的死亡率和淘汰率。這有助于提高豬群的整體健康水平，保障豬只的正常生長發(fā)育，從而提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本，增加養(yǎng)殖收益。據(jù)相關(guān)研究表明，及時(shí)準(zhǔn)確的疫病檢測(cè)和防控措施可使養(yǎng)豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益提高10%-20%。從疫病防控的角度來看，LAMP檢測(cè)方法可用于豬場(chǎng)的疫病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。通過對(duì)大量臨床樣本的檢測(cè)，能夠及時(shí)了解新生仔豬源大腸桿菌的感染情況和流行趨勢(shì)，為制定科學(xué)合理的防控策略提供依據(jù)。這有助于提前預(yù)警疫情，采取針對(duì)性的防控措施，防止疾病的大規(guī)模爆發(fā)，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。此外，該方法操作簡單、對(duì)儀器設(shè)備要求低，適合在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用。這將大大提高新生仔豬源大腸桿菌檢測(cè)的普及性和及時(shí)性，增強(qiáng)養(yǎng)豬業(yè)的疫病防控能力，從整體上提升養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。二、新生仔豬源大腸桿菌及其毒力因子概述2.1新生仔豬源大腸桿菌的特性大腸桿菌（Escherichiacoli）屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是一種革蘭氏陰性菌。其菌體呈短桿狀或長桿狀，大小約為(0.4-0.7)μm×(1-3)μm，兩端鈍圓，多數(shù)菌株具有周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢，有些菌株可形成莢膜或微莢膜。在普通培養(yǎng)基上，大腸桿菌生長迅速，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后，可形成圓形、邊緣整齊、隆起、光滑、濕潤、半透明的灰白色菌落，直徑約2-3mm。在麥康凱培養(yǎng)基上，大腸桿菌因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使菌落呈紅色；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，可形成具有黑色帶金屬光澤的菌落，這些培養(yǎng)特征可用于初步鑒別大腸桿菌。大腸桿菌具有豐富的生化特性，能發(fā)酵多種碳水化合物，如葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等，產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。它能利用枸櫞酸鹽作為碳源，在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長；能分解尿素，使培養(yǎng)基pH升高；能產(chǎn)生吲哚，在吲哚試驗(yàn)中呈陽性；能進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)），結(jié)果為陽性；能進(jìn)行V-P試驗(yàn)，結(jié)果通常為陰性。這些生化特性在大腸桿菌的鑒定和分類中具有重要作用。新生仔豬出生時(shí)，腸道內(nèi)通常是無菌的，但在出生后數(shù)小時(shí)，大腸桿菌就會(huì)通過接觸母豬的乳頭、皮膚、糞便以及周圍環(huán)境等途徑進(jìn)入仔豬腸道，并在腸道內(nèi)迅速定植和繁殖。在仔豬腸道內(nèi)，大腸桿菌主要分布于小腸后段、盲腸和結(jié)腸等部位。研究表明，在健康新生仔豬腸道中，大腸桿菌數(shù)量一般維持在10^6-10^8CFU/g腸道內(nèi)容物之間，但在某些應(yīng)激因素或腸道微生態(tài)失衡的情況下，大腸桿菌的數(shù)量會(huì)發(fā)生顯著變化，可能導(dǎo)致仔豬腸道疾病的發(fā)生。例如，當(dāng)仔豬受到寒冷、饑餓、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激時(shí)，腸道黏膜的屏障功能受損，腸道內(nèi)有益菌數(shù)量減少，大腸桿菌等有害菌則會(huì)趁機(jī)大量繁殖，從而引發(fā)仔豬腹瀉等疾病。此外，仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌的種類和數(shù)量還會(huì)受到日齡、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料等因素的影響。隨著仔豬日齡的增加，腸道菌群逐漸穩(wěn)定，大腸桿菌的種類和數(shù)量也會(huì)相對(duì)穩(wěn)定；良好的飼養(yǎng)環(huán)境和優(yōu)質(zhì)的飼料有助于維持仔豬腸道微生態(tài)的平衡，抑制大腸桿菌的過度繁殖，反之則可能導(dǎo)致大腸桿菌數(shù)量增多，增加仔豬患病的風(fēng)險(xiǎn)。2.2主要毒力因子種類及致病機(jī)制新生仔豬源大腸桿菌的致病性與其攜帶的多種毒力因子密切相關(guān)，這些毒力因子在大腸桿菌的感染、定植和致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。主要的毒力因子包括腸毒素、菌毛和毒力島等。腸毒素是新生仔豬源大腸桿菌重要的毒力因子之一，主要包括熱不穩(wěn)定腸毒素（LT）和熱穩(wěn)定腸毒素（ST）。LT屬于蛋白質(zhì)毒素，其分子結(jié)構(gòu)由1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組成。A亞單位是毒素的活性中心，具有酶活性；B亞單位則負(fù)責(zé)與小腸上皮細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1受體結(jié)合，介導(dǎo)A亞單位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)LT與小腸上皮細(xì)胞結(jié)合后，A亞單位被激活，其酶活性使細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶（AC）活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平升高。cAMP作為第二信使，可激活蛋白激酶A（PKA），PKA作用于小腸上皮細(xì)胞的離子通道，使氯離子分泌增加，鈉離子和水分吸收減少，最終導(dǎo)致腸腔內(nèi)液體大量積聚，引起腹瀉。研究表明，LT基因位于大腸桿菌的質(zhì)粒上，可通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移在不同菌株間傳播，增強(qiáng)大腸桿菌的致病性。ST是一類小分子多肽毒素，根據(jù)其生物學(xué)特性和抗原性可分為STa和STb兩種亞型。STa主要作用于小腸上皮細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶C（GC-C）受體。當(dāng)STa與GC-C受體結(jié)合后，激活GC-C，使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高。cGMP的升高會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和水鹽平衡，導(dǎo)致氯離子分泌增加，鈉離子和水分吸收減少，從而引起腹瀉。STb則主要作用于腸道的刷狀緣膜，通過改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子和水分外流，引起腸道積液和腹瀉。ST基因同樣位于大腸桿菌的質(zhì)粒上，其表達(dá)受多種因素的調(diào)控，如溫度、pH值、營養(yǎng)物質(zhì)等。在適宜的條件下，大腸桿菌可大量表達(dá)ST，增強(qiáng)其對(duì)仔豬腸道的致病性。菌毛是新生仔豬源大腸桿菌表面的一種纖細(xì)、毛發(fā)狀的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有黏附作用，能幫助大腸桿菌黏附在仔豬小腸上皮細(xì)胞表面，是大腸桿菌在腸道內(nèi)定植的重要毒力因子。常見的與新生仔豬大腸桿菌病相關(guān)的菌毛有K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）等。K88菌毛由多個(gè)亞基組成，其結(jié)構(gòu)包括菌毛主干、尖端黏附素和輔助蛋白等。K88菌毛能特異性地識(shí)別并結(jié)合仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的受體，這些受體主要是一些糖類和蛋白質(zhì)分子。研究發(fā)現(xiàn)，K88菌毛與小腸上皮細(xì)胞表面的甘露糖受體具有高度親和力，通過與甘露糖受體的結(jié)合，K88菌毛介導(dǎo)大腸桿菌黏附在小腸上皮細(xì)胞上。K88菌毛的表達(dá)受環(huán)境因素和基因調(diào)控，在適宜的條件下，大腸桿菌可表達(dá)K88菌毛，增強(qiáng)其在腸道內(nèi)的定植能力。K99菌毛也是由多個(gè)亞基組成，其結(jié)構(gòu)和功能與K88菌毛類似。K99菌毛能特異性地結(jié)合仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的唾液酸受體，從而實(shí)現(xiàn)大腸桿菌在小腸上皮細(xì)胞的黏附。研究表明，K99菌毛的表達(dá)與大腸桿菌的生長階段和環(huán)境因素有關(guān)，在對(duì)數(shù)生長期，大腸桿菌表達(dá)K99菌毛的水平較高。此外，K99菌毛基因位于大腸桿菌的質(zhì)粒上，可通過質(zhì)粒的傳遞在不同菌株間傳播，增加大腸桿菌的致病性。987P菌毛同樣具有黏附功能，其結(jié)構(gòu)和黏附機(jī)制與K88、K99菌毛有所不同。987P菌毛能與仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，介導(dǎo)大腸桿菌的黏附。研究發(fā)現(xiàn)，987P菌毛的黏附作用可能與細(xì)胞表面的某些蛋白質(zhì)和糖類分子有關(guān)，但具體的受體和黏附機(jī)制尚不完全清楚。987P菌毛基因也位于大腸桿菌的質(zhì)粒上，其表達(dá)受多種因素的調(diào)控。在感染過程中，表達(dá)987P菌毛的大腸桿菌能夠更好地黏附在小腸上皮細(xì)胞上，逃避機(jī)體的免疫清除，從而引發(fā)疾病。毒力島是指病原菌染色體上一段具有典型結(jié)構(gòu)特征的基因簇，攜帶多種毒力相關(guān)基因，與病原菌的致病性密切相關(guān)。在新生仔豬源大腸桿菌中，常見的毒力島有HPI（High-pathogenicityisland）、ETT2（Enterobacterialcommonantigentype2secretionsystemisland）、LEE（Locusofenterocyteeffacement）等。HPI毒力島主要攜帶與鐵攝取相關(guān)的基因，如鐵載體合成基因、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等。在宿主體內(nèi)，鐵是細(xì)菌生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，但宿主會(huì)通過多種機(jī)制限制細(xì)菌對(duì)鐵的攝取。HPI毒力島使大腸桿菌能夠合成特殊的鐵載體，如yersiniabactin，這種鐵載體具有很強(qiáng)的鐵螯合能力，能夠從宿主細(xì)胞中奪取鐵，滿足大腸桿菌生長和繁殖的需求。研究表明，攜帶HPI毒力島的大腸桿菌在宿主體內(nèi)的生存能力和致病性明顯增強(qiáng)，能夠更好地適應(yīng)宿主環(huán)境，引發(fā)感染。ETT2毒力島編碼一套完整的Ⅱ型分泌系統(tǒng)，該系統(tǒng)由多個(gè)蛋白質(zhì)組成，能夠?qū)⒋竽c桿菌分泌的毒力蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，作用于宿主細(xì)胞。ETT2毒力島編碼的毒力蛋白包括一些蛋白酶、溶血素等，這些毒力蛋白可以破壞宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)大腸桿菌的感染和致病。例如，ETT2毒力島編碼的溶血素能夠破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，釋放出鐵等營養(yǎng)物質(zhì)，為大腸桿菌的生長提供條件。此外，ETT2毒力島編碼的蛋白酶還可以降解宿主細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)和免疫球蛋白，削弱宿主的免疫防御能力，使大腸桿菌更容易在宿主體內(nèi)定植和擴(kuò)散。LEE毒力島主要存在于腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC）中，其攜帶的基因參與了大腸桿菌與小腸上皮細(xì)胞的緊密黏附和破壞細(xì)胞微絨毛的過程。LEE毒力島編碼一種稱為Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）的蛋白質(zhì)分泌裝置，該系統(tǒng)能夠?qū)⒁幌盗行?yīng)蛋白直接注入小腸上皮細(xì)胞內(nèi)。這些效應(yīng)蛋白可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，使大腸桿菌能夠緊密黏附在小腸上皮細(xì)胞表面，并破壞細(xì)胞微絨毛，影響小腸的消化和吸收功能。例如，LEE毒力島編碼的效應(yīng)蛋白Tir（Translocatedintiminreceptor）能夠插入小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，作為大腸桿菌表面蛋白Intimin的受體，介導(dǎo)大腸桿菌與小腸上皮細(xì)胞的緊密黏附。此外，LEE毒力島編碼的其他效應(yīng)蛋白還可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的基因表達(dá)，抑制細(xì)胞的免疫應(yīng)答，促進(jìn)大腸桿菌的感染和致病。2.3毒力因子對(duì)新生仔豬健康的影響毒力因子在新生仔豬源大腸桿菌致病過程中起著關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致仔豬發(fā)生多種疾病，嚴(yán)重影響仔豬的健康狀況，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。以腸毒素為例，熱不穩(wěn)定腸毒素（LT）和熱穩(wěn)定腸毒素（ST）是引發(fā)仔豬腹瀉的重要因素。當(dāng)新生仔豬攝入含有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的乳汁或受到污染的飼料、飲水后，大腸桿菌在腸道內(nèi)定植并大量繁殖，釋放LT和ST。這些腸毒素作用于小腸上皮細(xì)胞，改變細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞分泌功能紊亂，導(dǎo)致大量水分和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔，從而引發(fā)腹瀉。在廣東某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)，曾發(fā)生一起因新生仔豬源大腸桿菌感染導(dǎo)致的腹瀉疫情，經(jīng)檢測(cè)，該批次發(fā)病仔豬體內(nèi)分離出的大腸桿菌攜帶LT和ST基因?；疾∽胸i從7日齡開始出現(xiàn)嘔吐、拉黃色或灰白色糊狀糞便等癥狀，發(fā)病率高達(dá)80%，雖經(jīng)抗生素治療，仍有10%的仔豬因嚴(yán)重脫水和電解質(zhì)紊亂而死亡。這充分說明了腸毒素毒力因子對(duì)新生仔豬健康的嚴(yán)重威脅。菌毛作為大腸桿菌的重要黏附因子，對(duì)其在仔豬腸道內(nèi)的定植和致病過程也至關(guān)重要。K88、K99、987P等菌毛能特異性地結(jié)合仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的受體，使大腸桿菌得以在腸道內(nèi)黏附、繁殖，逃避機(jī)體的免疫清除，進(jìn)而引發(fā)疾病。研究表明，表達(dá)K88菌毛的大腸桿菌更容易在仔豬小腸前段定植，而表達(dá)K99菌毛的大腸桿菌則傾向于在小腸后段定植。在實(shí)際養(yǎng)殖中，若仔豬腸道內(nèi)定植了大量攜帶菌毛的大腸桿菌，會(huì)破壞腸道黏膜的完整性，影響腸道的消化和吸收功能，導(dǎo)致仔豬生長發(fā)育受阻。例如，在山東的一個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)，部分仔豬在斷奶后出現(xiàn)漸進(jìn)性腹瀉、消瘦等癥狀，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離出的大腸桿菌攜帶K99菌毛基因。這些仔豬由于腸道受到大腸桿菌的侵害，營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良，生長速度明顯低于健康仔豬，飼料轉(zhuǎn)化率也顯著降低，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。毒力島同樣對(duì)新生仔豬健康有著顯著影響。攜帶HPI毒力島的大腸桿菌能增強(qiáng)對(duì)鐵的攝取能力，在宿主體內(nèi)更好地生存和繁殖，從而增加致病的可能性。ETT2毒力島編碼的Ⅱ型分泌系統(tǒng)可將多種毒力蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，破壞宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)感染的發(fā)生。而LEE毒力島參與大腸桿菌與小腸上皮細(xì)胞的緊密黏附及破壞細(xì)胞微絨毛的過程，嚴(yán)重影響小腸的正常功能。在某地區(qū)的仔豬養(yǎng)殖中，曾出現(xiàn)因感染攜帶LEE毒力島大腸桿菌而導(dǎo)致的仔豬生長停滯現(xiàn)象。患病仔豬小腸上皮細(xì)胞微絨毛受損，消化酶分泌減少，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力大幅下降，體重增長緩慢，甚至出現(xiàn)體重減輕的情況。這表明毒力島攜帶的基因及其表達(dá)產(chǎn)物在新生仔豬源大腸桿菌致病過程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)仔豬的生長性能和健康狀況產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的負(fù)面影響。三、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)原理與優(yōu)勢(shì)3.1LAMP技術(shù)的基本原理環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是一種新穎的核酸擴(kuò)增方法，其引物設(shè)計(jì)獨(dú)具特色。它針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域，精心設(shè)計(jì)4條特異性引物，分別為一對(duì)內(nèi)引物FIP（ForwardInnerPrimer）和BIP（BackwardInnerPrimer），以及一對(duì)外引物F3（ForwardOuterPrimer）和B3（BackwardOuterPrimer）。其中，F(xiàn)IP由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5'端的Flc區(qū)域序列相同；F3引物由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)；BIP引物由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3'端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與靶基因5'端的Blc區(qū)域序列相同；B3引物由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。這種獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)，使得LAMP技術(shù)能夠高度特異性地識(shí)別靶基因，大大降低了非特異性擴(kuò)增的可能性。在擴(kuò)增過程中，首先是起始階段。當(dāng)反應(yīng)體系處于60-65℃的恒溫條件時(shí)，雙鏈DNA處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列率先與模板F2c結(jié)合，在具有鏈置換功能的BstDNA聚合酶的作用下，向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。此時(shí)，外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，從而置換出完整的與FIP連接的互補(bǔ)單鏈。由于FIP上的F1c與該單鏈上的Fl為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，它們會(huì)自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。緊接著，下游引物BIP與B3先后啟動(dòng)類似于FIP和F3的合成過程，最終形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。此啞鈴狀結(jié)構(gòu)迅速以3'末端的Fl區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸，進(jìn)而形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)便是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。隨后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP再次與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換合成。在這個(gè)過程中，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。接著，迅速以3’末端的B1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換，形成兩條長短不一的新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA。此時(shí)，BIP引物上的B2與新形成的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)雜交，從而啟動(dòng)新一輪的擴(kuò)增，且每次擴(kuò)增產(chǎn)物DNA長度增加一倍。若在反應(yīng)體系中添加兩條環(huán)引物L(fēng)F（LoopForwardPrimer）和LB（LoopBackwardPrimer），它們會(huì)分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，進(jìn)一步啟動(dòng)鏈置換合成。如此周而復(fù)始，擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物，且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。這些產(chǎn)物形成了獨(dú)特的花椰菜型結(jié)構(gòu)，這是LAMP技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的典型特征。在整個(gè)擴(kuò)增過程中，從dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）析出的焦磷酸根離子會(huì)與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，形成乳白色沉淀。通過觀察是否產(chǎn)生這種沉淀，便可以初步判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否發(fā)生，為結(jié)果的判定提供了一種直觀簡便的方法。3.2LAMP技術(shù)的反應(yīng)特點(diǎn)LAMP技術(shù)具有諸多獨(dú)特的反應(yīng)特點(diǎn)，使其在核酸擴(kuò)增檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。首先，其特異性極強(qiáng)。LAMP技術(shù)通過4條特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，這種精準(zhǔn)的識(shí)別機(jī)制使得反應(yīng)過程幾乎不受反應(yīng)混合物中非靶序列DNA的干擾。在對(duì)新生仔豬源大腸桿菌的檢測(cè)中，針對(duì)特定毒力因子基因設(shè)計(jì)的LAMP引物，能夠高度特異性地結(jié)合靶基因，有效避免了與其他細(xì)菌或非特異性DNA的結(jié)合，大大降低了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)概率，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，PCR通常僅使用一對(duì)引物，對(duì)靶基因的識(shí)別區(qū)域相對(duì)較少，在復(fù)雜的樣本環(huán)境中，更容易受到非特異性DNA的影響，導(dǎo)致擴(kuò)增出非目標(biāo)產(chǎn)物，而LAMP技術(shù)憑借其獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)，顯著提高了檢測(cè)的特異性。LAMP技術(shù)的靈敏度也非常高。該技術(shù)能夠檢測(cè)到極低拷貝數(shù)的靶核酸，一般而言，其檢測(cè)下限可低至10拷貝甚至更少，比常規(guī)PCR技術(shù)的靈敏度高出10-100倍。在檢測(cè)新生仔豬源大腸桿菌的毒力因子時(shí)，即使樣本中大腸桿菌數(shù)量極少，毒力因子基因拷貝數(shù)很低，LAMP技術(shù)也能夠有效地將其擴(kuò)增并檢測(cè)出來。以某研究為例，在對(duì)感染早期的新生仔豬糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，傳統(tǒng)PCR技術(shù)未能檢測(cè)到毒力因子基因，而LAMP技術(shù)卻成功檢測(cè)到了，這充分證明了LAMP技術(shù)在檢測(cè)低豐度核酸方面的卓越能力。這種高靈敏度使得LAMP技術(shù)在疫病的早期診斷中具有重要意義，能夠幫助養(yǎng)殖戶及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染豬只，采取相應(yīng)的防控措施，有效遏制疾病的傳播和擴(kuò)散。LAMP技術(shù)還具有快速高效的特點(diǎn)。由于其在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，無需像PCR技術(shù)那樣進(jìn)行復(fù)雜的溫度循環(huán)，避免了溫度變化過程中造成的時(shí)間損失。LAMP技術(shù)通常在1小時(shí)內(nèi)即可完成核酸擴(kuò)增，若在反應(yīng)體系中添加環(huán)引物（LF和LB），則反應(yīng)時(shí)間可進(jìn)一步縮短1/3-1/2，一般20-30分鐘就能檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于需要快速得到檢測(cè)結(jié)果的養(yǎng)殖場(chǎng)或基層實(shí)驗(yàn)室而言，LAMP技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的檢測(cè)報(bào)告，為及時(shí)制定防控策略贏得寶貴時(shí)間。例如，在某養(yǎng)豬場(chǎng)疑似發(fā)生仔豬大腸桿菌病疫情時(shí)，使用LAMP技術(shù)對(duì)采集的樣本進(jìn)行檢測(cè)，僅用了30分鐘就確定了大腸桿菌的感染情況及毒力因子類型，養(yǎng)殖場(chǎng)據(jù)此迅速采取了隔離、治療等措施，有效控制了疫情的蔓延。操作簡單也是LAMP技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)的操作步驟與PCR基本相同，但不需要昂貴的PCR儀等復(fù)雜設(shè)備，僅需一臺(tái)普通的水浴鍋或恒溫箱，就能滿足反應(yīng)所需的恒溫條件。對(duì)于RNA的擴(kuò)增，只需在反應(yīng)體系中加入特定的逆轉(zhuǎn)錄酶，即可同步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP），無需特殊的試劑及儀器。這使得LAMP技術(shù)非常適合在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用，即使是技術(shù)水平相對(duì)較低的操作人員，也能輕松掌握該技術(shù)的操作方法。在一些偏遠(yuǎn)地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)，由于缺乏專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以實(shí)施，而LAMP技術(shù)憑借其簡單易操作的特點(diǎn)，為這些養(yǎng)殖場(chǎng)提供了一種便捷的檢測(cè)手段，有助于提高疫病檢測(cè)的覆蓋率和及時(shí)性。成本低也是LAMP技術(shù)的顯著特點(diǎn)之一。LAMP反應(yīng)不需要進(jìn)行模板的熱變性、長時(shí)間的溫度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等復(fù)雜步驟，減少了試劑和耗材的使用量。同時(shí)，由于所需設(shè)備簡單，降低了設(shè)備購置和維護(hù)成本。與PCR技術(shù)相比，PCR不僅需要昂貴的PCR儀，還需要配套的電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)等，且試劑成本相對(duì)較高。而LAMP技術(shù)在保證檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度的前提下，大大降低了檢測(cè)成本，這對(duì)于大規(guī)模的疫病檢測(cè)和監(jiān)測(cè)來說，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。在對(duì)大量新生仔豬源大腸桿菌樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，使用LAMP技術(shù)能夠顯著降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率，為養(yǎng)豬業(yè)的疫病防控提供了一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的技術(shù)選擇。3.3LAMP技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀近年來，LAMP技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，涵蓋了細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多個(gè)方面。在細(xì)菌檢測(cè)方面，LAMP技術(shù)已成功應(yīng)用于多種病原菌的檢測(cè)。以大腸桿菌為例，LAMP技術(shù)不僅能檢測(cè)常見的致病性大腸桿菌，如腸出血性大腸桿菌（EHEC），還能針對(duì)其毒力因子進(jìn)行特異性檢測(cè)。有研究建立了針對(duì)EHEC的stx1和stx2基因的LAMP檢測(cè)方法，通過設(shè)計(jì)特異性引物，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出攜帶這些毒力基因的大腸桿菌。該方法在檢測(cè)人工污染的食品樣本時(shí)，表現(xiàn)出了極高的靈敏度和特異性，能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出低至10CFU/mL的EHEC。此外，對(duì)于空腸彎曲菌，有研究利用LAMP技術(shù)建立了基于hipO基因的檢測(cè)方法，該方法能夠在60分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10CFU/mL，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和PCR檢測(cè)方法。在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中，針對(duì)其耐熱核酸酶基因（nuc）的LAMP檢測(cè)方法也展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用效果，能夠快速檢測(cè)出食品和臨床樣本中的金黃色葡萄球菌，為相關(guān)疾病的診斷和食品安全監(jiān)測(cè)提供了有力支持。在病毒檢測(cè)領(lǐng)域，LAMP技術(shù)同樣發(fā)揮著重要作用。例如，在禽流感病毒檢測(cè)中，有研究建立了針對(duì)禽流感病毒H5和H7亞型的LAMP檢測(cè)方法。該方法通過設(shè)計(jì)特異性引物，能夠在恒溫條件下快速擴(kuò)增病毒基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)禽流感病毒的快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR高10倍，且能夠在30分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，為禽流感疫情的早期診斷和防控提供了及時(shí)的技術(shù)支持。在豬瘟病毒檢測(cè)方面，基于LAMP技術(shù)建立的檢測(cè)方法也具有較高的靈敏度和特異性，能夠快速檢測(cè)出豬組織和血清中的豬瘟病毒，對(duì)于豬瘟的防控具有重要意義。此外，在口蹄疫病毒、新城疫病毒等多種動(dòng)物病毒的檢測(cè)中，LAMP技術(shù)都取得了良好的應(yīng)用效果，為動(dòng)物疫病的快速診斷和防控提供了有效的手段。LAMP技術(shù)在寄生蟲檢測(cè)中也有廣泛應(yīng)用。在瘧原蟲檢測(cè)方面，有研究建立了基于LAMP技術(shù)的檢測(cè)方法，該方法能夠快速檢測(cè)出瘧原蟲的特異性基因，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10個(gè)瘧原蟲/μL。與傳統(tǒng)的顯微鏡檢測(cè)方法相比，LAMP技術(shù)具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，且操作簡便，能夠在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為瘧疾的診斷和防控提供了有力支持。在弓形蟲檢測(cè)中，基于LAMP技術(shù)建立的檢測(cè)方法能夠快速檢測(cè)出弓形蟲的B1基因，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10拷貝/μL。該方法在動(dòng)物血清和組織樣本的檢測(cè)中表現(xiàn)出了良好的特異性和重復(fù)性，為弓形蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的工具。鑒于LAMP技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和顯著優(yōu)勢(shì)，其在新生仔豬源大腸桿菌檢測(cè)中也具有巨大的應(yīng)用潛力。通過針對(duì)新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子設(shè)計(jì)特異性引物，利用LAMP技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)這些毒力因子的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。這將有助于及時(shí)診斷新生仔豬大腸桿菌病，明確病原菌的毒力特性，為制定科學(xué)合理的防控措施提供依據(jù)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，LAMP技術(shù)的高靈敏度能夠檢測(cè)到早期感染和低載量的大腸桿菌，高特異性能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同毒力因子，操作簡單和快速的特點(diǎn)則能滿足養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，從而有效提高新生仔豬大腸桿菌病的防控效率，減少疾病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害。四、檢測(cè)方法的建立4.1材料準(zhǔn)備本研究選用的大腸桿菌菌株為從新生仔豬腹瀉病例中分離得到的多株具有代表性的菌株，涵蓋了常見的血清型和毒力譜，這些菌株經(jīng)過傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定以及16SrRNA基因測(cè)序等方法進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定。同時(shí)，選取了沙門菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬丹毒桿菌等8株常見細(xì)菌作為對(duì)照菌株，用于驗(yàn)證LAMP檢測(cè)方法的特異性。這些對(duì)照菌株同樣經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定，確保其種屬的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用1-3日齡的健康新生仔豬，購自某正規(guī)種豬場(chǎng)。仔豬購回后，先在隔離舍中飼養(yǎng)觀察3天，期間密切觀察仔豬的精神狀態(tài)、采食情況、糞便形態(tài)等，確保仔豬健康無病后，再用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理和福利要求進(jìn)行操作，為仔豬提供適宜的飼養(yǎng)環(huán)境和充足的飼料、飲水，盡量減少對(duì)仔豬的應(yīng)激。主要試劑包括：DNA提取試劑盒，用于從細(xì)菌樣本和臨床病料中提取基因組DNA，確保提取的DNA純度和濃度滿足實(shí)驗(yàn)要求；BstDNA聚合酶，該酶具有鏈置換活性，是LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能夠在恒溫條件下催化DNA的合成和擴(kuò)增；dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸），為DNA合成提供原料，保證擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行；MgCl?，作為BstDNA聚合酶的激活劑，參與DNA合成反應(yīng)，其濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的效率和特異性有重要影響；甜菜堿，能夠提高DNA雙鏈的穩(wěn)定性，增強(qiáng)LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效果；引物，針對(duì)大腸桿菌不同毒力因子（腸毒素、菌毛、毒力島等）的基因序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerVersion5精心設(shè)計(jì)了4條特異性引物（FIP、BIP、F3、B3），并由專業(yè)的生物公司合成，引物合成后進(jìn)行了純度和濃度檢測(cè)，確保其質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。此外，還準(zhǔn)備了SYBRGreenI熒光染料，用于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)，通過觀察熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來判斷擴(kuò)增結(jié)果。主要儀器設(shè)備有：恒溫水浴鍋，用于提供LAMP反應(yīng)所需的恒溫環(huán)境，確保反應(yīng)在60-65℃的穩(wěn)定溫度下進(jìn)行；離心機(jī)，用于細(xì)菌樣本的離心分離和DNA提取過程中的離心操作，實(shí)現(xiàn)固液分離，獲取純凈的細(xì)菌菌體和高質(zhì)量的DNA；PCR儀，雖然LAMP反應(yīng)是在恒溫條件下進(jìn)行，但在前期引物的驗(yàn)證和部分對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，需要使用PCR儀進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和分析LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果，通過拍攝凝膠圖像，直觀地判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和特異性；移液器，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣本，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。所有儀器設(shè)備在使用前均進(jìn)行了校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。4.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中已公布的大腸桿菌腸毒素（LT1、ST1、ST2）基因、菌毛（K88、K99、987P）基因、毒力島（HPI、ETT2、LEE）基因序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerVersion5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)過程中，嚴(yán)格遵循LAMP引物設(shè)計(jì)原則，確保引物能夠特異性地識(shí)別靶基因的6個(gè)不同區(qū)域。針對(duì)每個(gè)毒力因子基因，設(shè)計(jì)一套包含4條引物的引物組，分別為上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3。例如，對(duì)于腸毒素LT1基因，F(xiàn)IP引物由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與LT1基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與LT1基因5’端的Flc區(qū)域序列相同；F3引物由F3區(qū)組成，并與LT1基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)；BIP引物由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與LT1基因3’端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與LT1基因5’端的Blc區(qū)域序列相同；B3引物由B3區(qū)域組成，和LT1基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。通過這種精心設(shè)計(jì)，使得引物能夠準(zhǔn)確地與靶基因結(jié)合，啟動(dòng)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)計(jì)完成后，對(duì)引物的特異性進(jìn)行初步評(píng)估。將設(shè)計(jì)好的引物序列在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，確保引物與其他非目標(biāo)基因序列無顯著同源性，以降低非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過比對(duì)篩選，去除與其他基因有較高同源性的引物，保留特異性良好的引物。將篩選后的引物序列提交給專業(yè)的生物公司進(jìn)行合成。合成的引物經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，以提高引物的純度。引物合成后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，將引物稀釋成所需的工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)合成的引物進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，通過LAMP反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察引物對(duì)靶基因的擴(kuò)增效果，確保引物的有效性和特異性。4.3反應(yīng)體系的優(yōu)化為了獲得最佳的LAMP反應(yīng)效果，對(duì)反應(yīng)體系中的多個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。首先，研究Mg2?濃度對(duì)反應(yīng)的影響。Mg2?作為BstDNA聚合酶的激活劑，其濃度對(duì)酶的活性以及引物與模板的結(jié)合能力有著重要影響。設(shè)置Mg2?濃度梯度為2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L，其他反應(yīng)條件保持一致，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)Mg2?濃度為6mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，反應(yīng)體系中產(chǎn)生的白色沉淀明顯，電泳條帶清晰且亮度較高。當(dāng)Mg2?濃度低于6mmol/L時(shí)，酶的活性受到抑制，擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，電泳條帶較淡；而當(dāng)Mg2?濃度高于6mmol/L時(shí)，非特異性擴(kuò)增增加，導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)雜帶，影響結(jié)果判斷。甜菜堿能夠提高DNA雙鏈的穩(wěn)定性，增強(qiáng)LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效果。設(shè)置甜菜堿濃度梯度為0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L，對(duì)其在反應(yīng)體系中的作用進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)甜菜堿濃度為1.5mol/L時(shí)，LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率最高，產(chǎn)物量明顯增加，電泳條帶最為清晰。濃度低于1.5mol/L時(shí)，對(duì)擴(kuò)增效果的提升作用不明顯；而濃度高于1.5mol/L時(shí)，可能會(huì)對(duì)引物與模板的結(jié)合產(chǎn)生一定的干擾，導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降。dNTP作為DNA合成的原料，其濃度直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。設(shè)置dNTP濃度梯度為0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)dNTP濃度為1.4mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，能夠滿足DNA合成的需求，反應(yīng)體系中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀明顯，電泳條帶清晰。濃度過低時(shí)，原料不足，擴(kuò)增產(chǎn)物量少；濃度過高則可能導(dǎo)致反應(yīng)體系的pH值發(fā)生變化，抑制酶的活性，影響擴(kuò)增效果。內(nèi)引物在LAMP反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，其濃度對(duì)擴(kuò)增效率有著顯著影響。設(shè)置內(nèi)引物濃度梯度為0.8μmol/L、1.2μmol/L、1.6μmol/L、2.0μmol/L、2.4μmol/L，外引物濃度固定為0.2μmol/L，進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)引物濃度為1.6μmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，電泳條帶清晰且亮度均勻。內(nèi)引物濃度過低，無法有效啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量少；濃度過高則可能會(huì)形成引物二聚體，競(jìng)爭反應(yīng)體系中的原料和酶，抑制擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。BstDNA聚合酶是LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其添加量對(duì)反應(yīng)結(jié)果有著重要影響。設(shè)置BstDNA聚合酶的添加量梯度為0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U，其他反應(yīng)條件不變，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)BstDNA聚合酶添加量為1.5U時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)體系中的白色沉淀明顯，電泳條帶清晰。添加量過低，酶量不足，擴(kuò)增效率低下；添加量過高則可能會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。經(jīng)過對(duì)Mg2?濃度、甜菜堿濃度、dNTP濃度、內(nèi)引物濃度、BstDNA聚合酶添加量等多個(gè)因素的優(yōu)化，最終確定了新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子LAMP檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系：25μL反應(yīng)體系中，包含10×ThermoPolBuffer2.5μL，Mg2?6mmol/L，甜菜堿1.5mol/L，dNTP1.4mmol/L，內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6μmol/L，外引物（F3和B3）各0.2μmol/L，BstDNA聚合酶1.5U，模板DNA1μL，加雙蒸水補(bǔ)足至25μL。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，均采用該優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP檢測(cè)，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.4反應(yīng)條件的確定反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間是影響LAMP擴(kuò)增效果的重要因素，為確定最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行了一系列梯度實(shí)驗(yàn)。首先，對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。在已優(yōu)化的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，設(shè)置反應(yīng)溫度梯度為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，反應(yīng)時(shí)間固定為60分鐘，以含有大腸桿菌特定毒力因子基因的模板DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察反應(yīng)管底部是否有白色沉淀（焦磷酸鎂）產(chǎn)生以及進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)溫度為63℃時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，反應(yīng)管底部白色沉淀明顯，瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且亮度高。在60℃和61℃時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，白色沉淀不明顯，電泳條帶較淡，這可能是因?yàn)闇囟容^低，引物與模板的結(jié)合效率較低，BstDNA聚合酶的活性也受到一定抑制，導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)不完全。而在64℃和65℃時(shí)，雖然也能觀察到白色沉淀和電泳條帶，但非特異性擴(kuò)增有所增加，條帶出現(xiàn)雜帶，影響結(jié)果判斷，可能是由于溫度過高，引物的特異性下降，導(dǎo)致與非靶序列結(jié)合，引發(fā)非特異性擴(kuò)增。接著，對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。在最佳反應(yīng)溫度63℃下，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間梯度為30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘，以同樣的模板DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，采用與溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)相同的檢測(cè)方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，反應(yīng)時(shí)間為60分鐘時(shí)，擴(kuò)增效果最佳，白色沉淀明顯，電泳條帶清晰。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30分鐘和40分鐘時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量不足，白色沉淀較淺，電泳條帶較暗，說明反應(yīng)時(shí)間過短，擴(kuò)增反應(yīng)未充分進(jìn)行。而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長至70分鐘和80分鐘時(shí)，雖然擴(kuò)增產(chǎn)物量有所增加，但非特異性擴(kuò)增也隨之增多，電泳條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這可能是由于反應(yīng)時(shí)間過長，引物和酶的活性逐漸下降，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物積累。綜合考慮反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)擴(kuò)增效果的影響，最終確定新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子LAMP檢測(cè)的最佳反應(yīng)條件為：在63℃恒溫條件下反應(yīng)60分鐘。在后續(xù)的特異性、敏感性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及臨床樣本檢測(cè)中，均采用該最佳反應(yīng)條件，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.5檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)為驗(yàn)證所建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子的特異性，以8株常見細(xì)菌（沙門菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬丹毒桿菌）作為陰性對(duì)照，以超純水作為空白對(duì)照，以含有大腸桿菌不同毒力因子（腸毒素、菌毛、毒力島）基因的菌株作為陽性對(duì)照。按照優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別對(duì)各菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察反應(yīng)管底部是否有白色沉淀（焦磷酸鎂）產(chǎn)生以及進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果顯示，只有陽性對(duì)照菌株的反應(yīng)管底部出現(xiàn)明顯的白色沉淀，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出典型的LAMP擴(kuò)增條帶，即階梯狀條帶。而8株陰性對(duì)照細(xì)菌以及空白對(duì)照的反應(yīng)管底部均無白色沉淀產(chǎn)生，瓊脂糖凝膠電泳未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。這表明本研究建立的LAMP檢測(cè)方法僅對(duì)大腸桿菌不同毒力因子基因有擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)其他常見細(xì)菌無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出新生仔豬源大腸桿菌的不同毒力因子，有效避免了因非特異性擴(kuò)增而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，為后續(xù)的檢測(cè)工作提供了可靠的技術(shù)保障。4.6檢測(cè)方法的靈敏性試驗(yàn)將含有大腸桿菌不同毒力因子基因的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)分別為10^7、10^6、10^5、10^4、10^3、10^2、10^1、10^0copies/μL。分別取1μL不同稀釋度的質(zhì)粒作為模板，按照優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)，以相同的模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增作為對(duì)照，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察電泳條帶情況；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到最低拷貝數(shù)為10^1copies/μL的質(zhì)粒，當(dāng)模板拷貝數(shù)低于10^1copies/μL時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳未出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增條帶。而常規(guī)PCR方法能夠檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)為10^3copies/μL，當(dāng)模板拷貝數(shù)低于10^3copies/μL時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶微弱甚至無條帶出現(xiàn)。這表明本研究建立的LAMP檢測(cè)方法的靈敏度比常規(guī)PCR方法高100倍，能夠更靈敏地檢測(cè)出新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子基因，在實(shí)際檢測(cè)中，對(duì)于低載量的大腸桿菌感染樣本，LAMP檢測(cè)方法具有更高的檢出率，能夠?yàn)樾律胸i大腸桿菌病的早期診斷提供更有力的技術(shù)支持。五、檢測(cè)方法的應(yīng)用5.1臨床樣本的采集與處理為全面了解新生仔豬源大腸桿菌的感染情況及毒力因子分布，在某地區(qū)多家規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)開展臨床樣本采集工作。針對(duì)出現(xiàn)腹瀉癥狀的新生仔豬，優(yōu)先選擇具有典型腹瀉癥狀的個(gè)體，如糞便呈水樣、糊狀，顏色異常，伴有腥臭味，且精神萎靡、食欲不振、生長遲緩的仔豬。采集的樣本類型包括糞便、小腸內(nèi)容物和小腸黏膜。糞便樣本采用直腸拭子采集法，將無菌拭子緩慢插入仔豬直腸內(nèi)3-5cm，輕輕旋轉(zhuǎn)拭子，使其充分接觸腸壁，采集糞便樣本后，將拭子放入含有1mL生理鹽水的無菌離心管中，立即做好標(biāo)記。小腸內(nèi)容物和小腸黏膜樣本則在仔豬剖檢時(shí)采集，選擇無菌環(huán)境進(jìn)行操作，用無菌剪刀剪取約5cm長的小腸段，將兩端結(jié)扎，避免內(nèi)容物流出，然后將小腸段放入無菌培養(yǎng)皿中。用無菌鑷子小心地將小腸內(nèi)容物擠出，收集于無菌離心管中；對(duì)于小腸黏膜樣本，用無菌生理鹽水沖洗小腸段，去除表面的內(nèi)容物，然后用無菌載玻片輕輕刮取小腸黏膜，將刮取的黏膜放入無菌離心管中，同樣做好標(biāo)記。采集的樣本若不能及時(shí)檢測(cè)，需進(jìn)行妥善保存。糞便樣本和小腸內(nèi)容物樣本置于-20℃冰箱冷凍保存，小腸黏膜樣本則先放入液氮中速凍3-5分鐘，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以確保樣本中核酸的完整性。在樣本運(yùn)輸過程中，采用干冰作為制冷劑，將樣本放入專用的樣本運(yùn)輸箱中，確保樣本在運(yùn)輸過程中始終處于低溫狀態(tài)，避免樣本反復(fù)凍融，影響檢測(cè)結(jié)果。在進(jìn)行LAMP檢測(cè)前，需要對(duì)臨床樣本進(jìn)行處理，以提取高質(zhì)量的DNA。使用DNA提取試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行處理，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。對(duì)于糞便樣本，先將采集的糞便拭子在生理鹽水中充分振蕩，使糞便均勻分散，然后取100μL糞便懸液加入到含有裂解液的離心管中，充分混勻，在65℃水浴鍋中孵育10-15分鐘，使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，釋放出DNA。接著加入蛋白酶K，繼續(xù)在65℃孵育10分鐘，以消化蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。之后加入適量的緩沖液和乙醇，充分混勻后，將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，使DNA吸附在吸附柱上。依次用洗滌液1和洗滌液2對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，去除雜質(zhì)，最后加入適量的洗脫緩沖液，12000rpm離心1分鐘，將DNA洗脫下來，收集洗脫液，即為提取的糞便樣本DNA。小腸內(nèi)容物樣本的處理與糞便樣本類似，先將小腸內(nèi)容物充分混勻，取適量樣本按照上述糞便樣本的處理步驟進(jìn)行DNA提取。小腸黏膜樣本由于細(xì)胞含量較高，在裂解步驟中，可適當(dāng)延長裂解時(shí)間至15-20分鐘，以確保細(xì)胞充分裂解。提取的DNA用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，要求DNA濃度不低于50ng/μL，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA的質(zhì)量滿足LAMP檢測(cè)的要求。若DNA濃度過低或純度不符合要求，可通過濃縮或進(jìn)一步純化等方法進(jìn)行處理，直至達(dá)到檢測(cè)要求。5.2實(shí)際檢測(cè)結(jié)果與分析運(yùn)用建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)采集的100份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，大腸桿菌陽性樣本有75份，陽性率為75%。在這些陽性樣本中，不同毒力因子的分布情況各異。腸毒素相關(guān)基因的檢出情況為：LT1基因陽性樣本有30份，占陽性樣本的40%；ST1基因陽性樣本有25份，占陽性樣本的33.3%；ST2基因陽性樣本有20份，占陽性樣本的26.7%。菌毛相關(guān)基因的檢出情況為：K88基因陽性樣本有15份，占陽性樣本的20%；K99基因陽性樣本有20份，占陽性樣本的26.7%；987P基因陽性樣本有10份，占陽性樣本的13.3%。毒力島相關(guān)基因的檢出情況為：HPI基因陽性樣本有25份，占陽性樣本的33.3%；ETT2基因陽性樣本有15份，占陽性樣本的20%；LEE基因陽性樣本有10份，占陽性樣本的13.3%。從不同毒力因子的分布來看，腸毒素相關(guān)基因的總體檢出率相對(duì)較高，這表明腸毒素在新生仔豬源大腸桿菌致病過程中可能起著較為關(guān)鍵的作用。其中，LT1基因的檢出率最高，這可能與該基因在大腸桿菌中的攜帶率較高，或者其在致病過程中的重要性有關(guān)。菌毛相關(guān)基因中，K99基因的檢出率相對(duì)較高，這可能與K99菌毛在仔豬小腸后段的黏附定植能力較強(qiáng)，從而更有利于大腸桿菌在腸道內(nèi)的感染和致病有關(guān)。毒力島相關(guān)基因中，HPI基因的檢出率較高，說明攜帶HPI毒力島的大腸桿菌在臨床樣本中較為常見，這可能是由于HPI毒力島攜帶的鐵攝取相關(guān)基因，使大腸桿菌能夠更好地在宿主體內(nèi)獲取鐵元素，增強(qiáng)了其生存和致病能力。進(jìn)一步分析不同毒力因子之間的組合情況發(fā)現(xiàn)，存在多種毒力因子同時(shí)攜帶的現(xiàn)象。例如，有10份樣本同時(shí)攜帶LT1、K99和HPI基因，占陽性樣本的13.3%；有8份樣本同時(shí)攜帶ST1、K88和ETT2基因，占陽性樣本的10.7%。這種多毒力因子共存的情況可能會(huì)增強(qiáng)大腸桿菌的致病性，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床癥狀。在實(shí)際養(yǎng)殖中，攜帶多種毒力因子的大腸桿菌感染仔豬后，可能會(huì)引發(fā)更為復(fù)雜和嚴(yán)重的腹瀉癥狀，不僅腹瀉程度加重，持續(xù)時(shí)間延長，還可能導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，增加仔豬的死亡率和治療難度。因此，了解毒力因子的分布和組合情況，對(duì)于深入研究新生仔豬源大腸桿菌的致病機(jī)制，制定針對(duì)性的防控措施具有重要意義。5.3與其他檢測(cè)方法的比較將本研究建立的LAMP檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、免疫血清學(xué)檢測(cè)、常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，從多個(gè)方面評(píng)估其優(yōu)勢(shì)與不足。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法是檢測(cè)大腸桿菌的經(jīng)典手段。其過程繁瑣，需要將臨床樣本接種到特定的培養(yǎng)基上，如麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基等，進(jìn)行細(xì)菌的分離和培養(yǎng)，一般需要24-48小時(shí)才能長出可見菌落。之后還需進(jìn)行一系列生化鑒定試驗(yàn)，如吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)等，以確定分離菌株是否為大腸桿菌，整個(gè)鑒定過程通常需要2-3天。這種方法對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，需要具備豐富的微生物學(xué)知識(shí)和操作經(jīng)驗(yàn)。而且，由于細(xì)菌培養(yǎng)過程中可能受到雜菌污染、樣本中病原菌含量過低等因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性受到一定限制。在實(shí)際檢測(cè)中，若樣本采集不當(dāng)或保存時(shí)間過長，可能會(huì)使大腸桿菌的活力下降，影響分離培養(yǎng)的成功率。相比之下，LAMP檢測(cè)方法操作相對(duì)簡單，整個(gè)檢測(cè)過程可在1-2小時(shí)內(nèi)完成，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。且LAMP技術(shù)直接針對(duì)大腸桿菌的毒力因子基因進(jìn)行檢測(cè)，不受樣本中其他雜菌的影響，特異性更高，能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)出攜帶特定毒力因子的大腸桿菌。免疫血清學(xué)檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）等，是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理來檢測(cè)樣本中的大腸桿菌或其毒力因子。這些方法具有操作相對(duì)簡便、可批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)結(jié)果易受多種因素的干擾。一方面，大腸桿菌的抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同血清型之間可能存在抗原交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。另一方面，免疫血清學(xué)檢測(cè)只能檢測(cè)樣本中是否存在相應(yīng)的抗原或抗體，無法確定大腸桿菌的毒力因子類型，對(duì)于疾病的診斷和防控指導(dǎo)意義有限。在一些養(yǎng)殖場(chǎng)中，使用ELISA方法檢測(cè)大腸桿菌感染時(shí)，由于存在抗原交叉反應(yīng)，出現(xiàn)了較高比例的假陽性結(jié)果，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來了不必要的困擾。而LAMP檢測(cè)方法通過特異性引物對(duì)毒力因子基因的擴(kuò)增，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出大腸桿菌的毒力因子，為疾病的診斷和防控提供更有價(jià)值的信息。常規(guī)PCR方法是一種廣泛應(yīng)用的核酸擴(kuò)增技術(shù)，它通過設(shè)計(jì)特異性引物，在DNA聚合酶的作用下，對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。與LAMP技術(shù)相比，常規(guī)PCR需要進(jìn)行復(fù)雜的溫度循環(huán)，一般包括變性、退火、延伸等多個(gè)步驟，整個(gè)反應(yīng)過程需要1-2小時(shí)，且需要使用昂貴的PCR儀。此外，常規(guī)PCR的靈敏度相對(duì)較低，對(duì)于低載量的大腸桿菌感染樣本，可能會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況。在本研究的靈敏性試驗(yàn)中，LAMP檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到最低拷貝數(shù)為10^1copies/μL的質(zhì)粒，而常規(guī)PCR方法能夠檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)為10^3copies/μL，LAMP技術(shù)的靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。同時(shí)，常規(guī)PCR的結(jié)果判斷需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，操作相對(duì)繁瑣，且存在氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而LAMP檢測(cè)方法不僅靈敏度高，且結(jié)果判斷直觀，可以通過觀察反應(yīng)管底部是否有白色沉淀產(chǎn)生或加入熒光染料后觀察熒光變化來判斷結(jié)果，無需復(fù)雜的電泳分析步驟，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，更適合在基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。六、討論6.1建立的LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)與不足本研究成功建立的新生仔豬源大腸桿菌不同毒力因子LAMP檢測(cè)方法，在多個(gè)方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。從特異性角度來看，該方法針對(duì)大腸桿菌不同毒力因子基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，這種獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)極大地提高了檢測(cè)的特異性。在特異性試驗(yàn)中，僅大腸桿菌不同毒力因子基因陽性對(duì)照菌株出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增條帶，而8株常見細(xì)菌陰性對(duì)照以及空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，這表明該方法能夠準(zhǔn)確地識(shí)別大腸桿菌的毒力因子基因，有效避免了與其他細(xì)菌的交叉反應(yīng)。相比傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法，其在鑒別大腸桿菌與其他細(xì)菌時(shí)，往往需要依賴多種生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)，操作繁瑣且容易受到雜菌污染等因素的干擾，而LAMP檢測(cè)方法憑借其高特異性，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出大腸桿菌的毒力因子，為疾病的診斷提供了有力的依據(jù)。在靈敏性方面，LAMP檢測(cè)方法同樣表現(xiàn)出色。通過對(duì)含有大腸桿菌不同毒力因子基因的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法能夠檢測(cè)到最低拷貝數(shù)為10^1copies/μL的質(zhì)粒，靈敏度比常規(guī)PCR方法高100倍。這意味著在實(shí)際檢測(cè)中，即使樣本中大腸桿菌的含量極低，毒力因子基因拷貝數(shù)很少，LAMP檢測(cè)方法也有較高的概率將其檢測(cè)出來，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)新生仔豬大腸桿菌病的早期診斷。早期診斷對(duì)于疾病的防控至關(guān)重要，能夠幫助養(yǎng)殖戶及時(shí)采取措施，如隔離病豬、對(duì)豬舍進(jìn)行消毒、調(diào)整飼養(yǎng)管理方式等，有效遏制疾病的傳播，降低仔豬的死亡率。操作簡便性也是LAMP檢測(cè)方法的一大突出優(yōu)勢(shì)。該方法不需要像常規(guī)PCR那樣進(jìn)行復(fù)雜的溫度循環(huán)，僅需一臺(tái)恒溫水浴鍋或恒溫箱即可滿足反應(yīng)所需的恒溫條件。在操作過程中，將各種試劑按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系混合后，放入恒溫設(shè)備中反應(yīng)即可，不需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行復(fù)雜的儀器操作。而且，其結(jié)果判斷也非常直觀，可以通過觀察反應(yīng)管底部是否有白色沉淀（焦磷酸鎂）產(chǎn)生來初步判斷結(jié)果，若加入SYBRGreenI熒光染料，還可通過觀察熒光變化進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果。這種簡單直觀的操作和結(jié)果判斷方式，使得LAMP檢測(cè)方法非常適合在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用。在一些偏遠(yuǎn)地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)，由于缺乏專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以實(shí)施，而LAMP檢測(cè)方法的出現(xiàn)，為這些養(yǎng)殖場(chǎng)提供了一種便捷的檢測(cè)手段，有助于提高疫病檢測(cè)的覆蓋率和及時(shí)性。然而，該LAMP檢測(cè)方法也存在一些不足之處。假陽性問題是LAMP檢測(cè)方法面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。由于LAMP技術(shù)靈敏度極高，一旦開蓋就容易形成氣溶膠污染，而目前國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室難以做到嚴(yán)格分區(qū)，這就增加了假陽性結(jié)果出現(xiàn)的概率。在實(shí)際操作中，如果實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在之前擴(kuò)增的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物形成的氣溶膠可能會(huì)污染新的反應(yīng)體系，導(dǎo)致即使樣本中沒有目標(biāo)基因，也出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。這不僅會(huì)誤導(dǎo)診斷，還可能導(dǎo)致不必要的防控措施的實(shí)施，增加養(yǎng)殖成本。為了減少假陽性問題，可采用濁度計(jì)等不開蓋檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，避免反應(yīng)管開蓋帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的清潔和消毒工作，定期更換實(shí)驗(yàn)耗材，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，也有助于降低氣溶膠污染的可能性。此外，LAMP技術(shù)在擴(kuò)增片段長度上存在一定限制。LAMP反應(yīng)通常適用于擴(kuò)增較短的核酸片段，一般在100-1000bp之間。對(duì)于一些較長的毒力因子基因片段，可能無法直接使用LAMP技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，或者擴(kuò)增效果不理想。這就限制了LAMP檢測(cè)方法在某些情況下的應(yīng)用。在研究某些毒力因子的全長基因序列時(shí)，LAMP技術(shù)可能無法滿足需求，需要結(jié)合其他技術(shù)如常規(guī)PCR、基因測(cè)序等進(jìn)行分析。而且，LAMP技術(shù)的引物設(shè)計(jì)要求較高，需要針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)的好壞直接影響到擴(kuò)增效果和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)于一些基因序列復(fù)雜或變異較大的毒力因子，設(shè)計(jì)出高效、特異的引物可能存在一定難度。在針對(duì)某些新型大腸桿菌毒力因子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于對(duì)其基因序列的了解有限，可能需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化。6.2影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素探討樣本質(zhì)量是影響LAMP檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一。臨床樣本的采集、保存和處理過程對(duì)樣本中核酸的完整性和純度有著關(guān)鍵影響。在采集過程中，如果采樣部位不準(zhǔn)確、采樣量不足或受到其他物質(zhì)的污染，都可能導(dǎo)致樣本中大腸桿菌及其毒力因子基因的含量過低或受到干擾，從而影響檢測(cè)結(jié)果。在采集仔豬糞便樣本時(shí)，若糞便中混有大量飼料殘?jiān)蚱渌s質(zhì)，可能會(huì)抑制LAMP反應(yīng)中酶的活性，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，樣本保存不當(dāng)也會(huì)使核酸發(fā)生降解，降低其完整性。如果樣本在運(yùn)輸或保存過程中未保持低溫，反復(fù)凍融，會(huì)導(dǎo)致核酸斷裂，影響LAMP檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。有研究表明，在高溫環(huán)境下保存的糞便樣本，其核酸降解率明顯增加，LAMP檢測(cè)的陽性率顯著降低。因此，在樣本采集時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范操作，確保采樣部位準(zhǔn)確、采樣量充足，并盡量避免樣本受到污染。在樣本保存和運(yùn)輸過程中，要采取有效的低溫保存措施，防止樣本反復(fù)凍融，以保證樣本質(zhì)量，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物設(shè)計(jì)的優(yōu)劣直接關(guān)系到LAMP檢測(cè)的特異性和靈敏性。引物需要特異性地識(shí)別靶基因的6個(gè)區(qū)域，若引物與靶基因序列的匹配度不高，存在錯(cuò)配或不互補(bǔ)的情況，就會(huì)導(dǎo)致引物無法與靶基因有效結(jié)合，從而無法啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果引物設(shè)計(jì)時(shí)，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)性不足，在LAMP反應(yīng)中，F(xiàn)IP引物就難以與模板結(jié)合，擴(kuò)增反應(yīng)無法正常進(jìn)行。此外，引物之間的相互作用也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。引物二聚體的形成會(huì)消耗反應(yīng)體系中的原料和酶，導(dǎo)致引物無法與靶基因結(jié)合，引發(fā)非特異性擴(kuò)增，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要充分考慮引物之間的互補(bǔ)性和空間結(jié)構(gòu)，避免引物二聚體的形成?？梢岳迷诰€引物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)引物進(jìn)行篩選和優(yōu)化，并通過BLAST比對(duì)等方法，驗(yàn)證引物的特異性，確保引物能夠準(zhǔn)確地識(shí)別靶基因，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。反應(yīng)條件的控制對(duì)LAMP檢測(cè)結(jié)果也有著重要影響。反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間是兩個(gè)關(guān)鍵因素。溫度過高或過低都會(huì)影響引物與模板的結(jié)合以及酶的活性。在前面的反應(yīng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中已表明，當(dāng)反應(yīng)溫度過高時(shí)，引物的特異性下降，容易與非靶序列結(jié)合，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；而溫度過低時(shí)，引物與模板的結(jié)合效率降低，BstDNA聚合酶的活性也受到抑制，擴(kuò)增反應(yīng)不完全，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。反應(yīng)時(shí)間過長或過短同樣會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)時(shí)間過長，可能會(huì)導(dǎo)致引物和酶的活性下降，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物積累，影響結(jié)果判斷；反應(yīng)時(shí)間過短，擴(kuò)增反應(yīng)未充分進(jìn)行，產(chǎn)物量不足，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，在進(jìn)行LAMP檢測(cè)時(shí)，必須嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行操作，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)操作過程中的誤差也可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。移液器的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，如果移液器的吸液量不準(zhǔn)確，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系中各種試劑的比例失調(diào)，從而影響擴(kuò)增效果。若移液器吸取的BstDNA聚合酶量不足，會(huì)使擴(kuò)增反應(yīng)速度減慢，產(chǎn)物量減少，甚至無法擴(kuò)增，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，操作過程中的交叉污染也是一個(gè)不容忽視的問題。如果在加樣過程中，移液器的槍頭未及時(shí)更換，或者實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、儀器設(shè)備未進(jìn)行嚴(yán)格的清潔和消毒，都可能導(dǎo)致不同樣本之間的交叉污染，使原本陰性的樣本出現(xiàn)假陽性結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，要使用經(jīng)過校準(zhǔn)的移液器，確保吸液量準(zhǔn)確無誤。同時(shí)，要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，做到一人一槍頭，避免交叉污染。實(shí)驗(yàn)前后，要對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和儀器設(shè)備進(jìn)行徹底的清潔和消毒，減少污染的可能性，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。6.3該檢測(cè)方法在養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)LAMP檢測(cè)方法在養(yǎng)豬業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。在豬場(chǎng)疾病監(jiān)測(cè)方面，其快速、準(zhǔn)確的特性能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)新生仔豬源大腸桿菌的感染情況以及毒力因子類型。通過定期對(duì)仔豬糞便、小腸內(nèi)容物或小腸黏膜等樣本進(jìn)行檢測(cè)，可以實(shí)時(shí)掌握豬場(chǎng)內(nèi)大腸桿菌的流行態(tài)勢(shì)。這有助于養(yǎng)豬場(chǎng)及時(shí)采取針對(duì)性的防控措施，如對(duì)感染豬只進(jìn)行隔離治療，對(duì)豬舍進(jìn)行全面消毒，調(diào)整飼料配方以增強(qiáng)仔豬免疫力等，從而有效降低疾病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，保障豬群的健康生長。從疫病防控的角度來看，LAMP檢測(cè)方法可用于養(yǎng)豬場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查。通過對(duì)不同