C00/O9團體標T/CACM010.32016中藥分子鑒定通則第3部分:中藥材種子種苗Molecullaridentificationoftraditionalchinesemedicinepart3:seedandseedlingofchinesemedicinalmaterials2016-12-02發(fā)布2016-12-02實施前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語、定義 14方案選擇要求 25儀器設(shè)備 26試劑、溶液配制 27檢驗程序 28結(jié)果分析和表示 39結(jié)果報告 310質(zhì)量保證 411廢棄物處理 4本標準為中藥分子鑒定通則系列標準之一,其目前包括以下標準:T/CACM010.1—2016《中藥分子鑒定通則第1部分:中藥材與中藥飲片》T/CACM010.2—2016《中藥分子鑒定通則第2部分:中藥提取物與中成藥》T/CACM010.3—2016《中藥分子鑒定通則第3部分:中藥材種子種苗》本標準的全部技術(shù)內(nèi)容為推薦性。本標準在遵從《中華人民共和國藥典》的基礎(chǔ)上,提出了《中藥分子鑒定標準通則》。本標準由中華中醫(yī)藥學(xué)會歸口。本標準起草單位:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、中國食品藥品檢定研究院、國藥種業(yè)有限公司。本標準主要起草人:黃璐琦、袁媛、馬雙成、蔣超、魏鋒、張文娟、鄭健、趙玉洋、周駿輝、何雅莉、王繼永。玉1中藥分子鑒定通則第3部分:中藥材種子種苗本標準規(guī)定了使用分子生物學(xué)手段鑒定中藥材種子種苗的通用方法和要求。本標準適用于中藥材種子種苗鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件?！吨腥A人民共和國藥典》GB/T6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》GB/T23632—2009《進境植物檢疫截獲有害生物鑒定復(fù)核規(guī)程》GB/T27403—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測》GB/T3543.1—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程總則》GB/T3543.5—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定》3術(shù)語、定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。從樣品中提取出DNA的方法。通過一定技術(shù)使一段特定的DNA片段拷貝數(shù)增加的過程,可通過聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)或其他DNA擴增技術(shù)實現(xiàn)。聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction簡稱PCR技術(shù)。模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補序列發(fā)生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數(shù)呈幾何倍數(shù)增長。其擴增產(chǎn)物可通過多種特異性和敏感性好的方法進行檢測。一般使用對照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程,用于證明鑒定過程可獲得目標核酸片段的操作。使用常見混淆樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程。以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程,用以證明提取過程中沒有核酸污染。2對照樣品standardsample包括對照藥材和種子種苗對照樣品。種子種苗對照樣品指由中藥材種子種苗標準起草單位提交,經(jīng)全國中藥材種子(種苗)標準化技術(shù)委員會認定并保存,與品種名稱相符的種子種苗樣品。種子種苗品種真實性seedandseedlingvarietygenuineness送檢樣品與該品種文件標注的對照樣品相符。4方案選擇要求中藥材種子種苗分子鑒定應(yīng)采用抽取有代表性的送檢樣品與對照樣品比較的驗證方式,檢測結(jié)果以規(guī)定數(shù)目引物的DNA位點差異數(shù)目表示。使用SSR或SNP標記法進行檢測,并根據(jù)檢測目的不同要求,選擇適宜的檢測方案。每次鑒定實驗均應(yīng)包含陽性對照、陰性對照和空白對照。5儀器設(shè)備所有制備樣品使用的器具在使用前應(yīng)滅菌處理。根據(jù)方案,寫出標準中需要說明的儀器設(shè)備。6試劑、溶液配制試劑配制所用水應(yīng)符合GB/T6682—2008規(guī)定的一級水要求。試劑應(yīng)為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的保存應(yīng)有防污染措施。試劑配制操作應(yīng)在單獨的制備區(qū)進行。所配制的溶液均須高壓滅菌保存,不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)使用超濾設(shè)備(孔徑0.22滋m)除菌。應(yīng)記述鑒別引物的名稱和序列、合成引物質(zhì)量要求、純化方式等。無特殊說明時,所有的酶應(yīng)在-20益保存,使用時應(yīng)在冰上操作。7檢驗程序7.1檢查注意事項根據(jù)檢測目的不同要求,選擇適宜的DNA提取、擴增和檢測程序。為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增和產(chǎn)物檢測應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進行,進入各區(qū)域應(yīng)嚴格按照單一方向進行,即樣品制備區(qū)寅核酸制備區(qū)寅擴增區(qū)寅檢測區(qū)。取樣應(yīng)在樣品制備區(qū)進行。送檢樣品、試樣的抽取、分取應(yīng)有代表性。應(yīng)根據(jù)送檢樣品的不同要求,確定樣品的數(shù)量或重量。在生產(chǎn)基地取樣,送檢樣品可以為組織或器官;在加工或銷售地點取樣,送檢樣品為種子或種苗。7.3粉碎粉碎應(yīng)在樣品制備區(qū)進行。取送檢樣品置乳缽、組織勻漿機或球磨粉碎儀中充分研磨,必要時加適量液氮研磨。進行樣品前處理時應(yīng)有預(yù)防交叉污染的措施,以避免送檢樣品交叉污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。DNA提取應(yīng)在核酸制備區(qū)進行。應(yīng)根據(jù)送檢樣品特性選擇合適的DNA提取方法或用等效DNA提取試劑盒進行DNA提取,所提取的DNA應(yīng)符合擴增的要求,模板DNA必要時可進行適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。7.5核酸擴增擴增應(yīng)在擴增區(qū)進行。核酸擴增反應(yīng)體系總體積可依據(jù)中藥材種子種苗種類及其所使用方法確定。應(yīng)根據(jù)核酸擴增儀型號、酶、引物等選擇適宜的反應(yīng)程序。擴增產(chǎn)物于4益保存。應(yīng)記述鑒別引物的預(yù)期擴增片段長度范圍、條帶數(shù)目等信息。7.6擴增產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物檢測應(yīng)在檢測區(qū)進行。根據(jù)檢測方案,選擇合適的擴增產(chǎn)物檢測方法,包括瓊脂糖凝膠3電泳、聚丙烯胺凝膠電泳、核酸序列測定、熒光檢測等。8結(jié)果分析和表示8.1物種鑒定8.1.1特異性PCR在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果均符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品出現(xiàn)預(yù)期數(shù)目和大小的特征條帶,則判定測試結(jié)果為陽性;若送檢樣品未出現(xiàn)預(yù)期數(shù)目和大小的特征條帶,則判定為陰性。8.1.1.2熒光檢測法在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果均符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品與陽性對照一致,則判定測試結(jié)果為陽性,否則為陰性。8.1.2核酸序列測定和分析擴增產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)純化、濃縮后使用DNA測序儀雙向測序,將拼接獲得序列與陽性對照序列進行比對,依據(jù)二者序列相似度和譜系關(guān)系原則判定。8.1.3其他方法應(yīng)根據(jù)選擇方法的技術(shù)原理要求和品種實際需求建立結(jié)果分析和表示方法。8.2種質(zhì)、品系或品種鑒定檢驗結(jié)果采用比較送檢樣品和標準樣品位點的差異數(shù)目表示。統(tǒng)計位點差異記錄的結(jié)果,計算比較位點數(shù)、差異位點數(shù)及差異位點。位點差異記錄分為下列三種情形:位點存在差異的或完全相同的,記錄為有差異或無差異;位點數(shù)據(jù)缺失的,記錄為缺失;位點顯示無法判定的,記錄為無法判定。9結(jié)果報告9.1一般要求對物種真實性定性檢測結(jié)果應(yīng)表示為陽性“+冶或陰性“-冶;定量檢測結(jié)果應(yīng)符合具體品種分子鑒別標準。對種質(zhì)、品系或品種的檢驗結(jié)果可按送檢樣品與標準樣品間差異位點數(shù)判斷,當(dāng)樣品間差異位點數(shù)逸2,則判定為“不同冶;當(dāng)樣品間差異位點數(shù)=1,判定為“近似冶;當(dāng)樣品間差異位點數(shù)=0,判定為“極近似或相同冶。9.2鑒定報告樣品經(jīng)檢測后,根據(jù)具體操作程序和結(jié)果做好詳細的實驗記錄,出具檢測報告。檢測報告至少包含以下內(nèi)容:送檢樣品的名稱、狀態(tài)和明確的標識;檢測依據(jù);取樣方法與日期;儲存條件;檢測開始和結(jié)束日期;檢測負責(zé)人和實驗人員;陽性對照、陰性對照、送檢樣品;特定方法取得的結(jié)果,結(jié)果使用的單位及計算方法;檢測結(jié)論;檢測過程觀察到的特別情況;其它需要報告的內(nèi)容。410質(zhì)量保證檢測結(jié)果應(yīng)來自兩份送檢樣品。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為